CC BY
3М.А. Вишнякова, М.О. Бурляева, Т.В. Буравцева, Д.В. Соболев, Н.В. Алпатьева
ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ КОЛЛЕКЦИИ ЗЕРНОБОБОВЫХ ВИР ПОСРЕДСТВОМ ЯАРБ-МАРКИРОВАНИЯ
ОБРАЗЦОВ
ГНУ ГНЦ РФ Всероссийский НИИ растениеводства им. Н.М. Вавилова Российская Федерация, 190000, Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, д. 42-44
Введение
В настоящее время в генбанках растительной гермплазмы молекулярно-генетические исследования становятся общепринятым методом изучения сохраняемого разнообразия. Они применяются для генотипирования растительных геномов с целью выявления генетического родства образцов, упрощения поиска и извлечения полезных генов, контролирующих качество и устойчивость к патогенам и стрессам; выявления источников редких аллелей; определения степени генетической эрозии генофонда культур; выявления филогенетических связей между таксонами; уточнения таксономического статуса отдельных видов и родов и т.д. Молекулярные маркеры становятся также необходимым инструментом правильной организации работы с коллекцией, а именно: идентификации дублетных образцов; проверки аутентичности долго сохраняемых и многократно пересеваемых образцов; создания репрезентативных выборок, максимально отражающих генетическое разнообразие коллекции (соге-коллекций); паспортизации образцов и т.п.
В настоящей статье изложены первые результаты ЯЛРВ-маркирования коллекционного генофонда ВИР, полученные кураторами коллекций генетических ресурсов зернобобовых.
Известно, что ЯЛРБ-анализ может служить своеобразным экспресс-методом выявления генетического полиморфизма и источником уникальных локус-специфичных маркеров, что особенно актуально для работы с генетическим разнообразием. Диагностические возможности ЯЛРБ-технологии успешно проиллюстрированы на многочисленных примерах описания генетического разнообразия культурных и диких растений [1-10].
Целью работы явилось определение возможности использования ЯЛРБ-анализа для оптимизации работы с коллекцией зернобобовых ВИР (поиска дублетов); выявления генетической близости образцов, имеющих разное происхождение и направления использования; а также необходимого для многовидовых коллекций уточнения таксономического статуса образца, совершенствования имеющихся морфо-биологических систем и выявления филогенетических связей. Наряду с геноти-пированием образцов использовали данные предварительного изучения морфологических и биологических свойств образцов, позволяющие кураторам лучше ориентироваться в результатах, полученных посредством применения молекулярных технологий.
Материалы и методы
Растительный материал. В работе использованы образцы коллекции зернобобовых ВИР, подобранные сообразно целям и задачам исследования.
Фасоль (Phaseolus vulgaris L.) - 20 образцов. Проанализированы сорта: Сакса - 6 образцов, Black Valentine - 8 образцов, Чудо
Парижа - 2 образцов, Contender - 4 образцов.
Горох - 95 образцов - селекционных и местных сортов российской и восточно-европейской селекции разных направлений использования, различных морфотипов и относящиеся к разным агро-экологическим группам.
Представители трибы Vicieae Bronn - 250
образцов 51 вида из 4 родов: Vicia L., Lens Mill., Pisum L., Lathyrus L.
Представители 40 видов рода Lathyrus L. -96 образцов с известными морфологическими характеристиками и имеющие различное происхождение: Lathyrus sativus L., cicera L., angulatus L., annuus L., aphaca L., articulatus L., cassius Boiss., chloranthus Boiss., chrysan-thus Boiss., ciliolatus Rech. F., clymenum L., frolovii Rupr., gloeospermus Warb. And Eig., gmelinii Fritsch., gorgoni Parl., heterophylus L., hierosolymitanus Boiss., hirsutus L., ja-ponicus Willd., latifolius L., linifolius (Reich-ard)Baessler, maritimus (L.) Bigel., mulkak Lipsky., niger (L.) Bernch., nissolia L., ochrus (L)DC., odoratus L., palustris L., pisiformis L.,pratensis L.,pseudocicera Boiss., setifolius L., spaericus Retz., sylvestris L., rotundifolius Willd., roseus Steven, tingitanus L., tuberosus L., vernus (L.) Bernch.
Выделение ДНК проводили по описанной ранее методике [11] из 10-14-дневных проростков индивидуальных растений каждого образца, а также из смеси 5-10 проростков семян одного образца. Количество ДНК, экстрагируемое при использовании указанного метода, было не менее 0,5мкг ДНК на образец. Чистота полученных препаратов составляла OD260\280 = 1,6-1,9. Каждый эксперимент проводили в двух повторностях. Всего было выделено и проанализировано 614 препаратов ДНК представителей трибы Vicieae.
RAPD анализ. Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) объемом 25 мкл содержала 20 нг геномной ДНК, 0,2 мкМ праймера(ов), 200 мкМ каждого: dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 2,5 мМ MgCl2 и Taq-полимеразы в инкубационном буфере. ПЦР проводили в амплификаторе Techc (США) в следующих условиях: цикл 1 - 5 мин. при 95°C; циклы 2-35, 1 мин. при 95°C, 1 мин. при 36°C и 2 мин. при 72°C; цикл 36 - 10 мин. при 72°C. Продукты реакции разделяли элек-
трофорезом в 1,5% агарозном геле с добавлением этидиум бромида и документировали с помощью системы Transilluminator UVP Bio-Doc-It™ Imaging System, модель М-20. Размеры амплифицированных фрагментов определяли при использовании в качестве маркера 1 kb SmartLader 1700-02 (Нидерланды).
Для фасоли использовали 5 праймеров: ЕТ 1/18, ЕТ 2/18, ЕТ 4/18, ЕТ 6/18, 1Т 1/18, ранее примененных для выявления сортовых различий [12].
Для гороха использовали 5 праймеров, выявляющих полиморфизм P. sativum: OPA11, OPA16, OPA19, ОРС2, ОРС4 (Operon Technologies, USA).
Для оценки геномного полиморфизма 250 образцов из трибы Vicieae были подобраны прай-меры OPA01, OPA10, OPA11, OPA14, OPA16, OPA17, OPA19, OPH02, OPH03, OPH06, OPH09, OPK01, OPK04, OPK08, OPK09, OP^2, OPd4 (Operon Technologies, USA).
Статистический анализ данных включал составление бинарных матриц по каждому из праймеров, в которых отмечалось «присутствие» (1) или «отсутствие» (0) фрагментов с одинаковой молекулярной массой на элек-трофореграмме. Каждый RAPD-фрагмент рассматривался как отдельный генетический локус. Характер и степень RAPD изменчивости анализировали в отношении праймера и образца. На основании суммарной матрицы RAPD-спектров с помощью компьютерного программного пакета NTSYSpc 2.02 были определены генетические дистанции между исследуемыми образцами. Для построения дендрограмм, демонстрирующих филогенетические отношения между изучаемыми образцами видов рода Lathyrus и образцов рода Pisum, применили метод невзвешенно-го парно-группового кластерного анализа с арифметическим усреднением (UPGMA) с использованием программ TREECON и STA-TISTICA 7.0)
Результаты и обсуждение
Фасоль (Phaseolus vulgaris L.). Коллекция одинаковое название сорта, но поступавших
фасоли в ВИРе насчитывает 7517 образцов, в ВИР в разное время, из разных мест и заре-
поступавших в нее в течение почти ста лет. гистрированных под разными номерами. Об
За это время в коллекции накопилось опреде- идентичности таких образцов можно судить
ленное число дублетных образцов, имеющих по морфологическим, фенологическим и хо-
зяиственным признакам при одновременном посеве. Однако списание таких образцов на основе только фенотипического сходства предполагает риск потери определенного генетического разнообразия. Возможность использования молекулярных методов для выявления дублетных образцов позволит делать это с большой степенью достоверности.
RAPD-анализ образцов одного сорта выявил следующее.
Сорт Сакса: 3 образца (кк-1198, 8534, 11677) являются дублетами и могут быть записаны как один номер каталога ВИР; 3 образца (кк-9635, 10378, 14217) показали отличия по компонентному составу амплифицированных фрагментов;
Сорт Чудо Парижа: 2 образца (кк-46, 51) различаются по компонентному составу и дублетами не являются;
Сорт Contender: 2 образца (кк-11241, 11674) идентичны между собой и являются дублетами, равно как и кк-11779, 14214. Внутри каждой из этих пар с помощью указанных прай-меров различий не выявлено, однако между ними выявлены;
Сорт Black Valentine: все 8 образцов (кк-178, 559, 7802, 8218, 8211, 8407, 10060, 10104) имели различные амплифицированные фрагменты и не могут быть признаны дублетами.
Таким образом, подтверждена неправомочность списания из коллекции образцов, имеющих одинаковое название и сходных фе-нотипически без их молекулярного генотипи-рования. Среди таких образцов, проверенных RAPD-маркерами оказались как истинные дублеты, так и генетически разный материал (Буравцева, Алпатьева, 2007).
Горох (Pisum sativum L.) в вировской коллекции представлен 8504 образцами, что предполагает большое генетическое разнообразие. Перед вировцами и селекционерами стоит задача максимально эффективного использования генетического потенциала вида в селекции. Однако из работ, проведенных зарубежными учеными по генотипированию сортов гороха западно-европейской селекции, стало очевидным, что, несмотря на значительные успехи в создании современных сортов, их генетическая основа парадоксально узка по сравнению с большим генетическим разнообразием вида P. sativum [14].
Агроэкологическое разнообразие, большое число местных сортов, сортов разных направлений использования, сохраняемых в коллекции ВИР, дает основание предполагать и соответствующее генотипическое разнообразие, которое необходимо выявлять и систематизировать для оптимального использования в селекции.
CN
о:
Зерновые л Л
О о 0<Ъ
щ>
□ Овошные
с орт л
° кормовые п.......
D COptil
D □
□□ □
-6
-2 0
а 10 12 14
Root 1
Рис. 1. Расположение образцов гороха разных направлений использования в пространстве двух канонических осей (Root 1 и Root 2).
Предварительная оценка 46 морфологических, фенологических и агрономических признаков 95 образцов позволила выявить их дифференциацию по направлениям использования. Определены признаки, имеющие наибольшее значение для разделения групп и определяющие их достоверные различия, а именно - форма семян, окраска цветка, наличие антоцианового полукольца прилистников, степень изогнутости боба, тип листа, поверхность семян, число продуктивных узлов и число бобов на растении. По совокупности этих признаков можно установить принадлежность образца к группе использования (рис. 1).
В результате RAPD анализа 85 из этих образцов суммарно выявлено 49 полиморфных фрагментов. Число полиморфных фрагментов на праймер варьировало от 8 до 12. При этом для каждого образца были получены уникальные RAPD-спектры фрагментов ДНК. Однако фрагменты, характерные для сортов, отсутствовали.
Исследование генетической близости образцов на основе общей матрицы полученных и обработанных данных RAPD-анализа ДНК в виде дендрограммы, показало сходство овощных сортов, из которых более 90% сгруппировались в одном кластере. Кормовые сорта оказались достаточно дистанци-ированными от овощных и также сгруппировались в одном кластере. Исходными по отношению к обеим группам, по-видимому, являются зерновые сорта, проявляющие генетическую близость к той и другой группе (рис. 2). Как по результатам дискриминационного анализа (рис. 1), так и молекулярного маркирования (рис. 2) кормовой образец
к-8764 попадает в группу зерновых сортов. Морфологические и агрономические характеристики этого образца обнаруживают у него такие несвойственные другим кормовым сортам признаки как неосыпаемость, детерминантный тип роста стебля, низко-рослость, крупносемянность, что ставит под сомнение определение данного образца как кормовой.
Сопряженный анализ морфологических, биологических, агрономических данных и агро-экологической дифференциации образцов, и данных, полученных на основе RAPD-анализа, не выявил топологии полученных дендрограмм.
Таким образом, проведенный нами с указанным выше набором праймеров RAPD-анализ не может служить методом сортовой идентификации сортов гороха, но позволяет классифицировать образцы по группам использования.
Триба Виковых. К трибе Vicieae относятся экономически значимые роды Lathyrus, Vicia, Lens, Pisum. По совокупности морфо-биологических признаков триба считается наиболее совершенной в семействе Fabaceae Lindl., но вместе с тем очень проблематичной в плане таксономии и филогении. Наличие у целого ряда видов диагностических признаков, характерных для разных родов трибы, служит причиной множества мнений о количестве реальных родов в ней и таксономической принадлежности видов к родам. До настоящего времени вызывают сомнение границы родов и видов, т. к. в них сочетаются черты прогрессивной эволюции и редукции с общими признаками предковых форм и четко выражен параллелизм.
А1а
А1аа
А1 ab
А1
гГ
А2а
А2
А2Ь
В1 а
В1
В
-С
-с
В1Ь
В2
■С
Рис. 2. Дендрограмма генетических различий 85 образцов гороха, построенная на основе сравнительного анализа 49 полиморфных амплифицированных RAPD-фрагментов. (Использовано 5 RAPD праймеров. ▲ - овощные сорта, • - кормовые, без символа - зерновые).
Рис. 3. Электрофоретические спектры RAPD фрагментов 16 видов трибы Vicieae (праймер OPH03). М - маркер молекулярной массы SmartLader 1700-02 (Нидерланды).
1, 4 - Vicia unijuga A. Br.; 2 - Lathyrus japonicus; 3 - Pisum elatius; 5 - V. sativa L.; 6 - V. narbonensis L.; 7 -V. hirsuta L. Gray; 8 - V. peregrina L.; 9 - V. villosa Roth; 10 - P. sativum; 11 - Lens culinaris Medik; 12 - V. ervilia L. Willd.; 13 - V. faba L.; 14 - L. sativus; 15 - L. sylvestris; 16 - L. ochrus; 17 - L. vernus; 18 - L. gmelinii.
Рис. 4. Электрофоретические спектры RAPD фрагментов 15 образцов разного происхождения вида L. pratensis (1-15), 1 образца L. latifolius (16) и 1 образца L. sylvestris (17) (праймер OPK04). М - маркер молекулярной
массы SmartLader 1700-02 (Нидерланды).
1 - И-591793 (Франция), 2 - И-592364 (Италия), 3 - к-593944 (Финляндия); 4, 5 - И-0139314 (Россия, Карелия), 6
- И-060192 (Казахстан); 7 - И-073657 (Россия, Тюменская обл.); 8 - И-073659 (Россия, Омская обл.); 9 - И-077063 (Россия, Свердловская обл.); 10 - И-077614 (Россия, Архангельская обл.); 11 - И-094254 (Россия, Краснодарский кр.); 12 - И-0122324 (Закарпатье); 13 - И-0139319 (Россия, Ленинградская обл.); 14 - И-0140535 (Россия, Алтай); 15 - к-0139312 (Россия, Карелия); 16 - И-310163 (Италия); 17 - И-591756 (Италия).
Триба слабо дифференцирована, имеет огромный ареал, несколько центров первичного и вторичного происхождения. Кроме того, многие крупные роды трибы не изучались в монографическом плане в мировом масштабе, а были предметом внимания флористов на ограниченных участках ареала.
Эти сложности создают целый ряд препятствий в работе с коллекцией.
С целью прояснения некоторых спорных вопросов систематики трибы было предпринято молекулярное маркирование образцов, относящихся к разным родам и видам, разные по коллекционному статусу: сорта научной и народной селекции, дикие формы.
Большинство исследованных видов отличались значительным внутривидовым полиморфизмом. Основная зона разделения фрагментов находилась в пределах от 150 до 3000 п.н. (рис. 3, 4). В целом учитывали 452 амплифи-цированных фрагмента. В результате для каждого из анализируемых образцов были идентифицированы индивидуальные RAPD-спектры амплифицированных фрагментов ДНК.
Для геномов представителей трибы Vicieae был определен мономорфный фрагмент с подвижностью 1000 пар оснований (OPH61000), который присутствовал в спектрах всех изученных видов и один фрагмент с подвижностью 1800 пар оснований (OPH61800), характерный для видов Lens, Pisum, Vicia [15]. Воспроизводимость на уровне 300-2000 п. н. была практически 100% , за исключением ряда минорных фрагментов, которые не учитывали при подсчете.
Были установлены фрагменты специфичные для некоторых секций Lathyrus. Для ряда видов чины были получены мономорфные видоспецифичные ампликоны, которые могут служить в качестве видоспецифичных маркеров. Всего было получено 40 видоспецифич-ных фрагментов.
Данные по 45 образцам - представителям 44 видов четырех родов были представлены в виде матрицы состояний бинарных признаков, в которых наличие или отсутствие в RAPD-спектрах одинаковых по размеру ампликонов рассматривалось как состояние 1 и 0 соответственно. На основе матрицы 452 полиморфных фрагментов ДНК построена единая обобщающая дендрограмма (рис. 5).
На дендрограмме все роды трибы не образуют четких клад, однако ряд видов, в частности, Vicia faba L., Vicia ervilia и др., формируют самостоятельные ветви, что говорит о возможности выделения их в самостоятельные таксоны (роды) и что имеет подтверждение в длительной истории их классификации.
Виды Pisum elatius (Bieb.) Aschers et Graebn. и P. sativum L. характеризуются бутстреп поддержкой 100%, что показывает их большое родство и ставит под сомнение правомерность возведения в ранг вида P. elatius разновидности посевного гороха P. sativum subsp. elatius [16]. Прояснились некоторые вопросы структуры секций рода. Более или менее четко дифференцированными оказались группы, соответствующие секциям: Cicercula (Medik.) Gren et Godr., Clymenum (Miller) Dumort, Eulathyrus Ser., Aphaca (Miller) Dumort, Pratensis Bassler, Linearicrpus Kupicha, Nissolia (Miller) Dumort. Эта дифференциация в целом соответствует используемой нами и наиболее принятой в мире системе [17], за исключением одного принципиального разногласия, о котором мы писали ранее: необоснованности включения нутовидных чин из секции Cicercula в секцию Lathyrus [18, 19]. Виды секции Orobus (L.) Gren et Godr. не образуют единой клады и представлены самостоятельными ветвями, что свидетельствует об их особом статусе и возможной неправомерности включения их в род Lathyrus. Кроме того, полученные данные выявили значительную разнородность оробоидных видов чин и вик, что ставит под сомнение точку зрения А.К. Станкевич [20] и целого ряда ученых, объединяющих их в самостоятельный род Orobus L.
Проведенный нами анализ подтвердил близость видов L.articulatus и L.clymenum (на кладограмме бутстреп индекс равен 79%), но позволил усомниться в их объединении [17, 21] в один вид, и встать на позиции авторов, признающих самостоятельность L. articulatus [22-24] (рис. 5, 6).
Таким образом, в итоге проведенного исследования показана возможность идентификации, как отдельных образцов, так и видов трибы Виковых с помощью RAPD анализа (рис. 3, 4, 6). Мономорфные, специфические и воспроизводимые RAPD фрагменты могут быть использованы в качестве маркеров некоторых видов и секций.
Следует отметить, что целый ряд вопросов стематике трибы Vicieaе и не может быть детализации статуса и определения объема решен на основе полученных в настоящем родов по-прежнему остается спорным в си- исследовании данных.
Рис. 5. Дендрограмма, полученная на основе сравнительного анализа 452 полиморфных амплифицированных ЯДРО фрагментов 45 представителей 44 видов трибы Vicieae.
Заключение
ЯЛРБ-анализ показал себя как надежный метод генотипирования образцов коллекций генетических ресурсов растений и может быть использован для разных целей: оптимизации работы с коллекцией генетических ресурсов
растений; определения уровня внутривидового разнообразия; классифицирования образцов по типам использования; уточнения таксономического статуса образцов и выявления филогенетических связей.
Рис. 6. Электрофоретические спектры ЯЛРБ фрагментов 2 образцов Ь. gloeospermus. (1,2); 5 образцов ЬаИугт агйсиШш Ь. (3-7), 7 образцов Ь. с1утепит Ь. (8-14), 4 образцов Ь. аркаса Ь. (15-18) (праймер ОРК09). М - маркер молекулярной массы SmartЬader 1700-02 (Нидерланды).
1-И-593734 (Сирия), 2 - И-593823 (Сирия), 3 - к-1369 (Марокко), 4 - к-1375 (Венгрия), 5 - к-1417 (Австралия), 6 - к-1439 (Португалия), 7 - к-1791 (о.Крит), 8 - к-1370 (Болгария), 9 - к-1371 (Германия), 10 - к-1374 (Чехословакия), 11 - к-1430 (Австралия), 12 - к-1431(Португалия), 13 - к-1663 (Греция), 14 - к-1792 (о.Крит), 15 - к-1293 (Индия), 16 - к-1603 (Азербайджан), 17 - к-1606 (Афганистан),18 - к-1673 (Краснодарский кр.).
Выявленный нами различный уровень внутривидового разнообразия генома у целого ряда видов в сопоставлении с их фенотипи-ческим разнообразием и агрономической ценностью может служить ценным ориентиром для использования коллекционных образцов
в селекции. Полученные данные о геномном полиморфизме образцов коллекции пополнили паспортные базы данных.
Работа частично поддержана грантами РФФИ 06-04-48869-а, 09-04-00574-а.
Список использованных источников
1. Генетическая дифференциация евразийского подвида мягкой пшеницы по данным RAPD-анализа / П. П. Стрельченко [и др.] // Аграрная Россия. - 2002. - № 3. - С.11-24.
2. Использование метода RAPD анализа в определении генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Lycopersicon (Toum.) Mill. / Е.З. Кочиева [и др.] // Генетика. - 2002. - Т. 38. - № 6. - С. 874-880.
3. Перчук, И.Н. Изучение видового разнообразия овса с использованием RAPD -анализа / И.Н. Перчук, И.Г. Лоскутов, К. Окуно
// Аграрная Россия. - 2002. - № 3. - С.43-44.
4. Род Бупп§а: молекулярное маркирование видов и сортов /Е. З. Кочиева [и др.] // Генетика. - 2004. - Т. 40. - № 1. - С. 37-40.
5. Гостимский, С.А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров / С. А. Гостимский, З. Г. Кокаева, Ф. А. Коновалов // Генетика. -2005. - Т. 41. - № 4. - С. 480-492.
6. Лемеш, В. А. ЯЛРО-анализ межвидового полиморфизма льна (род Ьтит) / В.А. Лемеш, М.В. Шут, Л.В. Хотылева. // Информ. Вестн.
ВОГиС. - 2005. - Т. 9. - № 4. - С. 490-494.
7. Малаева, Е.В. Использование RAPD молекулярных маркеров для решения вопросов систематики дальневосточных видов актинидии / Е.В. Малаева [и др.] // Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века: РБО, XII съезд. - Петрозаводск, 2008. - Ч. 1. - С. 47-49.
8. Горюнова, С. В. Молекулярный анализ филогенетических отношений диплоидных видов эгилопса секции Sitopsis / С.В. Горю-нова, Н.Н. Чикида, Е.З. Кочиева // Генетика. - 2008. - Т. 44. - № 1. - С. 137-141.
9. Перчук, И.Н. Генетическое разнообразие скандинавских сортов овса посевного из коллекции ВИР / И.Н. Перчук, И.Г. Лоскутов // Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века: РБО, XII съезд. - Петрозаводск, 2008. -Ч.1. - С. 58-59.
10. Рыжова, Н. Н. RAPD анализ геномного полиморфизма представителей семейства Lemnaceae / Н.Н. Рыжова, Е. З. Кочиева, К. Г. Скрябин // Генетика. - 2008. Т. 44. - № 3. -С. 360-364.
11. Edwards, S.K. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analyses / S. K. Edwards, C. Johonstone, C. Thompson // Nucleic Acids Res. - 1991. -V. 19. - N 6. - P. 1349.
12. Nowosielski, J. Molecular research on the genetic diversity of polish varieties and landraces of Phaseolus coccineus L. and Phaseolus vulgaris L. using the RAPD and AFLP methods. / J. Nowosielski, W. Podyma, D. Nowosielska //. Cell Mol. Biol. Letters. - 2002. - № 7. - P. 753-762.
13. Буравцева, Т.В. Выявление дублетных образцов в коллекции фасоли ВИР с помощью RAPD-анализа / Т. В. Буравцева, Н. В. Алпатьева // Материалы II Вавиловской меж-дунар. конференции «Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы», Санкт-Петербург, 26-30 ноября 2007 г. / ВИР - Санкт-Петербург, 2007. - С. 428-429.
14. Diversity within Pisum sativum using
protein- and PCR-based markers / A. Baranger [et al.] // Theor. Appl. Genet. - 2004. - Vol. 108, № 7. - P. 1309-1321.
15. RAPD - анализ видового полиморфизма. рода Чина Lathyrus L. семейства Fabaceae Lindl. / М. А. Вишнякова [и др.] // Информ. вестн. ВОГиС. 2008. - Т. 12, № 4. С. 7-25.
16. Федотов, В. С. Горох. / В.С. Федотов. М., 1960. - 259 с.
17. Kupicha, F. K. The infrageneric structure of Lathyrus L. / F. K. Kupicha // Notes from the Royal Botanic Garden.- Edinburg. - 1983. -V. 41. - N 2. - P. 209-244.
18. Молекулярные подходы к решению вопросов филогении и систематики рода Lathyrus L. / М.О. Бурляева [и др.] // Материалы 4-ой Междунар. науч. конф. «Биологическое разнообразие. Интродукция растений», Санкт-Петербург, 5-8 июня 2007 г. / Санкт-Петербург, 2007. - С. 25-26.
19. Molecular-phylogenetic study of tribe Vicieae (Adans.) Bronn family Fabaceae Lindl. / M.O. Burlyaeva [et al.] // 6-th European Conference on Grain Legumes, Lisbon, Portugal. - 2007. - Р. 249.
20. Станкевич, А. К. Культурная флора. Вика. /А. К. Станкевич, С. И. Репьев; под ред. С.И. Ре-пьева. - С.-Петербург: ВИР, 1999. - 490 с.
21. Asmussen, C.B. Chloroplast DNA character s, phylogeny, and classification of Lathyrus (Fabaceae) / C.B. Asmussen, A. Liston // Am. J. Bot. - 1998. - V. 85. - P. 387-401.
22. Чефранова, З. В. Род Lathyrus L. / З.В. Чеф-ранова // Ред. Федорова А. А. - Л.: Флора Европейской части СССР, 1987. - Т. 6. - С. 147-172.
23. Systematic relationships in Lathyrus sect. Lathyrus (Fabaceae) based on ampliphied fragment polymorphism (AFLP) data / A. Badr [et al.] // Can. J. Bot. - 2002. - V. 80. -P. 962-969.
24. Бурляева М.О. Об объеме вида L. clymenum L. (Fabaceae). // Сборник трудов международной конференция памяти Е. Н. Синской. «Генетические ресурсы культурных растений». Санкт-Петербург. 9-11 декабря 2009, - С. 156-159.
Дата поступления статьи 229 апреля 2011 г.
