Выявление ДНК Rickettsia raoultiiи Rickettsia sibirica в крови и ликворе пациентов в Западной Сибири Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Рудакова Светлана Анатольевна - д-р мед. наук, заведующий отделом ПОБЗ, главный научный сотрудник группы клещевых боррелиозов отдела ПОБЗ ОНИИПИ.

Петрова Юлия Александровна - младший научный сотрудник группы клещевых боррелиозов отдела ПОБЗ ОНИИПИ.

Любенко Анастасия Федоровна - канд. ве-терин. наук, старший научный сотрудник группы клещевых боррелиозов отдела ПОБЗ ОНИИПИ.

Кумпан Людмила Валерьевна - канд. мед. наук, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ОмГМУ, старший научный сотрудник лаборатории зоонозных инфекций отдела ПОБЗ ОНИИПИ.

Rudakova Svetlana Anatol'yevna - Doctor of Medicine, Head of the Department of NFBZ, Chief Researcher of the Tick-Borne Borreliosis Group at the department of SRIFHI.

Petrova Yulia Aleksandrovna - Junior Researcher of The Tick-Borne Borreliosis Group at the department of NFBZ, SRIFHI.

Lyubenko Anastasia Fiodorovna - Candidate Sc. {Veterinary}, Senior Research associate of the tickborne borreliosis group at the department of NFBZ, SRIFHI.

Kumpan Lyudmila Valer'yevna - Cand. Sc. {Medicine}, Associate Professor of OMGMU, Senior Researcher Associate of the Laboratory of Zoonotic of Infections at the Department of POBZ, SRIFHI.

УДК 579.61 ГРНТИ 34.25.29

ВЫЯВЛЕНИЕ ДНК RICKETTSIA RAOULTII И RICKETTSIA SIBIRICA В КРОВИ И ЛИКВОРЕ ПАЦИЕНТОВ В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ

Я.П. Иголкина, В.А. Рар, Т.И. Епихина, А.Ю. Тикунов, Е. И. Краснова1'2, В.В. Проворова12, Н.И. Хохлова12, М.В. Савельева12, Н.В. Тикунова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Россия, 630090, г. Новосибирск, пр. Ак. Лаврентьева, 8 1ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Российской Федерации, 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52 2ГБУЗ Новосибирской области «Городская инфекционная клиническая больница № 1» Россия, 630090, г. Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта РНФ № 15-14-20020

Методом двухраундовой ПЦР было проанализировано255образцов крови и 57 образцов ликвора от пациентов, госпитализированных в городскую инфекционную клиническую больницу № 1 города Новосибирска с признаками инфекционных заболеваний после присасывания клещей в период с апреля по август 2016 г. В образцах биоматериалов десяти пациентов была обнаружена ДНК риккетсий. Определенные нуклеотидные последовательности фрагментов гена gltA в образцах крови семи пациентов соответствовали последовательности Rickettsia sibirica, а в двух образцах крови и в одном образце ликвора - последовательности Rickettsia raoultii генотипа DnS14. Это первый случай выявления ДНК R. raoultii в образцах биоматериалов пациентов в Российской Федерации.

Ключевые слова: риккетсии, ликвор, R raoultii, ДНК.

REVEALING OF RICKETTSIA RAOULTII AND RICKETTSIA SIBIRICA DNA IN BLOOD AND CEREBROSPINAL FLUID IN THE PATIENTS OF WESTERN SIBERIA

© Я.П. Иголкина, В.А. Рар, Т.И. Епихина, А.Ю. Тикунов, Е. И. Краснова, В.В. Проворова, Н.И. Хохлова, М.В. Савельева, Н.В. Тикунова, 2016

Y.P. Igolkina, V.A. Rar, T.I. Epihina, A. Y. Tikunov, E.I. Krasnova1'2, V. V. Provorova12, N.I. Hohlova1,2, M. V. Savelieva12, N.V. Tikunova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS, Novosibirsk

Russia, 630090, Novosibirsk, pr. Ak. Lavrent 'eva, 8

Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk

Russia, 630091, Novosibirsk, Krasny prospekt, 52

2City Infectious Clinical Hospital № 1

Russia, 630090, Novosibirsk, pr. Lavrent 'eva, 8

In total, 255 blood and 57 cerebrospinal fluid samples from the patients, who were hospitalized to the City Infectious Clinical Hospital № 1 of Novosibirsk with infection symptoms after tick bites in April- August 2016, were examined on Rickettsia spp. presence. DNA of Rickettsia spp. was found in samples from ten patients by nested PCR. DNA of Rickettsia sibirica was detected in seven blood samples. DNA of Rickettsia raoultii sp. DnS14 was detected in two blood and one cerebrospinal fluid samples. This is the first report of detection of R. raoultii DNA in probes of blood and cerebrospinal cerebrospinal fluid of the patients after tick bites in Russia.

Keywords: rickettsiae, cerebrospinal fluid, R. raoultii, DNA.

Клещевые риккетсиозы - трансмиссивные инфекционные заболевания, переносимые иксодовыми клещами [1]. Основным регистрируемым клещевым риккетсиозом на территории Западной Сибири является сибирский клещевой тиф (СКТ), этиологическим агентом которого является Rickettsia sibirica [1, 2, 3]. Недавно на Алтае был лабораторно подтвержден случай риккетсиоза, вызванный Rickettsia heilongjian-gensis, являющейся этиологическим агентом дальневосточного клещевого риккетсиоза [4]. В последнее время стали появляться данные о возможной патогенности Rickettsia raoultii и Candidatus Rickettsia tarasevichiae, широко распространенных на территории Западной Сибири [8, 9, 11, 12]. ДНК R. raoultii была выявлена в крови пациентов с синдромом TIBOLA/ DEBONEL в Испании и в крови пациентов с сыпью в Китае, ДНК Candidatus R. tarasevichiae -в крови пациентов в Китае [5-7].

Цель работы - выявление и идентификация риккетсий в крови и ликворе пациентов, госпитализированных с симптомами инфекционных заболеваний после укусов клещами.

Материал и методы. Образцы крови и ликвора брали от пациентов, госпитализированных в апреле-августе 2016 г. с признаками инфекционных заболеваний после присасывания клещей. Кровь (объемом 5 мл) брали с использованием Вакуэт-пробирок с ЭДТА. Суммарную ДНК выделяли из 100 мкл ликвора и лейкоцитарной фракции крови с использованием наборов «Проба НК» (ДНК-технология, Москва) согласно инструкции. ДНК риккетсий выявляли методом двухраундовой ПЦР в при-

сутствии видоспецифичных праймеров из области гена gltA, как описано ранее [8].

Полученные продукты ПЦР были очищены с использованием GFX Columns (Amersham Biosciences, USA), нуклеотидные последовательности были определены с использованием ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) и проанализированы с помощью программы BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Результаты и обсуждение. У десяти из 255 пациентов в образцах биоматериалов была обнаружена ДНК риккетсий. Определенные нуклеотидные последовательности фрагментов гена gltA в образцах крови семи пациентов соответствовали последовательности R. sibirica (GenBank RSU59734), а в двух образцах крови и в одном образце ликвора - последовательности R. raoultii (табл.). При этом последовательности R. raoultii, выявленные в образце ликвора пациента № 3 и образце крови пациента № 7, имели стопроцентное сходство с последовательностью R. raoultii DnS14 (GenBank AF120028), выявляемой ранее в крови пациента и в клещах рода Dermacentor. Последовательность из образца крови пациента № 6 отличалась от последовательности R. raoultii DnS14 двумя заменами. У всех пациентов, в крови которых обнаружена ДНК R. sibirica, наблюдалось повышение температуры, у троих - сыпь и только у одного -первичный аффект. У пациентов, в образцах тканей которых выявлена ДНК R. raoultii, не наблюдалось таких типичных для клещевого риккетсиоза симптомов, как сыпь и первичный аффект; у всех пациентов наблюдалось лишь повышение температуры не выше 37,7 °С.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Симптомы заболеваний пациентов, в образцах тканей которых выявлена ДНК риккетсий

Таблица

№ пациента 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Возраст (лет) 36 60 нд 70 53 32 59 57 18 52

Пол Ж М Ж Ж М М М Ж Ж Ж

Дата укуса 24.04 22-23.04 нд 5.05 26-27.04 7.05 3.05 10-20.06 15-16.07 8.08

Время между

укусом и началом забо-

левания (дни) 7 9-10 нд 1 7-8 2 1 14 4-5 2

Температура + + нд + + + + + нд +

Сыпь + + нд - + - - - нд -

Увеличение

лимфоузлов + - нд - - - - - нд -

Первичный аффект + нд нд

Головная

боль - - нд - - - - + нд -

Место напа- Алтай-

дения клещей НСОс НСО нд НСО НСО НСО НСО НСО ский край НСО

Образец кровь кровь кровь ликвор кровь кровь кровь кровь кровь кровь

Результаты ПЦР R.sitf R.sib R.sib R.rao^ R.sib R.raou R.raou R.sib R.sib R.sib

Примечание: aR.sib - R. sibirica, 6R.raou - R. raoultii. сНСО - Новосибирская область. нд - нет данных.

Обсуждение. Клиническая картина клещевых риккетсиозов, вызванных разными видами риккетсий, как правило, схожа. Симптомы СКТ включают лихорадку, первичный аффект на месте укуса, сыпь, головную боль, увеличение лимфоузлов. Синдром TIBOLA/DEBONEL имеет схожую с СКТ симптоматику, но имеет свои особенности - практически у всех больных наблюдается увеличение затылочных и/или шейных лимфоузлов, сыпь выявляется редко [2].

В данной работе впервые в Российской Федерации ДНК R. raoultii была выявлена в образах крови и ликвора пациентов. Кроме того, в крови пациентов выявилась ДНК R. sibirica. Следует отметить, что не у всех пациентов с выявленной ДНК риккетсий наблюдалась типичная для клещевых риккетсиозов симптоматика. Известно что, на территории

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1.Рудаков Н.В. и др. Клещевой риккетсиоз и риккетсии группы клещевой пятнистой лихорадки в России. / Н.В. Рудаков, С.Н. Шпынов, И.Е. Самой-ленко [и др.] // Омск: ИЦ «Омский научный вестник». 2011. 232 с.

2.Рудаков Н.В., Самойленко И.Е., Рудакова С.А., Кумпан Л.В., Белан Ю.Б., Решетникова Т.А.,

Сибири в иксодовых клещах гораздо чаще молекулярными методами выявляется R. raoultii (в 43-50 % клещей рода Dermacentor), чем R. sibirica (в 12 % клещей Dermacentor nutalli) [11, 12].Тем не менее, до настоящего исследования R. raoultii у пациентов на территории РФ не выявлялась. В нашем исследовании в трех из десяти образцов, в которых была обнаружена ДНК риккетсий, выявлена R. raoultii, хотя чаще выявлялась R. sibirica. Следует отметить, что у всех трех пациентов с R. raoultii из клинических проявлений была только невысокая температура 37,2-37,70С.

Таким образом, поскольку риккетсиозы, вызванные R. raoultii, могут протекать без выраженных симптомов, число случаев заболеваний, вызванных этим возбудителем, может быть значительно больше.

REFERENCES

1. Rudakov N.V. i dr. Kleschevoy rikketsioz i rikketsii gruppy kleschevoy pyatnistoy lihoradki v Rossii. / N.V. Rudakov, S.N. Shpynov, I.E. Samoylenko [i dr.] // Omsk: ITs «Omskiy nauchny vestnik». 2011. 232 s.

2. Rudakov N.V., Samoylenko I.E., Rudakova S.A., Kumpan L.V., Belan Yu.B., Reshetnikova T.A., Shpynov S.N., Abramova N.V., Kolomeets A.N. O roli

Шпынов С.Н., Абрамова Н.В., Коломеец А.Н. О роли Rickettsia raoultii в эпидемиологии клещевых риккет-сиозов в России // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2015; 3: 17-21.

3.Рудаков Н.В., Шпынов С.Н., Самойленко И.Е., Кумпан Л.В., Коломеец А.Н., Абрамова Н.В., Решетникова Т.А., Околелова Н.А. Актуальные аспекты изучения Candidatus Rickettsia tarasevichiae. Эпидемиология и инфекционные болезни // Актуальные вопросы. 2015; 6: 14-19.

4. Granitov V. et al. New evidence on tick-borne rickettsioses in the Altai region of Russia using primary lesions, serum and blood clots of molecular and serological study. / V. Granitov, S. Shpynov, O. Beshlebova [et al.] // Microbes Infect. 2015. Vol. 17 (11-12). P. 862-865.

5.Jia N. et al. Human infections with Rickettsia raoultii, China / N. Jia, Y.C. Zheng, L. Ma [et al.] //Emerg Infect Dis. 2014. Vol. 20(5). P. 866-868.

6.Jia N. et al.Human infection with Candida-tus Rickettsia tarasevichiae./ N. Jia , Y.C. Zheng, J.F. Jiang [et al.] //N Engl J Med. 2013. Vol. 369 (12). P. 1178-1180.

7.Ibarra V.et al. Rickettsia slovaca infection: DEBONEL/TIBOLA. /V.Ibarra, J.A. Oteo, A. Portillo [et al.] // Ann N Y Acad Sci. 2006. Vol. 1078. P. 206-214.

8.Igolkina Y.P. et al. Genetic variability of Rickettsia spp. in Ixodes persulcatus/Ixodes trianguliceps sympatric areas from Western Siberia, Russia: Identification of a new Candidatus Rickettsia species. / Y.P.Igolkina,V.A.Rar, V.V.Yakimenko[et al.] // Infect Genet Evol. 2015. Vol. 34 P. 88-93.

9.Mediannikov O. et al. Rickettsia raoultii sp. nov., a spotted fever group rickettsia associated with Dermacentor ticks in Europe and Russia. / O. Medianni-kov, K. Matsumoto, I. Samoylenko[et al.] // Int J Syst-EvolMicrobiol. 2008. Vol. 58. P. 1635-1639.

10. Parola P.et al. Rickettsia slovaca and R. ra-oultii in tick-borne Rickettsioses. / P. Parola, C. Rovery, J.M. Rolain[et al.] //Emerg Infect Dis. 2009. Vol. 15. P. 1105-1108.

11. Rydkina E. et al. New Rickettsiae in ticks collected in territories of the former soviet union./ E.Rydkina, V. Roux, N.Rudakov [et al.] // Emerg Infect Dis. 1999.Vol. 5(6). P. 811-814.

12. Shpynov S. et al. Detection of members of the genera Rickettsia, Anaplasma, and Ehrlichia in ticks collected in the Asiatic part of Russia. / S. Shpynov, P.E. Fournier, N. Rudakov [et al.] //Ann N Y Acad Sci. 2006 Vol. 1078. P. 378-383.

13. Switaj K. et al. Spotted fever rickettsiosis caused by Rickettsia raoultii case report. / K. Switaj, T. Chmielewski, P. Borkowski[et al.] //PrzeglEpidemiol. 2012. Vol. 66. P. 347-350.

Ответственный автор - Иголкина Я.П., инженер лаборатории молекулярной микробиологии ИХБФМСОРАН, e-mail: igolkina@inbox.ru

Rickettsia raoultii v epidemiologii kleschevyh rikketsiozov v Rossii. Meditsinskaya parazitologiya i parazitarnye bolezni. 2015; 3: 17-21.

3. Rudakov N.V., Shpynov S.N., Samoylenko I.E., Kumpan L.V., Kolomeets A.N., Abramova N.V., Reshetnikova T.A., Okolelova N.A. Aktual'nye aspekty izucheniya Candidatus Rickettsia tarasevichiae. Epide-miologiya i infektsionnye bolezni. Aktual'nye voprosy. 2015; 6: 14-19.

4. Granitov V. et al. New evidence on tick-borne rickettsioses in the Altai region of Russia using primary lesions, serum and blood clots of molecular and serologi-cal study. / V. Granitov, S. Shpynov, O. Beshlebova [et al.] // Microbes Infect. 2015. Vol. 17 (11-12). P. 862-865.

5. Jia N. et al. Human infections with Rickettsia raoultii, China / N. Jia, Y.C. Zheng, L. Ma [et al.] //Emerg Infect Dis. 2014. Vol. 20(5). P. 866-868.

6. Jia N. et al.Human infection with Candidatus Rickettsia tarasevichiae./ N. Jia , Y.C. Zheng, J.F. Jiang [et al.] //N Engl J Med. 2013. Vol. 369 (12). P. 1178-1180.

7. Ibarra V.et al. Rickettsia slovaca infection: DEBONEL/TIBOLA. /V.Ibarra, J.A. Oteo, A. Portillo [et al.] // Ann N Y Acad Sci. 2006. Vol. 1078. P. 206-214.

8. Igolkina Y.P. et al. Genetic variability of Rickettsia spp. in Ixodes persulcatus/Ixodes trianguliceps sympatric areas from Western Siberia, Russia: Identification of a new Candidatus Rickettsia species. / Y.P.Igolkina,V.A.Rar, V.V.Yakimenko[et al.] // Infect Genet Evol. 2015. Vol. 34 P. 88-93.

9. Mediannikov O. et al. Rickettsia raoultii sp. nov., a spotted fever group rickettsia associated with Dermacentor ticks in Europe and Russia. / O. Medianni-kov, K. Matsumoto, I. Samoylenko[et al.] // Int J SystE-volMicrobiol. 2008. Vol. 58. P. 1635-1639.

10. Parola P.et al. Rickettsia slovaca and R. ra-oultii in tick-borne Rickettsioses. / P. Parola, C. Rovery, J.M. Rolain[et al.] //Emerg Infect Dis. 2009. Vol. 15. P. 1105-1108.

11. Rydkina E. et al. New Rickettsiae in ticks collected in territories of the former soviet union./ E.Rydkina, V. Roux, N.Rudakov [et al.] // Emerg Infect Dis. 1999.Vol. 5(6). P. 811-814.

12. Shpynov S. et al. Detection of members of the genera Rickettsia, Anaplasma, and Ehrlichia in ticks collected in the Asiatic part of Russia. / S. Shpynov, P.E. Fournier, N. Rudakov [et al.] //Ann N Y Acad Sci. 2006 Vol. 1078. P. 378-383.

13. Switaj K. et al. Spotted fever rickettsiosis caused by Rickettsia raoultii case report. / K. Switaj, T. Chmielewski, P. Borkowski [et al.] // PrzeglEpidemiol. 2012. Vol. 66. P. 347-350.

Responsible author - Igolkina Ya. P., Engineer of Laboratory of Molecular Microbiology at the Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS; e-mail: igolkina@inbox.ru