Выявление белка с регенеративной и остеоиндуктивной активностью в плаценте Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

УДК 612.398.145.3-611.013.85: 612.753

© А.А. Ларионов, А.В. Коханов, О.В. Мусатов, Д.Б. Суринков, А.А. Мяснянкин, И.С. Ямпольская, 2011

А.А. Ларионов1, А.В. Коханов1, О.В. Мусатов1, Д.Б. Суринков2, А.А. Мяснянкин2,

И.С. Ямпольская1

ВЫЯВЛЕНИЕ БЕЛКА С РЕГЕНЕРАТИВНОЙ И ОСТЕОИНДУКТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

В ПЛАЦЕНТЕ

1ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России 2ГБУЗ АО «Александро-Мариинская областная клиническая больница», г. Астрахань

По технологии выделения морфогенетических белков (КМБ) из костной ткани произведена обработка ткани плаценты. Выделены компоненты с остеоиндуктивной и регенераторной активностью. Изучаются их физико-химические и морфогенетические свойства на различных экспериментальных моделях. В плацентарной ткани установлено высокое содержание факторов роста, идентичных КМБ. В этой связи нами предлагается способ получения этих морфогенетических белков из более доступного сырья - плаценты.

Ключевые слова: плацента, костный морфогенетический белок, выделение, свойства.

A.A. Larionov, A.V. Kokhanov, O.V. Musatov, D.B. Surinkov, A.A. Myasnyankin, I.S. Yampolskaya

DETECTION OF PROTEIN WITH REGENERATIVE AND OSTEOINDUCTIVE ACTIVITY

IN PLACENTAL TISSUE

According to the technology selection of morphogenetic proteins in bone tissue produced by processing of the placenta. Components with osteoinductive and regenerative activity was isolated. Their physical, chemical and morphogenetic properties in various experimental models is studied. In the placental tissue is found high levels of growth factors that are identical to BMP. In this regard, we propose a method for obtaining these morphogenetic proteins in more affordable raw materials - the placenta.

Key words: placenta, bone morphogenetic protein, isolation, properties.

В настоящее время отмечается постоянно возрастающий спрос на остеоиндуктивные имплантаты и раневые покрытия, стимулирующие регенерацию поврежденных тканей: в России по данным центра Флебологии трофическими язвами разной степени выраженности, страдают более 4-х миллионов человек; ежегодно регистрируется около 20 миллионов травм [1]. Потенциальная потребность в композитных материалах только для травматологии составляет 220-500 тыс. единиц продукции в год. В последние годы за рубежом разработаны и получены так называемые костные морфогенетические белки (КМБ), часть из которых отличается мощными остеогенными свойствами и может быть использована в качестве заменителя аутокости [1].

В 1965 г. M.R. Urist [7] впервые сообщил о присутствии в деминерализованной костной ткани остеоген-ных белков, способных индуцировать остеогенез при эктопической пересадке. В дальнейших своих работах [8] он показал, что остеогенная активность кости передается через протеиноподобный компонент матрикса, названный костным морфогенетическим белком (КМБ). В 1979 г. M.R. Urist с соавторами [8] сообщили о выделении остеоиндуктивного, гидрофобного, низкомолекулярного белка из нерастворимого желатина костного матрикса. H. Nakamura с соавторами [6] применили метод диссоциативного экстрагирования КМБ из бычьего, свиного и человеческого костных матриксов, а также из остеосарком [5].

В НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН разработаны технологии синтеза рекомбинантных КМБ в бактериальных суперпродуцентах и планируется к 2013 г. создание нового производства рекомбинантного человеческого костного морфогенетического белка-2 (рчКМБ-2), а также имплантируемых материалов на его основе [2].

Имеются литературные данные о присутствии факторов роста, идентичных КМБ в других тканях организма [4]. В этой связи нами исследована возможность получения этих морфогенетических белков из более доступного сырья - плаценты.

Цель исследования: разработка нового метода получения препарата костного морфогенетического белка из плаценты человека.

Методика. Материалом для получения КМБ служили ткани плаценты общей массой 2,8 кг (6 плацент) и фрагменты трубчатых костей общей массой 2,1 кг.

Технология выделения и очистки КМБ из плаценты предполагала те же этапы, которые используются при выделении КМБ из костного материала. Параллельно по той же технологии получали КМБ из коровьих трубчатых костей и гомогенатов тканей печени людей, погибших от несчастных случаев. Концентрацию белка в растворе определяли спектрофотометрически по методу Варбурга. Остеоиндуктивную активность препаратов белка оценивали морфологическими методами по характеру эктопического остеосинтеза в местах имплантации коллагеновой губки, пропитанной препаратами морфогенетических белков. Репаративную регенерацию

в эксперименте на 5 кроликах оценивали по уровню альфа-фетопротеина (АФП) на моделях гепаторафии и гепатопластики, как описано нами ранее [3].

Костную муку и отмытые от крови ткани плаценты и печени гомогенизировали, обезжиривали смесью спирта и хлороформа и высушивали под тепловентилятором до полного удаления воды и органических растворителей. Дальнейшая схема получения КМБ из костной муки, порошка плацентарной и печеночной ткани включала следующие этапы: кислотная экстракция, лиофильная сушка, депротеинизация, диссоциация КМБ мочевиной в кислой среде и доочистка конечного продукта комбинацией хроматографических методов.

Результаты. Установлено, что до этапа хроматографической очистки содержание белка в препарате КМБ из 2 кг костной муки составило 3,4±0,20 мг, что достоверно ниже (р<0,001), чем в препаратах плаценты 96±14,5 мг или печени 114±9,6 мг.

Методами гель-фильтрации на биогелях с различным диаметром пор конечные продукты были распределены на пять фракций с диапазонами молекулярной массы до 1000 Да, 1-5, 5-20, 20-50 и свыше 50 КДа. В связи с отсутствием международного стандарта остеоиндуктивной активности КМБ, за 1 единицу активности нами принята активность белка с молекулярной массой 5-20 КДа, соответствующая литературным данным о массах данных пептидов [1, 4]. Остеоиндуктивная активность препаратов по всем пяти хроматографическим фракциям соответственно составила: для кости (0, 5%, 100%, 20% и 0), для печени (0, 0, 20%, 0 и 0) и для плаценты (0, 0, 75%, 20% и 0). Полученные нами данные подтвердили, что максимальной остеоиндуктивной активностью обладала третья хроматографическая фракция (5-20 КДа) конечного продукта.

Стимулирующим влиянием на процессы репаративной регенерации в эксперименте обладали в различной степени все изученные фракции плаценты и печени: больше всего - третья (5-20 КДа) и пятая (термо- и кислотостабильные белки с массой более 50 КДа) фракции плаценты (различия статистически достоверны при р<0,001 как со фракциями препаратов КМБ из кости и печени, так и фракциями плаценты 1, 2 и 4). Уровни АФП в крови оперированных кроликов на 3 сутки после введения каждой из 5 хроматографических фракций соответственно составили: для кости (0 мкг/мл; 0 мкг/мл; 1,0±0,89 мкг/мл; 0 мкг/мл; 0 мкг/мл), для печени (0 мкг/мл; 2,0±1,02 мкг/мл; 6,0±0,89 мкг/мл; 3,0±1,02 мкг/мл; 5,0±1,41 мкг/мл) и для плаценты (0 мкг/мл; 7,0±1,02 мкг/мл; 16,0±2,19 мкг/мл; 7,0±3,03 мкг/мл; 11,0±0,45 мкг/мл).

Известно, что кроме участия в формировании опорно-двигательной системы, КМБ из семейства цитоки-нов играют роль в управлении дифференцировкой и пролиферацией эпителиальных стволовых клеток — как во взрослом организме, так и в эмбриогенезе. Поэтому, получение КМБ из плаценты и описание его свойств позволяет по-новому взглянуть на основополагающие механизмы регенерации кости как в теоретическом, так и в прикладном плане. Весьма успешные препараты, такие как рекомбинантный костный морфогенетический белок, приносят прибыль в миллиард долларов ежегодно (например, INFUSE ®, Medtronic), поэтому разработка способа получения аналога КМБ из плаценты и внедрение его в клиническую практику может стать эффективным элементом регенеративной медицины.

Таким образом, из ткани плаценты по технологии получения КМБ из костной муки, выделены факторы роста, обладающие остеоиндуктивной активностью и идентичные КМБ. Кроме того, в плацентарной ткани обнаруживается достоверно высокое по сравнению с другими органами содержание компонентов с регенераторной активностью, относящихся как к классу пептидов, так и белков.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Булатов А. А., Савельев В.И., Калинин А.В. Применение костных морфогенетических белков в эксперименте и клинике // Травматология и ортопедия России. - 2005. - № 1 (34). - С. 46-54.

2. Гинцбург А.Л., Зайцев В.В., Миронов С.П. [и др.] Экспериментальная оценка остеоиндуктивности рекомбинантного костного морфогенетического белка (rhBMP-2) отечественного производства, фиксированного на биокомпозиционном материале или костном матриксе // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. - 2010. - № 4. - С. 38-44.

3. Мусатов О.В., Коханов А.В., Луцева О. А., Медведев Р. А. Альфа-фетопротеин как маркер репаративной регенерации // Астраханский медицинский журнал. - 2008. - № 3 (прил.). - С. 34-35.

4. Aldinger G., Herr G., Kusswetter W. [et al.]. Bone morphogenetic protein: a review // Int. Orthop. - 1991. -Vol. 15, № 3. - P. 169-177.

5. Bauer F.C.N., Urist M.R. Human osteosarcoma derived soluble bone morphogenetic protein // Clin. Orthop. - 1981. - № 154. - P. 219-295.

6. Nakamura H., Higuchi Y., Nakagawa M. [et al.]. Solubilized bone morphogenetic protein (BMP) from mouse osteosarcoma and rat demineralized bone matrix // Clin. Orthop. - 1980. - № 148. - P. 281-290.

7. Urist M.R. Bone: formation by autoinduction // Science. - 1965. - Vol. 150. - P. 893-899.

8. Urist M.R., Mikulski A. , Lietz A. Solubilized and insolubilized bone morphogenetic protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1979. - Vol. 76. - P. 1828-1832.

Ларионов Александр Афанасьевич, доктор медицинских наук, профессор кафедры травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская 121, тел. (8512) 33-07-90, e-mail: larionov@mail.ru

Коханов Александр Владимирович, доктор медицинских наук, доцент кафедры биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская 121, тел. (8512) 52-51-64, e-mail: kokhanov@mail.ru

Мусатов Олег Валентинович, кандидат медицинских наук, докторант кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская 121, тел. (8512) 33-07-90

Суринков Дмитрий Борисович, врач-травматолог, ортопедическое отделение ГБУЗ АО «Александро-Мариинская областная клиническая больница», Россия, 414056, г. Астрахань, ул. Татищева 2, тел. (8512) 25-32-61

Мяснянкин Александр Алексеевич, врач-нейрохирург, нейрохирургическое отделение ГБУЗ АО «Александро-Мариинская областная клиническая больница», Россия, 414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 2, тел. (8512) 25-32-61

Ямпольская Ирина Сергеевна, врач акушер-гинеколог, заочный аспирант кафедры биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская 121.

УДК 611.225: 617.5-089.844 © Е.Д. Луцай, 2011

Е.Д. Луцай

ВНУТРИОРГАННАЯ МИКРОТОПОГРАФИЯ ГОРТАНИ ЧЕЛОВЕКА - ОСНОВА

МИКРОХИРУРГИИ ОРГАНА

ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

На 15 препаратах гортани, полученных от лиц зрелого возраста методами макромикроскопического препарирования, гистотопографии были изучены особенности микротопографии внутриорганных структур гортани человека на четырех уровнях: вход в гортань, преддверие гортани, голосовая щель и подголосовая полость. Описаны качественные и количественные топографо-анатомические взаимоотношения структур на этих уровнях.

Ключевые слова:гортань, микротопография.

E.D. Lutsai

INTRAORGANIC MICROTOPOGRAPHY OF HUMAN LARYNX - THE BASIS OF ITS MICROSURGERY

Peculiarities of microtopography of human larynx intraorganic structures on four levels: entrance to larynx, its vestibule, fissure of glottis and infraglottic cavity were studied on 15 preparations of larynx, got from the adult people with the help of histotopog-raphical methods and methods of macromicroscopical preparation. Qualitative and quantitative topographical interrelations of structures on these levels were described.

Key words: larynx, microtopography.

Злокачественные новообразования гортани человека составляют от 1 до 7% от всей онкопатологии, и частота их возникновения неукоснительно растет. Из их числа 60-80% опухолей локализуется в преддверии гортани. Прогноз и успешность лечения заболеваний гортани зависят не только от своевременности постановки диагноза, но и от выбора адекватного способа хирургического вмешательства. Эндоларингеальные микрохирургические операции впервые были начаты в1964 году [3]. На сегодняшний день бурное развитие методов эндоскопии и операционной микроскопии в оториноларингологии делает востребованными фундаментальные исследования по макромикроскопическому строению и внутриорганной микротопографии гортани в различных ее отделах [2, 5]. В литературе имеются сведения о взаимосвязи между распространением патологических процессов и особенностью соединительно-тканного каркаса гортани, ходом и локализацией крупных сосудов и нервов, особенностью слизистой оболочки органа [1, 4].

Цель исследования: выявить особенности макромикроскопического строения и внутриорганной микротопографии гортани у лиц зрелого возраста в четырех стандартных отделах: вход в гортань, преддверие гортани, голосовая щель, подголосовая полость.

Материалы и методы. Исследование было выполнено на 15 органокомплексах гортани с окружающими тканями, полученными от лиц мужского и женского пола без патологии. В исследовании были использованы методы: морфометрии, макромикроскопического препарирования, декальцинации, модифицированный метод распилов по Н.И. Пирогову, гистотопографический.

Результаты. На уровне входа в гортань спереди видно скопление волокон щитовидно-надгортанной связки и мышечные пучки одноименной мышцы. Волокна этой мышцы имеют четкое продольное направление. Пространство между волокнами заполнено жировой тканью с различной степенью выраженности. Сбоку видны образования неправильной формы - мешочки гортани. В верхней стенки встречается скопление лимфоидной ткани, которые в литературе описываются как «гортанные миндалины Френкеля» [2]. Артериальные сосуды в