CC BY
33
5 Выявление генетических и серологических
маркеров парвовируса В19 в производственных пулах плазмы для фракционирования
ï
jS Филатова Е.В., Зубкова Н.В., Анастасиев В.В.
Филиал ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России в г. Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио», г. Нижний Новгород
§ Identification of genetic and serological
markers of parvovirus B19 in the production pools of plasma for fractionation
Filatova E.V.,Zubkova N.V., Anastasiev V.V.
Nizhny Novgorod branch of the Federal State Unitary Enterprise "Scientific Production Association "Microgen" of the Ministry of Health of Russia-"Nizhny Novgorod plant for the production of bacterial preparations "ImBio", Nizhny Novgorod
Определена частота выявления генетических и серологических маркеров парвовируса В19 (B19V) в производственных пулах плазмы для фракционирования отечественных производителей препаратов крови. ДНК B19V обнаружена в 79,49% пулов, при этом в 36,56% случаев вирусная нагрузка превышала установленный для B19Vуровень инфекционности, равный 104 копий/мл. Среди ДНК-негативных пулов вирусспецифические антитела выявлены в 29,17% случаев. ДНК-позитивные пулы с концентрацией вирусного генома менее 104 копий/ мл и более 104 копий/мл содержали антитела к B19Vв 54,24 и 32,35% случаев соответственно. Средний уровень антител во всех серопозитивных пулах был примерно одинаковым и составил 8,25 МЕ/мл (95% CI (7,50-20,00) МЕ/мл).
Ключевые слова: парвовирус В19, плазма для фракционирования, препараты крови. Библиографическое описание: Филатова Е.В.,Зубкова Н.В., Анастасиев В.В. Выявление генетических и серологических маркеров парвовируса В19 в производственных пулах плазмы для фракционирования/биопрепараты. 2013. № 2. С. 28-31.
The article provides data concerning the frequency of detection of genetic and serological markers of parvovirus B19 (B19V) in the production pools of plasma for fractionation produced by domestic manufacturers of blood products. DNA of B19V is detected in 79.49% of pools, while in 36.56% of cases the viral load exceeded the established level of B19V infectivity, equal to 104 copies/ ml. Among the DNA-negative pools negative virus specific antibodies are identified in 29.17% of cases. DNA-positive pools with virus genome concentration less than 104 copies/ml and more than 104 copies/mL contained antibodies to B19V in 54.24 and 32.35% cases respectively. The average antibody level in all seropositive pools was approximately the same and equaled 8.25 lU/ml (95% CI (7,50-20,00) lU/ml).
Key words: Parvovirus B19, plasma for fractionation, blood products.
Bibliographic description: Filatova E.V., Zubkova N.V., Anastasiev V.V. Identification of genetic and serological markers of parvovirus B19 in the production pools of plasma for fractionation// Biopreparation (Biopharmaceuticals). 2013. № 2. P. 28-31.
Для корреспонденции:
Филатова Е.В. - старший микробиолог отделения производства диагностикумов гепатита В Филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио» Адрес: 603950, г Н. Новгород, ул. Грузинская, 44 e-mail: hbsantigen@yandex.ru
Статья поступила 05.04.13, принята к печати 22.05.20013 г
ПРЕПАРАТЫ
Препараты, получаемые из плазмы крови, могут быть потенциально опасны в отношении передачи возбудителей инфекционных заболеваний. Спектр гемо-трансмиссивных агентов постоянно расширяется, и в настоящее время большое внимание в развитых странах в рамках обеспечения безопасности крови и дериватов уделяется парвовирусу В19 (B19V).
B19V является широко распространенным этиологическим агентом парвовирусной инфекции, характеризующейся разнообразными клиническими проявлениями: от бессимптомного течения до тяжелых анемий и мертворождения. Вирусспецифические антитела выявляются у детей в возрасте от 1 года до 5 лет в 2-15% случаев, в возрасте от 6 до 19 лет - в 15-60% случаев, у взрослого населения - в 30-60% и свыше 80% - у людей 75 лет и старше [6].
Обследование доноров на маркеры B19V не является обязательным. Однако эпидемиологические исследования показали, что частота обнаружения ДНК В19V в крови доноров составляет 0,03-1,3% [1, 8], что представляет потенциальный риск контаминации производственных загрузок при пулировании плазмы от сотен-тысяч доноров для промышленного получения препаратов крови.
Цель настоящей работы заключалась в определении частоты выявления генетических и серологических маркеров парвовируса В19 в производственных пулах плазмы для фракционирования отечественных производителей препаратов крови.
Материалы и методы
Образцы производственных пулов (=117), состоящих из 1000 и более индивидуальных донаций, полученные от трёх отечественных производителей препаратов крови, исследовали методами ИФА и ПЦР на маркеры парвовируса В19.
70,00 %
Выявление и оценку количественного содержания специфических антител класса G (IgG) к B19V осуществляли методом ИФА с помощью тест-системы «RIDASCREEN Parvovirus IgG» (R-Biopharm AG, Германия) в соответствии с инструкцией по применению. Тестирование на ДНК B19V проводили методом ПЦР с использованием набора реагентов для выявления и количественного определения ДНК B19V «АмплиСенс Parvovirus B19-FL» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией производителя с помощью прибора «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия). Предварительно вирусную ДНК экстрагировали с применением комплекта реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).
Статистическую обработку данных проводили с применением программного обеспечения Microsoft Excel.
Результаты и обсуждение
Для оценки частоты выявления генетических и серологических маркеров B19V в производственных пулах плазмы для фракционирования протестировано 117 образцов котловых загрузок трех отечественных производителей препаратов крови. Выявлено 93 пула (79,49%), содержащих ДНК B19V, при этом частота обнаружения контаминированных пулов плазмы варьировала от 66,66 до 83,33% в зависимости от производителя. Полученные данные согласуются с результатами других исследователей, сообщивших, что частота контаминации котловых загрузок составляет от 56 до 100% [7, 10, 11].
Согласно рекомендациям Управления по надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и Европейской фармакопеи производственные пулы плазмы для фракционирования не должны содержать ДНК B19V в концентрации, превышающей уровень ин-
03
о &
с
о
со &
®
т s
о
60,00 %
50,00 %
40,00 %
30,00 %
20,00 %
10,00 %
0,00 %
менее 104 104-105 105-106 106-107 107-108
Концентрация ДНК ВЮТ, копий/мл
Рис. 1. Распределение производственных пулов плазмы в зависимости от концентрации ДНК B19V.
фекционности, равный 104 копий/мл [5, 14]. В связи с этим на следующем этапе работы в идентифицированных ДНК-позитивных производственных пулах был определен уровень вирусной нагрузки. Распределение исследуемых пулов плазмы в зависимости от концентраций ДНК B19V представлено на рис. 1.
Установлено, что в 34 ДНК-позитивных производственных пулах (36,56% от количества контаминиро-ванных пулов) вирусная нагрузка превышала установленный для B19V уровень инфекционности, при этом в 9,69% случаев концентрация ДНК B19V составила более 106 копий/мл и в 5,38% случаев - более 108 копий/ мл.
Полученные данные согласовывались с результатами аналогичных исследований, выполненных в других странах, согласно которым 47% производственных пулов содержали ДНК B19V в концентрации более 104 копий/мл, из них в 10-30% случаев уровень вирусной нагрузки превышал 106 копий/мл, а в 5% случаев -108 копий/мл [11, 13, 15].
Таким образом, выявлена потенциальная инфекци-онность плазмы для фракционирования, являющейся исходным материалом для получения препаратов крови, однако присутствие в пулах вирусспецифических антител является положительным фактором, обеспечивающим снижение этого риска [5].
Для определения вирусспецифических IgG в котловых загрузках все образцы, в зависимости от содержания ДНК B19V, были разделены на 3 группы:
- группа I: ДНК-негативные (п=24);
- группа II: ДНК-позитивные с концентрацией ДНК B19V менее 104 копий/мл (n=59);
- группа III: ДНК-позитивные с концентрацией ДНК B19V более 104 копий/мл (n=34).
В группе I было выявлено 29,17% серопозитивных пулов, в группах II и III - 54,24 и 32,35% соответственно (рис. 2).
Средний уровень антител во всех серопозитивных пулах был примерно одинаковым и составил по данным наших исследований 8,25 МЕ/мл (95% CI (7,50-20,00) МЕ/мл). Modrof J. с соавторами при изучении распределения антител в производственных пулах определили средний уровень IgG к B19V, равный 33,00±9,00 МЕ/мл, с наименьшим содержанием 11,00 МЕ/мл [9]. В других работах были выявлены антитела к B19V в концентрации от 29,80±17,20 до 64,70±17,50 МЕ/мл [2, 4, 11], при этом ни в одном исследовании не было обнаружено серонега-тивных в отношении B19V пулов. Однако наличие в группе I производственных пулов, в которых антитела не были выявлены, согласуется с нашими данными по оценке частоты выявления и содержания вирусспецифических антител среди ДНК-негативных доноров. Установлено, что только у 29,7% доноров детектируются антитела к B19V в концентрации 27,52 МЕ/мл (95% CI (19,60-35,40) МЕ/мл [1], поэтому пулирование плазмы в процессе производства может привести к снижению содержания антител в пуле до недетектируемого уровня.
В ДНК-позитивных пулах (II и III группа) низкая концентрация IgG к B19V или наличие пулов, в которых антитела вообще не выявляются, вероятно, связано с образованием иммунных комплексов, которые препятствуют обнаружению антител методом ИФА [3].
Однако выявление свободных IgG к B19V в пуле не может указывать на полную нейтрализацию вируса в плазме. Классический механизм формирования иммунных комплексов предполагает полную нейтрализацию инфекционного агента только при условии существенного избытка антител. При равновесной же концентрации последних или, наоборот, при избытке инфекционного агента процесс нейтрализации, как правило, неэффективен, а образующиеся комплексы нестабильны. Так, по данным Bonvicini F. с соавторами., пулы плазмы с вирусной нагрузкой более 106 копий/мл являются инфекционными независимо от концентрации нейтрализующих
03
о &
с о со I-
U ®
т S
е;
о *
60
50
40
30
20
10
29,17%
lgG+ lgG-
32,35%
группа I
группа II
группа III
Рис. 2. Частота выявления антител к парвовирусу В19 в производственных пулах в зависимости от концентрации вирусного генома.
ПРЕПАРАТЫ
антител в пуле [2]. В проведенном нами исследовании такие пулы были выявлены в 13,95% случаев. Настораживает преобладание количества производственных загрузок, в которых антитела к B19V не выявлялись, при этом концентрация ДНК B19V в них превышала установленный уровень инфекционности. Этот факт повышает риск получения контаминированных парвовирусом В19 лечебных препаратов крови.
Несмотря на продолжающиеся дискуссии о целесообразности скрининга доноров на маркеры B19V, ведущие мировые производители препаратов крови с 2002 года начали добровольное тестирование на ДНК B19V [12]. Были разработаны нормативные акты, определяющие алгоритмы скрининга доноров, и определены группы риска реципиентов, которым допускается введение препаратов, только безопасных в отношении B19V [5].
Результаты, полученные в ходе настоящей работы, позволяют говорить о том, что проблема безопасности препаратов крови в отношении B19V существует и в России. Выявленная высокая частота контаминации производственных пулов B19V указывает на необходимость принятия адекватных мер, направленных на предотвращение возможности попадания вируса в конечный препарат, включая:
- расширение спектра вирусных маркеров, обязательных для тестирования донорской крови;
- организацию скрининговых исследований доноров на маркеры B19V;
- разработку алгоритма входного контроля плазмы для фракционирования на определение количественного содержания ДНК B19V для снижения вирусной нагрузки в производственных пулах до допустимого уровня.
Литература:
1. Филатова Е.В., Новикова Н.А., Зубкова и др. Выявление маркеров парвовируса В19 в образцах крови доноров//ЖМЭИ. 2010. № 5. С. 67-70.
2. BonviciniF., Gallinella G., Cricca M. et al. Molecular test-
ing for detection of in vitro infectivity of plasma pools contaminated with B19 virus //J. Med. Virol. 2004. V. 74, N. 2. P. 272-276.
3. Bredl S., Plentz A., Wenzel J.J. et al. False-negative se-
rology in patient with acute parvovirus B19 infection // J. Clin. Virol. 2011. V. 51, N. 2. P. 115-120.
4. Daly P., Corcoran A., Mahon B.P. and Doyle S. High-sen-
sitivity PCR detection of parvovirus B19 in plasma //
J. Clin. Microbiol. 2002. V. 40, N. 6. P. 1958-1962.
5. Groeneveld K. and J. van der Noordaa. Blood products
and parvovirus B19 // Neth. J. Med. 2003. V. 61, N. 5. P. 154-156.
6. Heegaard E.D. and Brown K.E. Human parvovirus B19 //
Clin. Microbiol. Rev. 2002. V. 15, N. 3. P. 485-505.
7. Koppelman M.H., Cuypers H.T., Emrich T., Zaaijer H.L.
Quantitative real-time detection of parvovirus B19 DNA in plasma // Transfusion. 2004. V. 44, N. 1. P. 97-103.
8. Lefrere J.J., Servant-Delmas A., Candotti D. et al. Per-
sistent B19 in immunocompetent individuals: implications for transfusion safety // Blood. 2005. V. 106, N. 8. P. 2890-2895.
9. Modrof J., Berting A., Tille B. et al. Neutralization of hu-
man parvovirus B19 by plasma and intravenous immunoglobulins // Transfusion. 2008. V. 48, N.1. P. 178186.
10. Saldanha J., Minor P. Detection of human parvovirus B19 DNA in plasma pools and blood products derived from these pools: implication for efficiency and consistency of removal of B19 DNA during manufacture //Br. J. Haematol. 1996. V. 93, N. 3. P.714-719.
11. Schmidt I., Blumel J., Seitz H. et al. Parvovirus B19 DNA in plasma pools and plasma derivatives // Vox. Sang. 2001. V. 81, N 4. P. 228-235.
12. Young N.S., Brown K.E. Parvovirus B19 // N. Eng. J. Med. 2004. V. 350, N. 6. P. 586-597.
13. ZaaijerH.L., Koppelman M.H.G.M, Farrington C.P. Parvovirus B19 viremia in Dutch blood donors // Epidemiol. Infect. 2004. V. 132, N. 6. P. 1161-1166.
14. Food and Drug Administration (FDA). Guidance for industry: Nucleic acid testing (NAT) to reduce the possible risk of human parvovirus B19 transmission by plasma-derivide products. 2009. http://www.fda.gov/ BiologicBloodVaccines/GuidanceComplianceRegula-torylnformation/Guidances/default.html
15. The European Agency for the Evaluation of Medicinal products. EMEA workshop on viral safety of plasma-derived medicinal products with particular focus on non-enveloped viruses. 2001. http://www.ema.europa. eu/docs/en_GB/document_library/Report/2009/11/ WC500015393.pdf
