Выявление лимитирующего фактора в восстановлении йоднитротетразолия хлорида суспензией клеток бактерий в физиологическом растворе Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ И ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ / PHYSICAL-CHEMICAL AND GENERAL BIOLOGY Оригинальная статья / Original article УДК 620.193.81

DOI: http://dx.doi.org/10.21285/2227-2925-2018-8-3-61 -69

ВЫЯВЛЕНИЕ ЛИМИТИРУЮЩЕГО ФАКТОРА В ВОССТАНОВЛЕНИИ ЙОДНИТРОТЕТРАЗОЛИЯ ХЛОРИДА СУСПЕНЗИЕЙ КЛЕТОК БАКТЕРИЙ В ФИЗИОЛОГИЧЕСКОМ РАСТВОРЕ

© А.А. Калинина, А.С. Македошин, С.Ю. Радостин, Т.Н. Соколова, Е.П. Комова, В.Р. Карташов

Нижегородский государственный технический университет им. Р. Е. Алексеева, 603950, Российская Федерация, г. Нижний Новгород, ул. К. Минина, д. 24, ГСП-41

Цель работы - выявление роли диффузии в бактериальном восстановлении йоднитротетразолия хлорида (ИНТ), используя методы химической кинетики. В экологических исследованиях через интенсивность восстановления солей тетразолия оценивается в целом жизнеспособность микроорганизмов и их сообществ. В частности, за индикатор коррозионной активности бактерий можно было бы принять соли тетразолия. Однако, как известно, через восстановление солей тетразолия регистрируется отклик не всего микробного сообщества, а только его части, способной активно восстанавливать соль тетразолия. Выяснение причин широкого диапазона восстановительной способности микроорганизмов по отношению к солям тетразолия позволит повысить объективность результатов экологических, других исследований, в том числе изучения коррозионной активности бактерий-органотрофов. Определены кинетические параметры восстановления ИНТ суспензией бактерий Clostridium spp., Proteus vulgaris, Escherichia coli. На основании значений предэкспоненциального множителя уравнения Аррениуса сделано предположение о диффузионно-контролируемом характере реакции. Ключевые слова: бактерии, йодмоноформазаны, соли тетразолия, эффективная константа скорости реакции, параметры активации, диффузионный контроль.

Формат цитирования. Калинина А.А., Македошин А.С., Радостин С.Ю., Соколова Т.Н., Комова Е.П., Карташов В.Р. Выявление лимитирующего фактора в восстановлении йоднитротетразолия хлорида суспензией клеток бактерий в физиологическом растворе // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2018. Т. 8, N 3. С. 61-69. DOI: 10.21285/2227-2925-2018-8-3-61-69

IDENTIFICATION OF A LIMITING FACTOR IN THE REDUCTION OF IODONITROTETRAOLIUM CHLORIDE BY A BACTERIAL CELL SUSPENSION IN A PHYSIOLOGICAL SOLUTION

© A.A. Kalinina, A.S. Makedoshin, S.Y. Radostin, T.N. Sokolova, E.P. Komova, V.R. Kartashov

Nizhny Novgorod State Technical University n. a. R.E. Alekseev, 24, Minin St, Nizhny Novgorod, 603950, Russian Federation

In this work, we set out to investigate the role of diffusion in the microbial reduction of iodonitrotetraolium chloride (INT) using the methods of chemical kinetics. In environmental studies, re-searchers use the intensity of tetrazolium salt reduction to evaluate an overall viability of microorganisms and their communities. In particular, tetrazolium salts could be used as an indicator of the corrosive activity of bacteria. However, it is known that the reduction of tetrazolium salts can only register the response of those microbial community parts that are capable of actively reducing these substances. Therefore, research into the causes of a wide-range reduction ability of microorganisms towards tetrazolium salts can improve the objectivity of environmental and other studies, including the study of the corrosion activity of organotrophic bacteria. The kinetic parameters of INT reduction by Clostridium spp., Proteus vulgaris and Escherichia coli suspensions have been determined. On the basis of the values of the pre-exponential factor in the Arrhenius equation, an assumption is made that the reaction is characterized by a diffusion-controlled character.

Keywords: iron, hydrogen peroxide, Fenton reaction, oxywater, oxene, pyridoxine

For citation. Kalinina A.A., Makedoshin A.S., Radostin S.Y., Sokolova T.N., Komova E.P., Kartashov V.R.

Identification of a limiting factor in the reduction ofiodonitrotetraolium chloride by a bacterial cell suspension in a physiological solution. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya I Biotekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2018, vol. 8, no. 3, pp.61-69. (In Russian). DOI: 10.21285/2227-29252018-8-3-61-69

ВВЕДЕНИЕ

Перспективность использования солей тетразолия в биологических и смежных областях, основанную на их способности к восстановлению с раскрытием цикла и образованием окрашенных формазанов, впервые показали Р. Кун и Д. Ерхель [1]. В настоящее время соли тетразолия широко применяют как акцепторы электронов в дегидрогеназных окислительно-восстановительных процессах для определения жизнеспособности клеток и оценки их дыхательной активности в гистохимии, экологии, океанологии, микробиологии, цитологии, биохимии [2-6].

Круг используемых в исследованиях солей тетразолия достаточно широк, однако, по ряду причин, к числу наиболее применяемых следует отнести йоднитротетразолия хлорид (2-(4-йод-фенил)-3-(4-нитрофенил)-5-фенил-2H-тетразолия хлорид, ИНТ) [6, 7]. Предпочтительность ИНТ обусловлена одноступенчатым характером восстановления без образования продуктов полувосстановления и возможностью количественной оценки восстановления за счет относительно легкого извлечения йодмонофор-мазана (ИМФ) из клетки [8].

Однозначно установлено, что восстановление солей тетразолия протекает внутрикле-точно в так называемых сайтах восстановления, локализованных в мембранах клетки бактерии со стороны цитозольной части [9]. Высокую скорость диффузии солей тетразолия в клетку бактерий, по мнению авторов работ [10-12], определяют такие факторы, как относительно малый размер молекул, полярность, субстан-тивность к компонентам клеточной стенки и плазмалеммы.

Механизм восстановления солей тетразо-лия детально изучался в дыхательной цепи неповрежденных клеток и обратных мембранных везикулах штамма бактерии E. Coli K-12 с применением ингибиторов и разобщителей цепи переноса электронов [13]. Установлено, что сайтами восстановления солей тетразолия являются дегидрогеназные комплексы электронотранс-портной системы клетки - сукцинатдегидроге-наза и НАДН-дегидрогеназа, а также промежуточные переносчики электронов хиноновой природы. В ряде работ установлена зависимость восстановления соли тетразолия от концентрации в питательной среде исходных субстратов дегидрогеназных комплексов [8]. Так, обогащение питательной среды глюкозой, другими субстратами дегидрогеназ (сукцинатом, НАДН, лак-татом, глицеро-3-фосфатом) сопровождалось усилением восстановления солей тетразолия.

Однако на восстановление солей тетразолия не в меньшей степени, чем клеточная организация электронотранспортных процессов, должна влиять диффузия ИНТ из объема внеклеточной среды в цитозольную часть клетки. Косвенным подтверждением этого являются результаты работы [14], в которой выявлена жизнеспособность клеток бактерий Pseudomonas fluorescens TY13 при отсутствии восстановления 5-циано-2,3-дитолилтетразолия хлорида. Хотя в работах [5, 6, 9] содержится информация о диффузии солей тетразолия в клетки бактерий, надежных доказательств роли этого явления в восстановлении солей тетразолия представлено недостаточно.

В связи с чем целью работы явилось выявление роли диффузии в бактериальном восстановлении ИНТ, используя методы химической кинетики.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве тест-культур использовали музейные штаммы бактерий Pseudomonas aeruginosa, Clostridium spp., Proteus vulgaris (Всероссийская коллекция микроорганизмов, г. Пущино Московской обл.) и Escherichia coli М-17, выделенную из препарата «БИФИКОЛ» (ФГУП НПО «Микроген»).

Методика проведения кинетического эксперимента. Смыв суточной бактериальной культуры со скошенного мясопептонного агара (мпА) физиологическим раствором (0,9% водный раствор хлорида натрия) доводили до оптической плотности 0,45 ± 0,05 (670 нм). К 32 мл бактериальной суспензии в стерильных условиях добавляли 2 мл 1,0 Мм водного раствора соли йоднитротетразолия и смесь выдерживали в термостате при температуре эксперимента. По истечении определённого времени 5 мл анализируемой смеси отбирали в пробирку, содержащую 0,1 мл раствора лизоцима (концентрация 0,2 мг/л). Через 30 с смесь экстрагировали этилацетатом. К экстракту добавляли 0,1 мл 10% раствора гидроксида натрия, по истечении 20 с сушили хлоридом кальция, после фильтрования анализировали спектрофотометрически при длине волны 490 нм, характерной для продукта восстановления - йодмоноформаза-на. Коэффициент экстинкции определяли по калибровочному графику. Его величина, равная 1,9-104 л •моль-1 •см-1, согласуется с литературными данными [12].

Текущие концентрации ИМФ определяли по результатам 10-12 независимых экспериментов, среднеквадратичная ошибка определения 10-15%. Йоднитротетразолий (95%, Aldrich),

йодмоноформазан (crystalline, Sigma), лизоцим (препарат «Лизобакт» Bosnalijek) использовали в виде коммерческих препаратов. Спектры регистрировали на спектрофотометре «2802 UV/Vis Unico». Инкубацию культур бактерий и соответствующие исследования с применением этих

культур проводили в термостате марки «ТС-1/80 СПУ».

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Восстановление ИНТ протекает по реакции [12].

n-NÜ2C6H4

\ N

N \

c,7^n

n-IC6H4

C6H5 + D,

'red

+H2O

(I)

n-NO2C6H4

\

HN

n-IC6H4

/ N

Ч + Dox2+ + CI + OH

C6H5

(II)

где D - донор электронов биогенной природы соответственно в восстановленной (Dred) и окисленной (Dox) формах.

Ранее были представлены кинетические кривые накопления ИМФ при восстановлении ИНТ бактериями Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Clostridium spp., Proteus vulgaris [15]. Было установлено, что характер кинетических кривых зависит от вида бактерии [15].

Для уточнения механизма восстановления ИНТ изучили влияние на скорость реакции температуры, в том числе при использовании суспензии бактерий Escherichia coli, кинетика восстановления ИНТ под действием которой ранее не изучалась.

Восстановление ИНТ Clostridium spp. При оптимальных для жизнедеятельности этой бактерии температурах выявило отсутствие температурной зависимости скорости процесса (рис. 1).

6

л

154 л о

0

©

о

Константы скорости рассчитывали по уравнению реакции первого порядка:

, 1,0) ИНТ

k = -ln —-,

t С инт

где текущую концентрацию ИНТ определяли по разности между начальной концентрацией ИНТ и текущей концентрацией продукта:

1

к = -ln-

С,

) ИНТ

) ИНТ

-ИМФ

В табл. 1 представлены кинетические данные, из которых видно, что несмотря на сложный объект изучения, каковой является бактерия, в пределах ошибки константа скорости сохраняет свое значение до высокой степени конверсии (и 68%).

—I-1-1—

6 8 10 t 10-3, с

12

5

1

0

0

2

Рис. 1. Кинетическая кривая накопления иодформазана под воздействием Clostridium spp. (Со инт = 5,8810'5 моль/л; t = 37 °C)

Fig. 1. Kinetic curve of iodoformazan accumulation under the influence of Clostridium spp. ((C0 ,nt = 5,88-10'5 mol/L; t = 37 °C)

Таблица 1

Константы скорости восстановления йоднитротетразолия хлорида бактериями Clostridium

spp. (С0 ИНТ = 5,881С-5 моль/л; t = 37 °C)

Table 1

The rate constants of iodonitrotetrazolium chloride recovery by bacteria Clostridium spp. (C0 int = 5,88 10-5 mol/L; t = 37 °C)

5 СИМФ• 10 , моль/л М0"3, c k 104, с-1

1,13 0,61 3,49

2,12 0,93 4,81

2,61 1,20 4,89

3,53 2,14 4,29

4,05 2,17 4,32

Kod=(4,36±0,39)1 0-4 с-1

Дифференцирование кинетической кривой приводит к удовлетворительной линейной зависимости в координатах V=f(СИМФ)(рис. 2).

Среднее значение эффективной константы скорости при t = 37 °С, рассчитанной по параметрам линейной зависимости, представленной на

4 1

рис. 2, составляет 4,710- с-

с k

■эф,

что удовлетвори-определенной инте-

тельно согласуется тральным методом.

В табл. 2 указаны активационные парамет ры, рассчитанные по уравнению Аррениуса.

л о

2,8 2,6 2,4 2,2

2

1,8 1,6 1,4 1,2

Симф'105, моль/л

1

0

1

2

3

4

Рис. 2. Зависимость скорости восстановления ИНТ бактерией Clostridium spp. От концентрации йодмоноформазана (С0 ИНТ = 5,881С-5 моль/л; t = 37 °C) (y = -4,9110-4x + 2,68-1СГ8, R2 = 0,9966)

Fig. 2. Rate of INT recovery by the bacterium Clostridium spp. Versus concentration of iodomonoformazane (C0 int = 5,88 10-5 mol/L; t = 37 °C) (y = -4,9110-4x + 2,68-1ff8, R2 = 0,9966)

Таблица 2

Активационные параметры восстановления йоднитротетразолия

хлорида бактериями

Table 2

Activation recovery options of iodonitrotetrazolium chloride by bacteria

Бактерия Т, К k-104, с-1 А-104, с"1 Еэф, кДж/моль

Clostridium spp. 304,0 307,0 310,0 4,50±0,41 4,50 и 0

Proteus vulgaris 307,0 310,0 313,0 0,25±0,02 0,25 и 0

k-109, моль-л^-с"1 "1 "1 А, моль-л" •с"

Escherichia coli 303,0 310,0 314,6 3,62±0,36 5,99±0,59 9,12±0,73 123 62,5

В работе [15] показали, что бактерия Proteus vulgaris обладает очень низкой восстановительной способностью к ИНТ. Степень конверсии реагента на протяжении всего эксперимента (около двух часов экспозиции) не превысила 20%. Для сравнения бактерия Clostridium spp. Уже через один час экспозиции восстанавливает ИНТ на 70%. Использование масштаба, удобного для представления экспериментальных данных для бактерии Proteus vulgaris, показал ошибочность ранее сделанного вывода о независимости скорости

реакции от концентрации реагента [15].

Как видно из рис. 3, кинетическая кривая по накоплению ИМФ носит монотонно возрастающий характер, причем в температурном интервале, оптимальном для жизнедеятельности бактерии, наблюдали отсутствие зависимости скорости восстановления ИНТ от температуры (рис. 3). Поскольку скорость восстановления ИНТ незначительна, то константу скорости, равную 2,510-5 с-1, определили дифференцированием кинетической кривой по известному методу [16] (табл. 2).

°'5 "I

М0, c

Рис. 3. Кинетическая кривая накопления иодформазана под воздействием бактерий Proteus vulgaris (со инт = 8,4910'5 моль/л; Ш - t = 34 °С; ♦ - f = 37 °С; -t = 40 °С)

Fig. 3. Kinetic curve of iodoformazan accumulation under the influence of bacteria Proteus vulgaris (Co int = 8,49.10 s mol/L; ■ f = 34 °C; ♦ f = 37 °C; t = 40 °C)

C105 моль/л

2 --

1--

t 10-3 , c

3

6

4

2

Рис. 4. Кинетические кривые восстановления йоднитротетразолия хлорида суспензией бактерий Escherichia coli (Со инт = 5,88'10-5 моль/л; • - t = 30 °C; □ - t = 37 °C; А - t = 41,6 °C)

Fig. 4. Kinetic curves for the reduction of iodnitrotetrazolium chloride

suspension of bacteria Escherichia coli (Co int = 5,88.10-5 mol/L; • - т = 30 °C; □ - Т = 37 °C; А - т = 41,6 °C)

На кинетических кривых восстановления ИНТ суспензией бактерий Escherichia coli можно выделить достаточно продолжительный линейный участок (рис. 4). Если в случае Clostridium spp. Линейный участок на кинетической кривой завершался спустя » 30 мин (степень конверсии »60%), то в случае бактерии Escherichia coli линейный характер кинетической кривой сохраняется в течение » 1,5 ч при 30 °С, при этом степень конверсии ИНТ не превышает 30% (рис. 4).

Учитывая чувствительность биологического объекта к времени экспозиции в физиологическом растворе, полные кинетические кривые до высоких степеней конверсии получить не удалось. В табл. 2 представлены эффективные константы скорости, рассчитанные по линейному участку кинетических кривых дифференциальным методом до степени конверсии 30-50%.

Константы скорости зависят от температуры, хотя энергия активации, определенная по уравнению Аррениуса, невелика (табл. 2).

Таким образом, используя математический аппарат химической кинетики, установили, что в диапазоне температур, оптимальных для жизнедеятельности Clostridiums pp. И Proteus vulgaris, восстановление ИНТ протекало безактивационно (табл. 2, рис. 1 и 3), в то время как бактерии Escherichia coli восстанавливали ИНТ с энергией активации, равной 62,5 кДж/моль.

Следует особо отметить низкое значение предэкспоненциального множителя (табл. 2).

Параметры уравнения Аррениуса, прежде всего значение предэкспоненциального множителя, позволяют сделать предположение о диффузи-онноконтролируемом восстановлении ИНТ. Соль тетразолия из объемной фазы физисорбируется на клеточной стенке бактерий, затем на плазма-лемме и медленно диффундирует в границах липидной плазматической мембраны к участкам, где находятся доноры электронов. Такое представление процесса согласуется, например, с выводами работы [9]. Так как доноры электронов по своей природе радикалы (флавиновый радикал кофермента сукцинатдегидрогеназы, семихиноны), химическая реакция ИНТ с донором электронов должна протекать чрезвычайно быстро. Являясь диффузионноконтролируемым процессом, восстановление ИНТ суспензией бактерий усложняет оценку дыхательной активности бактерий и их жизнеспособности через процесс восстановления ИНТ. Этот дополнительный фактор необходимо, на наш взгляд, учитывать при планировании биологических экспериментов с использованием солей тетразолия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Определены активационные параметры уравнения Аррениуса восстановления ИНТ суспензией в физиологическом растворе бактерий Escherichia coli, Clostridium spp. И Proteus vulgaris в оптимальном для жизнедеятельности бактерий температурном диапазоне. На

основании малых значений предэкспоненциаль-ного множителя уравнения Аррениуса сделано

предположение о роли диффузии ИНТ в клетки, лимитирующей восстановление ИНТ.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК

1. Kuhn R., Jerchel D. Reduktion von Tetra-zoliumsalzen durch Bakterien, gärende Hefe und keimende Samen // Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft. 1941. V. 74, N 6. P. 949-952. DOI: 10.1002/cber.19410740615

2. Bhupathirajua V.K., Hernandezb M., Land-feara D., Alvarez-Cohen L. Application of a te-trazolium dye as an indicator of viability in anaerobic bacteria // Journal of Microbiological Methods. 1999. V. 37, N 3. P. 231-243.

3. Fonseca A.C., Summers R.S., Hernandez M.T. Comparative measurements of microbial activity in drinking water biofilters // Water Research. 2001. V. 35, N 16. P. 3817-3824. DOI: 10.1016/S0043-1354(01)00104-X

4. Relexans J.C. Measurement of the respiratory electron transport system (ETS) activity in marine sediments: state-of-the-art and interpretation. II. Significance of ETS activity data // Marine Ecology Progress Series. 1996. V. 136. P. 289-301. DOI: 10.3354/meps136289

5. Rodriguez G.G. Use of a fluorescent redox probe for direct visualization of actively respiring bacteria // Applied Environmental Microbiology. 1992. V. 58, N 6. P. 1801-1808.

6. Sabaeifard P., Abdi-Ali A., Reza Soudi M., Dinarvand K. Optimization of tetrazolium salt assay for Pseudomonas aeruginosa biofilm using microtiter plate method // Journal of Microbiological Methods. 2014. V. 105. P. 134-140.

7. Zimmermann R., Iturriaga R., Becker-Birck J. Simultaneous determination of the total number of aquatic bacteria and the number thereof involved in respiration // Applied Environmental Microbiology. 1978. V. 36, N 6. P. 926-935.

8. Altman F.P. Tetrazolium salts and forma-zans. Gustav Fisher Verlag. Stuttgart, 1976. 51 p.

9. Thorm S. M., Horobin R.W., Seidler E., Barer

M.R. Factors affecting the selection and use of tetrazolium salts as cytochemical indicators of microbial viability and activity // Journal of Applied Bacteriology. 1993. V. 74, N 4. P. 433-443. DOI: 10.1111/j.1365-2672.1993.tb05151 .x

10. Horobin R. W. Selection of optimum te-trazolium salts for use in histochemistry: the value of structurestaining correlations // The Histochemi-cal Journal. 1982. V. 14, N 2. P. 301-310. DOI: 10.1007/BF01041222

11. Chieco P. Improvement in soluble dehydrogenase histochemistry by nitroblue tetrazolium preuptake in sections: a qualitative and quantitative study // Stain Technology. 1984. V. 59, N 4. P. 201-211. DOI: 10.3109/10520298409113857

12. Seidler E. The Tetrazolium-Fonnazan System: Design and Histochemistry. New York: G. Fischer. Stuttgart, 1991. 79 p.

13. Smith J.J., McFeters G.A. Mechanisms of INT (2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl te-trazolium chloride), and CTC (5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride) reduction in Escherichia coli K-12 // Journal of Microbiological Methods. 1997. V. 29, N 3. P. 161-175.

14. Hatzinger P.B., Palmer Р., Smith R.L., Penarrieta C.T., Yoshinari T. Applicability of t e-trazolium salts for the measurement of respiratory activity and viability of groundwater bacteria // Journal of Microbiological Methods. 2003. V. 52, N 1. P. 47-58.

15. Радостин С.Ю., Калинина А.А., Маке-дошин А.С., Соколова Т.Н., Кузина О.В., Кар-ташов В.Р. Восстановление йоднитротетразо-лия клетками бактерий как метод оценки их коррозионной активности // Коррозия: материалы, защита. 2015. N 11. С. 45-48.

16. Дикерсон Р., Грей Г., Хейт Дж. Основные законы химии. М.: Мир, 1982. 652 с.

REFERENCES

1. Kuhn R., Jerchel D. Reduktion von Tetra-zoliumsalzen durch Bakterien, gärende Hefe und keimende Samen. Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft. 1941, vol. 74, no. 6, pp. 949952. DOI: 10.1002/cber.19410740615

2. Bhupathirajua V.K., Hernandezb M., Land-feara D., Alvarez-Cohen L. Application of a tetrazolium dye as an indicator of viability in anaerobic bacteria. Journal of Microbiological Methods. 1999, vol. 37, no. 3, pp. 231-243.

3. Fonseca A.C., Summers R.S., Hernandez M.T. Comparative measurements of microbial activity in drinking water biofilters. Water Research. 2001, vol. 35, no. 16, pp. 3817-3824. DOI: 10.1016/S0043-1354(01)00104-X

4. Relexans J.C. Measurement of the respiratory electron transport system (ETS) activity in ma-

rine sediments: state-of-the-art and interpretation. II. Significance of ETS activity data. Marine Ecology Progress Series. 1996, vol. 136, pp. 289-301. DOI: 10.3354/meps136289

5. Rodriguez G.G. Use of a fluorescent redox probe for direct visualization of actively respiring bacteria. Applied Environmental Microbiology. 1992, vol. 58, no. 6. Pp. 1801-1808.

6. Sabaeifard P., Abdi-Ali A., Reza Soudi M., Dinarvand K. Optimization of tetrazolium salt assay for Pseudomonas aeruginosa biofilm using microtiter plate method. Journal of Microbiological Methods. 2014, vol. 105, pp. 134-140.

7. Zimmermann R., Iturriaga R., Becker-Birck J. Simultaneous determination of the total number of aquatic bacteria and the number thereof involved in respiration. Applied Environmental Microbiology.

1978, vol. 36, no. 6. Pp. 926-935.

8. Altman F.P. Tetrazolium salts and forma-zans. Gustav Fisher Verlag. Stuttgart, 1976, 51 p.

9. Thorm S. M., Horobin R.W., Seidler E., Barer M.R. Factors affecting the selection and use of tetrazolium salts as cytochemical indicators of microbial viability and activity. Journal of Applied Bacteriology. 1993, vol. 74, no. 4. Pp. 433-443. DOI: 10.1111/j.1365-2672.1993.tb05151.x

10. Horobin R.W. Selection of optimum te-trazolium salts for use in histochemistry: the value of structurestaining correlations. The Histochemi-cal Journal. 1982, vol. 14, no. 2. Pp. 301-310. DOI: 10.1007/BF01041222

11. Chieco P. Improvement in soluble dehydrogenase histochemistry by nitroblue tetrazolium preuptake in sections: a qualitative and quantitative study. Stain Technology. 1984, vol. 59, no. 4. Pp. 201-211. DOI: 10.3109/10520298409113857 12. Seidler E. The Tetrazolium-Fonnazan System: Design and Histochemistry. E. Seidler - ISBN 3-437-11366-6. New York: G. Fischer. Stuttgart,

Критерии авторства

Калинина А.А., Македошин А.С., Радостин С.Ю., Соколова Т.Н., Карташов В.Р. выполнили экспериментальную работу, на основании полученных результатов провели обобщение и написали рукопись. Калинина А.А., Маке-дошин А.С., Радостин С.Ю., Соколова Т.Н., Карташов В.Р. имеют на статью равные авторские права и несут равную ответственность за плагиат.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации

Александра А. Калинина

Нижегородский государственный технический университет им. Р. Е. Алексеева, К.х.н., доцент 777aleksa777_87@mail.ru

Александр С. Македошин

Нижегородский государственный технический

университет им. Р. Е. Алексеева,

Аспирант

biotehno@nntu.nnov.ru

Станислав Ю. Радостин

Нижегородский государственный технический университет им. Р. Е. Алексеева, К.х.н., доцент biotehno@nntu.nnov.ru

1991, 79 p.

13. Smith J.J., McFeters G.A. Mechanisms of INT (2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride), and CTC (5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride) reduction in Escherichia coli K-12. Journal of Microbiological Methods. 1997, vol. 29, no. 3, pp. 161-175.

14. Hatzinger P.B., Palmer P., Smith R.L., Pe-narrieta C.T., Yoshinari T. Applicability of tetrazolium salts for the measurement of respiratory activity and viability of groundwater bacteria. Journal of Microbiological Methods. 2003, vol. 52, no. 1, pp. 47-58.

15. Radostin S.Yu., Kalinina A.A., Makedoshin A.S., Sokolova T.N., Kuzina O.V., Kartashov V.R. Recovery of iodnitrotetrazolium by bacterial cells as a method for evaluating their corrosive activity. Korroziya: materialy, zashchita [Corrosion: materials, protection]. 2015, no. 11, pp. 45-48. (in Russian)

16. Dikerson R., Grey G., Heyt Dzh. Osnov-nye zakony khimii. Moscow: Mir Publ., 1982, 652 p. (in Russian)

Contribution

Kalinina A.A., Makedoshin A.S., Radostin S.Y., Sokolova T.N., Kartashov V.R. carried out the experimental work, on the basis of the results summarized the material and wrote the manuscript. Kalinina A.A., Makedoshin A.S., Radostin S.Y., Sokolova T.N., Kartashov V.R. have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism.

Conflict of interests

The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.

AUTHORS' INDEX Affiliations

Alexandra A. Kalinina

Nizhny Novgorod State Technical University n. a. R.E. Alekseev,

Ph.D. (Chemistry), Associate Professor 777aleksa777_87@mail.ru

Alexandr S. Makedoshin

Nizhny Novgorod State Technical University n. a. R.E. Alekseev, Postgraduate Student biotehno@nntu.nnov.ru

Stanislav Y. Radostin

Nizhny Novgorod State Technical University n. a. R.E. Alekseev,

Ph.D. (Chemistry), Associate Professor biotehno@nntu.nnov.ru

Татьяна Н. Соколова

Нижегородский государственный технический университет им. Р. Е. Алексеева, Д.х.н., профессор, профессор biotehno@nntu.nnov.ru

Елена П. Комова

Нижегородский государственный технический университет им. Р. Е. Алексеева, К.х.н., доцент biotehno@nntu.nnov.ru

Поступила 11.08.2017

Tatyana N. Sokolova

Nizhny Novgorod State Technical University n. a. R.E. Alekseev,

Doctor of Chemistry, Professor, Professor biotehno@nntu.nnov.ru

Elena P. Komova

Nizhny Novgorod State Technical University n. a. R.E. Alekseev,

Ph.D. (Chemistry), Associate Professor biotehno@nntu.nnov.ru

Received 11.08.2017