CC BY
49
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, № 2
Ветеринарная микробиология и паразитология
УДК 636.598:619:579.62:579.887.111:579.25
ВЫЯВЛЕНИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ Mycoplasma sp.
1220 У ГУСЕЙ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ И УКРАИНЕ
А.В. СПРЫГИН1, Д.В. ВОЛОХОВ2, В.Н. ИРЗА1, В.В. ДРЫГИН1
Исследовали пробы патологического материала от 47 домашних гусей с клиническими признаками воспаления фаллоса, клоаки и яйцевода из двух гусеводческих хозяйств России и одного гусеводческого хозяйства Украины. Известно, что у кур подобная клиническая картина может быть вызвана Mycoplasma gallisepticum, у гусей — при инфицировании условнопатогенными микроорганизмами родов Neisseria и Candida, а также Mycoplasma sp. 1220 (недавно охарактеризованная условно-патогенная микоплазма). С использованием ПЦР мы не выявили M. gallisepticum у исследуемой птицы. В то же время в образцах были обнаружены специфические ампликоны генов rpoB, dnaE, fusA, pyk Mycoplasma sp. 1220. Результаты секвенирования этих ампликонов продемонстрировали 98-99 % их гомологии с последовательностями из GenBank для Mycoplasma sp. 1220 — микоплазмы, выделенной и идентифицированной ранее в Венгрии у домашних гусей с клиническим проявлением патологии органов репродуктивной системы (видовое название микроорганизму пока не присвоено). Выполненное исследование представляет собой первый случай выявления и генетической идентификации Mycoplasma sp. 1220 у домашних гусей на территории Российской Федерации и Украины.
Ключевые слова: микоплазма, воспаление, гуси, генетическая идентификация.
Keywords: mycoplasma, inflammation, geese, gene identification.
Микоплазмозы наносят значительный экономический ущерб птицеводческим хозяйствам, вызывая острые и хронические инфекционные заболевания, которые приводят к снижению яйценоскости, уменьшению массы тела птицы и гибели поголовья (1-6). Эффективность мер по борьбе с микоплазмозами во многом зависит от своевременного выявления и идентификации возбудителя заболевания (5, 7).
Первые сообщения о микоплазмозах у гусей в научной литературе появились несколько десятилетий назад (8-13). Клинически микоплазмозы характеризуются наличием аэросаккулитов и перитонитов, сальпингитов, повышенными показателями смертности эмбрионов, воспалением фаллоса, клоаки, яичника и яйцевода (5, 6, 8, 10, 14, 15). Известно, что Mycoplasma gallisepticum может быть этиологическим агентом воспаления яйцевода у кур-несушек (16), а также инфицировать гусей и передаваться трансовариально потомству (11).
Ранее предполагалось, что снижение яйценоскости, повышенная эмбриональная смертность, воспаление органов пищеварительной и репродуктивной системы у гусей обусловлены микотоксинами, присутствующими в кормах (17, 18). Однако (в дополнение к возможным микотоксикозам у гусей) проведенные эпизоотологические исследования и эксперименты выявили инфекционный характер этой патологии, а вероятными возбудителями были названы микроорганизмы родов Neisseria и/или Candida (1921). Сходные клинически признаки у гусей регистрировали в Израиле (22), в Венгрии (19, 20) и СССР (21), при этом в большинстве описанных случаев комплексного изучения этиологии заболевания не проводили.
Следует отметить, что M. anseris, M. cloacale и Acholeplasma spp. — представители нормальной микрофлоры гусей (12, 23). Их патогенность для гусиных эмбрионов, суточных гусят или гусынь в начале репродуктивного периода показана только в экспериментальных условиях при доста-
точно высоких дозах инфицирования, однако ее никогда не наблюдали при естественном заражении (8, 10, 24-27). В 1983 году в Венгрии от гусака с клиническими признаками воспаления фаллоса был выделен новый бактериальный агент рода Mycoplasma, обозначеный как Mycoplasma sp. 1220 (14, 26). Изучение биохимических и серологических свойств позволило сделать вывод, что изолят представляет собой новый вид микоплазмы гусей (14, 25-27), которая получила предварительное название Mycoplasma anserisalpingitis (D.V. Volokhov и L. Stipkovits, персональное сообщение). Поскольку видовое название микроорганизму официально еще не присвоено, в нашем исследовании мы используем обозначение Mycoplasma sp. 1220 как видовое.
Mycoplasma sp. 1220 — неподвижный плеоморфный прокариотический микроорганизм, способный проходить через фильтры с размером пор 0,22 мкм и расти в температурном интервале от +30 до +40 °С как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Она ферментирует глюкозу и фруктозу (фруктоза предпочтительнее и ферментируется быстрее, чем глюкоза), не способна утилизировать аргинин, эскулин и мочевину, проявляет фосфатазную активность, для роста in vitro ей необходимы стеро-лы или сыворотка крови. По морфологическим и культуральным признакам Mycoplasma sp. 1220 практически неотличима от M. anatis, ранее описаной у домашних и диких уток, а также редко регистрируемой у гусей (12). Mycoplasma sp. 1220 хорошо выделяется из свежего патологического материала, взятого от гусей (смывы и соскобы со слизистых оболочек яйцевода, клоаки, лимфа фаллоса и др.) и растет на среде Хейфлика, Фрея и PPLO («Becton-Dickinson», Franklin Lake NJ, США) с добавлением 0,51,0 % D-фруктозы и 15-20 % лошадиной сыворотки (Д.В. Волохов, персональное сообщение).
Основные приемы, позволяющие дискриминировать перечисленные виды микоплазм, — применение специфических антисывороток к каждому виду в реакциях перекрестного ингибирования роста и/или метаболической активности (14, 28) и использование генетической идентификации на основе генов 16S-rRNA и р-субъединицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы rpoB (29).
Ранее мы показали, что Mycoplasma sp. 1220, изолированная в Венгрии, относится к так называемому филогенетическому кластеру M. syno-viae (29) и наиболее близка к M. anatis, непатогенной и/или условнопатогенной микоплазме, ранее описаной у домашних и диких уток (12, 30). Кроме того, было обнаружено, что нуклеотидные последовательности рибосомальных генов 16S-rRNA Mycoplasma sp. 1220 и M. anatis мало различаются по выявляемым видоспецифическим мутациям и не могут использоваться для заключения о видовой принадлежности изолята, выделенного от гусей, тогда как имеющиеся существенные различия в нуклеотидных последовательностях гена р-субъединицы ДНК-зависимой РНК-поли-меразы rpoB у этих видов позволяют с высокой точностью осуществлять видовую идентификацию (29).
К сожалению, пока что отсутствуют какие-либо публикации о механизмах и путях передачи инфекции, вызываемой Mycoplasma sp. 1220. Д-р L. Stipkovits (Венгрия), впервые описавший этот вид, считает, что у гусей она может передаваться при коитусе и/или трансовариально потомству, причем гуси обоего пола могут быть инфицированы указанной микоплазмой в течение длительного периода без каких-либо клинических проявлений (персональное сообщение).
Следует отметить, что патогенные свойства Mycoplasma sp. 1220 были
изучены и описаны еще в 1980- 1990-е годы группой венгерских ветеринарных специалистов (14, 25-27). Однако молекулярные основы патогенеза, взаимодействие Mycoplasma sp. 1220 с другими микроорганизмами и их вовлечение в инфекционный процесс, а также антибиотикорезистентность и персистирование Mycoplasma sp. 1220 у гусей в процессе и после анти-биотикотерапии в полной мере не известны. Продолжение таких исследований необходимо для разработки более эффективной стратегии борьбы с микоплазмозами. В настоящее время основными лечебными и профилактическими мерами при этой патологии остаются антибиотикотерапия (применение тилозина, тиамулина, линко-спектина) (31), улучшение условий содержания птицы и использование искусственного осеменения.
Целью нашей работы было выявление и генетическая идентификация Mycoplasma sp. 1220 у домашних гусей с клиническими признаками воспаления фаллоса, клоаки и яйцевода.
Методика. Образцы для анализа (гортанные и клоакальные смывы, а также патологический материал от вынужденно убитых гусей с клиническими признаками сальпингита, воспаления клоаки и фаллоса) поступали в течение 2009-2011 годов. Патологический материал был представлен фрагментами внутренних органов (печень, селезенка, кишечник и гонады), из которых готовили общую пробу от каждой птицы для последующего выделения ДНК. Всего исследовали 47 индивидуальных образцов: 5 проб патологического материала от больных гусей из хозяйства в Уральском федеральном округе, 8 — из хозяйства в Приволжском федеральном округе и 34 смыва из хозяйства в Украине. Кроме того, были выполнены исследования 15 гортанных смывов от клинически здоровых особей из гусеводческого хозяйства в Центральном федеральном округе. Образцы патологического материала помещали в криопробирки и хранили при температуре -70 °С. Для исключения других инфекций, которые у гусей могут проявляться сходной клинической картиной, осуществляли бактериологическое исследование всех проб на наличие микроорганизмов Pasteurella multocida, Salmonella spp., Neisseria spp. и Escherichia coli, используя для их выделения классические культуральные тесты (21, 32). Дополнительно сыворотку крови гусей проверяли на присутствие антител к вирусам гриппа птиц и болезни Ньюкасла с применением соответствующих серологических тест-систем (ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», Россия) согласно инструкциям изготовителя (7). Тестирование проб на наличие M. gallisepticum и M. synoviae проводили с помощью ПЦР (33).
Суммарную ДНК из образцов выделяли с использованием набора ДНК-сорб («АмплиСенс», Россия) согласно инструкции изготовителя.
Генетическое обнаружение и идентификацию Mycoplasma sp. 1220 в пробах выполняли с помощью однораундовой ПЦР, используя пары праймеров на фрагменты генов р-субъединицы ДНК-зависимой РНК-полиме-разы (rpoB), а-субъединицы ДНК-полимеразы III (dnaE), фактора элонгации (fusA), гена пируваткиназы (pyk). Для проведения ПЦР (прибор Терцик, «ДНК-технологии», г. Москва) использовали реактивы и Taq-полимеразу фирмы «Promega» (США). Конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл, концентрация прямого и обратного праймеров для каждого гена — 5 пмоль на реакцию. После первоначальной денатурации ДНК при 95 °С в течение 8 мин последующие 45 циклов ПЦР выполняли в режиме 95 °С — 25 с, 58 °С — 1 мин, 72 °С — 1 мин; заключительная элонгация осуществлялась при 72 °С в течение 10 мин.
Анализ продуктов ПЦР проводили в 1 % агарозном геле с бромистым этидием; результат считали положительным при наличии продукта
ПЦР ожидаемой длины. Все положительные образцы секвенировали с использованием соответствующих праймеров. Очищенные ПЦР-фрагменты вышеуказанных генов секвенировали на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3130 («Applied Biosystems», США). Полученные последовательности сравнивали с референтными последовательностями Mycoplasma sp. 1220 из GenBank (National Center for Biotechnology Information — NCBI) (соответственно EU596576, HQ380795, HQ380794 и HQ438039). Выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью программы ClustalW, затем выполняли построение филогенетических дендрограмм с использованием алгоритма «minimum-evolution» при значении бутстреп-параметра 1000 повторов (MEGA 4; http://www.megasoftware.net).
Результаты. В проведенном исследовании на территории Российской Федерации и Украины впервые описаны случаи выявления и генетической идентификации Mycoplasma sp. 1220 у домашних гусей с клиническими признаками сальпингита, воспаления клоаки и фаллоса, а также проведена сравнительная филогенетическая характеристика изолятов Mycoplasma sp. 1220, идентифицированных нами на территории России, с использованием данных об изолятах Mycoplasma sp. 1220, выделенных от гусей в Венгрии, которые мы получили ранее.
Так, выполненный сиквенс и анализ рибосомальных генов 16S-rRNA, р-субъединицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы rpoB и рибосом-ного межгенного спейсера 16S—23S rRNA у разных видов рода Mycoplasma показали (29), что Mycoplasma sp. 1220, изолированная в Венгрии, относится
----AF150495 Mycoplasma 94630
---------DQ223546 Mycoplasma Ms02
---------U58504 М. pullorum
83
86
64
71
89
100
-AF412969 М. alligatoris
____AF412977
М. crocodyli
100
С
69
----AF412970 М. anatis
EU597750 Mycoplasma sp. 1220
---L24104 M. gallinaceum
------L08054 M. corogypsi
87
82
AF412981 M. gtycophilum
---------- AF412971 M. buteonis
-------AF064062 M. gallopavonis
69
77
— AF412972 M. canis -U73903 M. edwardn
----------AF412978 M. cynos
----------------U44766 M. bovirhinis
-------------------------U16759 M. leonicapttvi
97
— U09787 M. felis
- AF412986 M. mustelae
-X52083 M. synoviae
0,01
Рис. 1. Дендрограмма, отражающая филогенетическое родство Mycoplasma sp. 1220, выделенной от гусей в Венгрии, с другими микоплазмами, входящими в филогенетический кластер M. synoviae, построенная с помощью алгоритма «minimum-evolution» на основании нуклеотидных последовательностей гена 16S-rRNA (29).
к филогенетическому кластеру M. synoviae и наиболее близка к M. anatis (рис. 1), описанной у домашних и диких уток (12, 30). До настоящего времени микроорганизмы Mycoplasma sp. 1220 выделяли только от домашних гусей (13, 14, 23).
1. Доля нуклеотидных различий (%) для генов 16S-rRNA и р-субъединицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы rpoB меоду микоплазмами из филогенетического кластера Mycoplasma synoviae
Вид 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 24 26 27 28
M. anatis K6193A (1) 100 99,6 99,2 90,5 90,5 90,5 79,7 78,1 77,7 78,2 79,1 79,9 75,8 79,1 73,8 77,6 78,4 77,0 74,9 75,0 72,7 77,0 78,8 77,5 77,7 79,2 78,4 75,5
M. anatis K6193C (2) 100 100 99,1 90,3 90,3 90,3 79,6 78,0 77,5 78,0 79,1 79,8 75,7 78,9 73,6 77,4 78,3 76,8 74,8 74,9 72,5 77,1 78,6 77,3 77,9 79,2 78,2 75,5
M. anatis 1340 (3) 99,7 99,7 100 90,4 90,4 90,4 79,4 77,9 77,4 78,2 79,1 80,1 75,7 79,2 74,0 77,3 78,5 76,9 74,7 74,7 72,3 77,0 78,8 77,4 77,7 79,6 78,2 75,5
M. anserisalpingitis 31948 (4) 99,2 99,2 98,9 100 100 100 80,4 78,9 78,4 78,9 79,3 80,5 77,6 79,6 74,0 76,8 78,1 77,0 75,4 73,9 72,9 78,4 79,5 78,4 77,7 79,6 78,1 76,6
M. anserisalpingitis 31848 (5) 99,2 99,2 98,9 100 100 100 80,4 78,9 78,4 78,9 79,3 80,5 77,6 79,6 74,0 76,8 78,1 77,0 75,4 73,9 72,9 78,4 79,5 78,4 77,7 79,6 78,1 76,6
M. anserisalpingitis 1220 (6) 99,2 99,2 98,9 99,8 99,8 100 80,4 78,9 78,4 78,9 79,3 80,5 77,6 79,6 74,0 76,8 78,1 77,0 75,4 73,9 72,9 78,4 79,5 78,4 77,7 79,6 78,1 76,6
M. pullorum (7) 94,9 94,9 94,6 94,8 94,8 94,8 100 78,6 76,9 77,0 77,8 78,7 75,8 76,5 75,0 76,8 77,7 76,6 76,9 71,2 73,3 75,6 77,7 77,8 78,2 77,2 79,5 74,8
M. alligatoris (8) 94,3 94,3 94,1 94,3 94,3 94,4 92,5 100 85,2 77,6 78,4 78,8 74,9 77,8 76,5 76,7 77,1 77,6 75,0 74,6 73,5 76,8 79,1 78,3 78,3 77,7 76,1 76,2
M. crocodyli (9) 94,1 94,1 93,9 94,1 94,1 94,1 91,7 97,9 100 77,0 76,7 77,4 74,2 76,7 75,0 75,0 75,7 76,2 74,9 72,8 72,7 75,8 78,4 78,1 76,7 76,8 78,5 76,2
M. verecundum (10) 93,4 93,4 93,2 93,2 93,2 93,2 91,8 92,7 92,4 100 82,5 81,4 79,8 81,0 79,7 79,6 81,5 79,2 80,0 76,6 77,4 79,2 79,4 79,1 80,0 80,5 80,7 75,7
M. gallinaceum (11) 94,6 94,6 94,4 94,8 94,8 94,8 93,4 92,9 92,5 93,2 100 82,3 80,3 82,2 76,7 77,3 80,1 77,7 78,0 74,3 75,7 77,5 81,4 79,5 82,4 81,8 82,0 77,8
M. buteonis (12) 94,5 94,5 94,2 94,6 94,6 94,6 92,2 93,1 93,0 92,3 93,4 100 81,9 85,0 79,1 80,0 82,9 79,6 79,5 76,2 77,4 80,1 80,2 80,4 79,9 81,3 81,1 75,5
M. gallopavonis (13) 94,7 94,7 94,4 95,1 95,1 95,1 92,3 93,1 92,6 92,6 93,9 96,6 100 84,6 76,9 79,4 79,6 77,3 77,6 74,6 74,1 78,3 77,4 77,2 77,8 78,8 78,1 74,3
M. glycophilum (14) 95,1 95,1 94,8 95,3 95,3 95,3 93,4 93,1 92,6 93,9 94,8 96,3 96,9 100 76,9 78,9 81,2 78,2 77,8 76,7 76,0 78,0 80,4 78,0 78,4 81,0 80,4 76,0
M. corogypsi (15) 94,7 94,7 94,4 94,5 94,5 94,5 91,9 92,3 91,9 92,4 93,8 94,8 94,1 95,4 100 75,6 78,1 76,5 75,8 74,3 74,8 76,7 77,4 77,2 77,2 76,3 76,4 74,7
M. canis (16) 94,6 94,6 94,3 94,9 94,9 94,9 92,5 93,0 92,7 93,9 94,2 95,1 94,9 95,8 94,4 100 89,1 85,2 82,4 77,2 77,5 83,0 78,2 75,9 75,1 76,7 76,6 73,5
M. edwardii (17) 95,3 95,3 95,1 95,6 95,6 95,6 93,3 93,4 93,1 94,4 94,5 95,7 95,1 96,4 95,1 98,7 100 85,1 83,7 78,0 78,4 84,4 78,3 77,2 77,1 79,8 78,2 75,6
M. cynos (18) 94,4 94,4 94,1 94,7 94,7 94,7 92,2 92,3 92,1 94,0 93,6 94,1 94,6 95,3 93,5 97,5 97,5 100 82,7 78,7 78,4 83,0 79,4 78,0 77,3 78,8 77,8 74,1
M. bovirhinis (19) 93,8 93,8 93,5 93,6 93,6 93,6 91,7 92,6 92,0 93,2 93,4 93,4 93,6 94,1 93,4 96,8 96,5 96,7 100 76,7 76,9 81,1 77,9 77,2 77,8 78,0 78,7 75,4
M. felis (20) 93,7 93,7 93,5 93,5 93,5 93,5 90,8 91,7 91,5 92,6 92,7 92,9 93,4 94,5 93,3 94,6 94,9 94,9 94,2 100 77,9 79,1 75,6 75,3 73,6 74,7 72,5 72,9
M. mustelae (21) 94,5 94,5 94,2 94,3 94,3 94,3 92,1 92,5 92,1 93,4 93,0 93,1 93,3 94,6 93,6 95,3 95,3 95,3 95,1 95,8 100 79,2 76,7 74,9 75,4 75,3 76,5 73,3
M. leonicaptivi (22) 93,4 93,4 93,1 93,3 93,3 93,3 91,5 91,5 91,4 92,0 91,7 93,1 92,3 93,3 92,9 94,5 94,9 94,5 94,0 93,7 94,8 100 77,6 77,1 76,3 77,9 76,7 75,1
M. oxoniensis (23) 94,1 94,1 93,8 94,1 94,1 94,1 92,1 92,7 92,1 92,0 92,9 92,4 93,1 93,8 92,2 91,8 92,6 92,5 91,8 92,7 92,6 91,6 100 90,1 84,1 82,8 81,1 78,2
M. cricetuli (24) 94,1 94,1 93,8 94,0 94,0 94,0 91,8 92,4 91,8 91,8 92,4 92,7 92,8 93,4 92,2 91,7 92,4 92,7 91,6 92,7 92,7 91,7 98,8 100 84,2 83,3 81,5 76,0
M. citelli (25) 93,4 93,4 93,1 93,4 93,4 93,4 91,5 92,7 91,9 92,7 92,7 92,4 92,7 93,4 91,9 92,1 92,6 92,2 92,5 92,4 93,0 91,5 96,3 96,0 100 86,0 83,8 77,3
M. columborale (26) 94,7 94,7 94,4 94,8 94,8 94,8 92,8 92,8 92,7 93,3 93,5 94,3 94,6 94,9 93,2 93,2 94,1 93,4 92,4 93,1 93,5 92,6 96,9 96,9 97,0 100 85,4 76,4
M. sturni (27) 92,5 92,5 92,2 92,7 92,7 92,7 90,4 91,8 91,4 92,0 92,7 93,2 92,9 93,2 91,5 92,7 93,2 92,2 92,1 91,6 92,1 90,5 93,8 93,7 94,3 95,3 100 75,8
M. synoviae (28) 91,1 91,1 90,8 90,9 90,9 90,9 89,8 90,4 89,9 90,9 90,8 90,7 90,5 91,2 90,3 91,5 91,7 92,1 92,0 91,2 92,3 90,8 91,4 91,4 91,8 91,4 90,5 100
П р и м е ч а н и е. Показатели для генов 16S-гRNA и rpoB соответственно ниже и выше диагонали 100 % идентичности для каждого вида.
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей рибо-сомальных генов 16S-rRNA и р-субъединицы ДНК-зависимой РНК-поли-меразы rpoB штаммов Mycoplasma sp. 1220 (Mycoplasma anserisalpingitis), изолированных в Венгрии, типового и клинических штаммов M. anatis, выделенных от диких уток в США, а также типовых штаммов микоплазм, относящихся к филогенетическому кластеру M. synoviae, позволил заключить, что из-за высокой степени сходства нуклеотидные последовательности генов 16S-rRNA Mycoplasma sp. 1220 и M. anatis не могут служить для идентификации видовой принадлежности изолята, выделенного от гусей.
В то же время изучение нуклеотидных различий в гене rpoB р-субъ-единицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы у венгерского изолята Mycoplasma sp. 1220 и M. anatis, а также у других микоплазм, входящих в филогенетический кластер M. synoviae (табл. 1), показало, что эти различия позволяют с высокой точностью дискриминировать указанные виды микоплазм. Филогенетическая близость, сходная с тесным родством между Mycoplasma sp. 1220 и M. anatis, в пределах кластера M. synoviae также наблюдалась между ранее описанными видами микоплазм M. oxoniensis и M. cricetuli, изолированных от китайских хомячков (см. табл. 1).
Выявленная возможность видовой идентификации микоплазм на основании сходства последовательности гена rpoB была использована при анализе образцов патологического материала, полученного из гусеводческих хозяйств на территории России и Украины.
На исследуемых птицекомплексах регистрировали высокую смертность гусиных эмбрионов в процессе инкубации и снижение яйценоскости у гусынь. Следует отметить, что микроорганизмы родов Pasteurella, Salmonella, Neisseria и Escherichia, а также M. gallisepticum и M. synoviae в образцах выявлены не были; в сыворотке крови больной птицы антител к вирусам гриппа и болезни Ньюкасла не обнаружили.
Ранее в Венгрии на птицекомплексах отмечались заболевания гусей, ассоциированные с Mycoplasma sp. 1220. При этом наблюдали сходные клинические признаки: увеличение смертности поголовья, деформацию скорлупы, падение яйценоскости, достигающее 25 %, и повышение эмбриональной смертности на последних сутках до 40 % (14, 26). У больных гусей обнаруживали серозно-фибринозный перитонит и сальпингит, воспаление фаллосов у гусаков (10, 14). В 15 % случаев проявился некротический энтерит с наличием фибринозного экссудата (14), однако это не было характерным симптомом инфекции, вызванной Mycoplasma sp. 1220, и, вероятно, стало следствием активации условно-патогенной микрофлоры на фоне первичной микоплазменной инвазии. Изоляты Mycoplasma sp. 1220 были получены из образцов патологически измененных воздухоносных мешков, печени, селезенки, тестикул, яичников, яйцевода и брюшины больных гусей (14, 26).
Таким образом, на основании клинических признаков, наблюдаемых у гусей в исследуемых нами хозяйствах и сходных с описанными ранее на венгерских птицекомплексах, а также отсутствия вышеуказанных бактериальных и вирусных патогенов мы предположили наличие в тестируемых образцах недавно охарактеризованного вида патогенной микоплазмы гусей — Mycoplasma sp. 1220.
При тестировании образцов ДНК, выделенных из патологического материала, использовали праймеры, разработанные нами для идентификации Mycoplasma sp. 1220 (табл. 2).
Наши предположения подтвердились, когда при постановке ПЦР на четыре генетических маркера Mycoplasma sp. 1220 был получен положительный результат по всем генам для 23 (49 %) из 47 проанализирован-
ных образцов. При этом тестирование ІЗ проб гортанных смывов от клинически здоровых гусей дало отрицательный результат.
2. Нуклеотидные последовательности праймеров, разработанных для амплификации фрагментов генов Mycoplasma sp. 122G из образцов исследуемого патологического материала
Ориентация
праймера
Последовательность праймера
Ген-мишень
Длина ам-пликона, п.н.
Прямой 5 '-СЛЛ-ЛСЛ-ТТЛ-ООЛ-ОСЛ-ЛЛО-ЛЛТ-ТСО-З'
Обратный 5 '-ТОО-ТТТ-СОС-ТЛЛ-ТТТ-СТО-ОЛТ-СО-З'
Прямой 5 '-ЛСЛ-ТТЛ-ТТО-ЛТЛ-СЛС-СЛО-ООС-ЛСО-З'
Обратный 5 '-ООТ-ТСЛ-ЛОЛ-ОСТ-ТОТ-ОЛЛ-ЛТЛ-ЛСТ-ОО-З'
Прямой 5 '-ЛСТ-ТСЛ-ОТС-ЛТО-ОЛО-ЛТС-ЛСТ-С-З'
Обратный 5 '-ТСЛ-ЛОТ-ООО-ЛЛТ-ТТЛ-ССО-ТТТ-ОСЛ-О-З'
Прямой 5' -ТЛЛ-ССЛ-ЛЛТ-ТСС-ЛЛТ-Т ОТ -ЛЛЛ-ЛСТ-ТОО-ТО-З'
Обратный 5' - СЛЛ- ОЛЛ- СЛТ - СЛС- СЛЛ- ОТТ-СТС-ТЛС-З'
Ген а-субъединицы ДНК- 800
полимеразы III (йпаЕ)
О-фактор трансляции и 1000
элонгации (/шА)
Ген пируваткиназы (рук) 850
Ген р-субъединицы 5З2
РНК-полимеразы (гроВ)
Mycoplasma sp. 1220 (так же, как M. anseris, M. cloacale и Achole-plasma spp.) ранее была выделена в Германии от клинически здоровых гусей (23). Иными словами, проявление ее патогенных свойств в естественных условиях, вероятно, связано с обстоятельствами содержания птицы, различиями в вирулентности циркулирующих штаммов этой микоплазмы, дисбактериозом в клоаке и яйцеводе на фоне других инфекций и/или несоблюдения зоогигиенических правил содержания птицы. Поскольку указанные микоплазмы присутствуют в нормальной микрофлоре особей, не вызывая видимых клинических и патологических изменений, основную роль в инициации патогенеза могут играть стрессирующие факторы, которые ослабляют организм птицы, например переуплотнение популяции стада и/или отсутствие водоема на ферме (Z. Varga и L. Stipkovits, персональное сообщение).
Кроме того, следует отметить, что эта инфекция клинически более выражена у гусаков (воспаление фаллоса и клоаки), тогда как у гусынь ее симптомы (воспаления яйцевода и клоаки) не всегда клинически проявляются, вследствие чего основными признаками инфицирования становятся снижение яйценоскости, видимые изменения скорлупы яиц (выступы и шероховатости с зернистой поверхностью из-за отложения кальция, позднее — выраженное истончение скорлупы) и гибель эмбрионов (возможно вертикальное инфицирование) (14).
Штаммы из Венгрии
99
. EU596576 Mycoplasma 1220 9П
85П НМ241736 Mycoplasma 32328 J LHQ534366 Mycoplasma HQ877767 Mycoplasma R2 □
JF523356 Mycoplasma R3 J Изолят из Украины IDQ157624 M. anatis ATCC25524 1^j]jGU905016 M. anatis K6193A ™T-rHIQnSni7 M пяпНс TffilQlr
Группа A: Mycoplasma sp. 1220
Группа В: Mycoplasma anatis
59- GU905017 M. anatis K6193C J ■ EU859969 M. glycophilum 486
DQ219491 M. hyopharyngis ATCC51
- DQ076669 M. oxoniensis —DQ112171 M. crocodyli MP145
0,02
Рис. 2. Дендрограмма, отражающая филогенетическое родство изученных изолятов Mycoplasma sp. 1220 из двух хозяйств на территории Российской Федерации и хозяйства в Украине, построенная с помощью алгоритма «minimum-evolution» на основании последовательностей гена rpoB.
Результаты секвенирования всех полученных ПЦР-фрагментов продемонстрировали 98-99 % их гомологии с последовательностями из Gen-Bank для Mycoplasma sp. 1220, выделенной и идентифицированной у домашних гусей в Венгрии. Данные филогенетического анализа последовательно-
стей гена р-субъединицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы (rpoB) у Mycoplasma sp. 1220, обнаруженных в России и в Венгрии, приведены на рисунке 2.
Репрезентативные последовательности гена р-субъединицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы (rpoB), а-субъединицы ДНК-полимеразы III (dnaE), фактора элонгации (fusA), гена пируваткиназы (pyk) Mycoplasma sp. 1220, обнаруженной нами у гусей в России, были депонированы в Gen-Bank под номерами HQ534366, HQ877767, JF523356 и JF731008-JF731011.
Итак, описан первый случай выявления Mycoplasma sp. 1220 у домашних гусей на территории России и Украины. В исследуемых хозяйствах у птицы с клиническими признаками воспаления фаллоса, клоаки и яйцевода в образцах биологического материала не выявлены патогены родов Pas-teurella, Salmonella, Neisseria и Escherichia, а также Mycoplasma gallisepticum и M. synoviae, в сыворотке крови отсутствуют антитела к вирусам гриппа и болезни Ньюкасла. В то же время в пробах обнаружены специфические ампли-коны генов rpoB, dnaE, fusA, pyk Mycoplasma sp. 1220. Результаты секвениро-вания этих ампликонов продемонстрировали 98-99 % их гомологии с соответствующими последовательностями из GenBank для Mycoplasma sp. 1220.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. B r a d b u r y J.M. Gordon Memorial Lecture. Poultry mycoplasmas: sophisticated pathogens in simple guise. Br. Poult. Sci., 2005, 46: 125-136.
2. S t i p k o v i t s L., K e m p f I.. Mycoplasmoses in poultry. Rev. Sci. Tech., 1996, 15: 1495-525.
3. Л ы с к о С.Б. Схемы профилактики и лечения респираторного и ассоциативного мико-плазмоза птиц. Канд. дис. Омск, 2005.
4. С у н ц о в а О.А. Усовершенствование лабораторной диагностики ассоциативного респираторного микоплазмоза птиц. Канд. дис. Омск, 2004.
5. K l e v e n S.H. Control of avian mycoplasma infections in commercial poultry. Avian Dis., 2008, 52(3): 367-374.
6. N o o r m o h a m m a d i A.H. Role of phenotypic diversity in pathogenesis of avian mycoplasmosis. Avian Pathol., 2007, 36(6): 439-444.
7. M у д р а к Н.С. Создание и внедрение в промышленное птицеводство системы комплексного серологического мониторинга инфекционных болезней на основе имму-ноферментного анализа. Докт. дис. Владимир, 2010.
8. S t i p k o v i t s L., E l - E b e e d y A.A., K i s a r y J., V a r g a L. Mycoplasma infection of geese. 1. Incidence of mycoplasmas and acholeplasmas in geese. Avian Pathol., 1975, 4: 35-43.
9. K i s a r y J., E l - E b e e d y A.A., S t i p k o v i t s L. Mycoplasma infection of geese. II. Studies on pathogenicity of mycoplasmas in goslings and goose and chicken embryos. Avian Pathol., 1976, 5: 15-20.
10. S t i p k o v i t s L., B o v e J.M., R o u s s e l o t M., L a r r u e P., L a b a t M., V u-i l l a u m e A.. Studies on mycoplasma infection of laying geese. Avian Pathol., 1985, 14: 57-68.
11. B e n o i n a D., T a d i n a T., D o r r e r D. Natural infection of geese with Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae and egg transmission of the mycoplasmas. Avian Pathol., 1988, 17(4): 925-928.
12. B e n c i n a D., D o r r e r D., T a d i n a T. Mycoplasma species isolated from six avian species. Avian Pathol., 1987, 16(4): 653-664.
13. V a r g a Z., S t i p k o v i t s L., D o b o s - K o v a c s M., S a n t h a M. Investigation of goose mycoplasmas. Arch. Exp. Veterinarmed, 1986, 40(1): 105-108.
14. D o b o s - K o v a c s M., V a r g a Z., C z i f r a G., S t i p k o v i t s L. Salpingitis in geese associated with Mycoplasma sp. strain 1220. Avian Pathol., 2009, 38: 239-243.
15. B e h r K.P., H i n z K.H., R o t t m a n n S. Phallus-inflammation of ganders: clinical observations and comparative bacteriological examinations of healthy and altered organs. Zentralbl. Veterinarmed. B, 1990, 37(10): 774-776.
16. N u n o y a T., K a n a i K., Y a g i h a s h i T., H o s h i S., S h i b u y a K., T a j im a M. Natural case of salpingitis apparently caused by Mycoplasma gallisepticum in chickens. Avian Pathol., 1997, 26: 391-398.
17. D e g e r n e s L.A. Waterfowl toxicology: a review. Vet. Clin. North Am. Exot. Anim. Pract., 2008, 11: 283-300.
18. P a l y u s i k M., K o p l i k - K o v a c s E. Effect on laying geese of feeds containing the fusariotoxins T2 and F2. Acta Vet. Acad. Sci. Hung., 1975, 25(4): 363-368.
19. P a t a k y M. An infectious inflammatory disease of cloaca and penis in geese (goose gonorrhoea). II. Properties of the causal agent and infection experiments. Acta Vet. Acad. Sci. Hung., 1974, 24: 335-359.
20. S z e p I., P a t a k y M., N a g y G. An infectious inflammatory disease of cloaca and penis in geese (goose gonorrhoea). I. Epizootological, clinical, pathological observations and control. Acta Vet. Acad. Sci. Hung., 1974, 24: 347-354.
21. H а л и в а й к о Л.И. Биологические свойства возбудителя нейссериоза гусей и диагностика болезни. Борки, 1984.
22. B e e m e r A.M., K u t t i n E.S., K a t z Z.. Epidemic venereal disease due to Candida albicans in geese in Israel. Avian Dis., 1973, 17: 639-649.
23. H i n z K.H., P f u t z n e r H., B e h r K.P. Isolation of mycoplasmas from clinically healthy adult breeding geese in Germany. Zentralbl Veterinarmed, 1994, B 41: 145-147.
24. S t i p k o v i t s L. The pathogenicity of avian mycoplasmas. Zentralbl. Bakteriol. Orig. A, 1979, 245(1-2): 171-183.
25. S t i p k o v i t s L., G l a v i t s R., I v a n i c s E., S z a b o E. Additional data on Mycoplasma disease of goslings. Avian Pathol., 1993, 22: 171-176.
26. S t i p k o v i t s L., V a r g a Z., C z i f r a G., D o b o s - K o v a c s M. Occurrence of mycoplasmas in geese affected with inflammation of the cloaca and phallus. Avian Pathol., 1986, 15: 289-299.
27. S t i p k o v i t s L., V a r g a Z., G l a v i t s R., R a t z F., M o l n a r E. Pathological and immunological studies on goose embryos and one-day-old goslings experimentally infected with a Mycoplasma strain of goose origin. Avian Pathol., 1987, 16: 453-468.
28. S t i p k o v i t s L., V a r g a Z., D o b o s - K o v a c s M., S a n t h a M. Biochemical and serological examination of some Mycoplasma strains of goose origin. Acta Vet. Hung., 1984, 32(3-4): 117-125.
29. V o l o k h o v D.V., S i m o n y a n V., D a v i d s o n M.K., C h i z h i k o v V.E. RNA polymerase beta subunit (rpoB) gene and the 16S-23S rRNA intergenic transcribed spacer region (ITS) as complementary molecular markers in addition to the 16 S rRNA gene for phylogenetic analysis and identification of the species of the family Mycoplasmataceae. Mol. Phylogenet. Evol., 2012, 62(1): 515-528.
30. S a m u e l M.D., G o l d b e r g D.R., T h o m a s C.B., S h a r p P., R o b b J.R., K r ap u G.L., N e r s e s s i a n B.N., K e n o w K.P., K o r s c h g e n C.E., C h i p l e y W.H.,
C o n r o y M.J. Exposure of wild waterfowl to Mycoplasma anatis. J. Wildl. Dis., 1996, 32(2): 331-337.
31. C z i f r a G., V a r g a Z., D o b o s - K o v a c s M., S t i p k o v i t s L. Medication of inflammation of the phallus in geese. Acta Vet. Hung., 1986, 34: 211-223.
32. OIE Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals, 2011. http://www.oie.int/inter-national-standard-setting/terrestrial-manual/access-online/.
33. S p r y g i n A.V., A n d r e y c h u k D.B., K o l o t i l o v A.N., V o l k o v M.S., R un i n a I.A., M u d r a k N.S., B o r i s o v A.V., I r z a V.N., D r y g i n V.V.,
P e r e v o z c h i k o v a N.A. Development of a duplex real-time TaqMan PCR assay with an internal control for the detection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae in clinical samples from commercial and backyard poultry. Avian Pathol, 39: 99-109.
1ФБГУ «Федеральный центр охраны здоровья Поступила в редакцию
животных», 6 июня 2011 года
600901 г. Владимир, мкр. Юрьевец, e-mail: sprygin@arriah.ru, irza@arriah.ru, drygin@arriah.ru;
2Division of Viral Products, Center for Biologics Evaluation and Research,
U.S. Food and Drug Administration,
Maryland 20852, USA,
e-mail: Dmitriy.Volokhov@fda.hhs.gov
DETECTION AND GENETIC IDENTIFICATION OF Mycoplasma sp. 1220 IN GEESE IN THE RUSSIAN FEDERATION AND UKRAINE
A.V. Sprygin1, D.V. Volokhov2, V.N. Irza1, V.V. Drygin1 S u m m a r y
The authors investigated samples of pathological material from 47 domestic geese with clinical presentation of inflammation of phallus, cloaca and oviduct obtained from two goose farms in Russia and one farm in Ukraine. It is known that in chickens similar clinical manifestations may be caused by infection with Mycoplasma gallisepticum, but in geese, however, this may be due to infection with opportunistic bacteria from Neisseria and Candida genera, and also with Mycoplasma sp. 1220, a recently described opportunistic mycoplasma in domestic geese. Using PCR, we detected no Mycoplasma gallisepticum in the studied birds. However, at the same time, these tested samples were positive for the rpoB, dnaE, fusA, pyk genes of Mycoplasma sp. 1220. Sequencing and analysis of these amplicons have demonstrated their 98-99 % nucleotide similarity with corresponding sequences from GenBank for Mycoplasma sp. 1220, the Mycoplasma species previously isolated in Hungary from domestic geese with clinical signs of pathological changes in the reproductive system (a species name of the microorganism has not yet assigned). Our study represents the first evidence of detection and genetic identification of Mycoplasma sp. 1220 in domestic geese in the Russian Federation and Ukraine.
