CC BY
119
УДК 633.1:633.31/37:57.085.2
ВЫЯВЛЕНИЕ АВТОНОМНОСТИ ЗАРОДЫША ПШЕНИЦЫ КАК ЭТАП РАЗРАБОТКИ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ЗАСУХОУСТОЙЧИВЫХ ОБРАЗЦОВ
Н.Н. Круглова, д-р биол. наук, профессор,
ФГБУН Институт биологии Уфимского научного центра РАН, пр. Октября, 69, г. Уфа, Россия, 450054,
E-mail: Kruglova@anrb.ru
Аннотация. Одна из актуальных проблем современных селекционных исследований яровой мягкой пшеницы как основной хлебной культуры состоит в создании новых районированных засухоустойчивых сортов. Нами разрабатывается экспресс-диагностический биотехнологический подход к получению засухоустойчивых растений пшеницы на основе культивирования in vitro разновозрастных незрелых зародышей (эмбриокультура in vitro).
38
Пермский аграрный вестник №1 (5) 2014
В своем развитии зародыш проходит через ряд дискретных стадий, различающихся по морфофизиологическим процессам, функциональной нагрузке, продолжительности, значению для дальнейшего развития растения. Принципиальный этап разработки такой ускоренной биотехнологии - выявление стадии автономности зародыша. Каждая из стадий эмбриогенеза, несмотря на все разнообразие происходящих в это время процессов, направлена на реализацию как морфогенетического потенциала зародыша, так и онтогенетической программы особи в целом. Системный подход к дифференциации зародыша с учетом морфогенетических и морфофизиологических корреляций позволил выявить ряд критических стадий эмбриогенеза растений, во время которых закрепляется жесткая детерминация пути развития зародыша. По нашему мнению, культивирование автономных зародышей в условиях in vitro на селективной питательной среде, имитирующей дефицит влаги, позволит дать экспресс-оценку каждого вновь создаваемого сорта (первоначально - гибридной комбинации) пшеницы по устойчивости к стресс-фактору «засуха». Ускорение в данном случае достигается за счет того, что гибридная комбинация диагностируется на засухоустойчивость на самой ранней стадии онтогенеза -зародыше в стадии автономности, а не путем лабораторной оценки зрелого зерна или полевой оценки растения, как это принято в рутинной селекционной практике.
Ключевые слова: биотехнология, культура in vitro, автономный зародыш, устойчивость к засухе, яровая мягкая пшеница, Triticum aestivum L.
Введение
Многочисленными исследованиями установлено, что развитие зародыша (эмбриогенез) представляет собой единый процесс, в результате которого из одной исходной клетки - зиготы - формируется зрелый зародыш, обладающий всеми морфогенетическими потенциями взрослого растения [1-3]. Вместе с тем, в своем развитии зародыш проходит через ряд дискретных стадий, различающихся по морфофизиологическим процессам, функциональной нагрузке, продолжительности, значению для дальнейшего развития растения. Каждая из стадий эмбриогенеза, несмотря на все разнообразие происходящих в это время процессов, направлена на реализацию как морфогенетического потенциала зародыша, так и онтогенетической программы особи в целом [4, 5].
Системный подход к дифференциации зародыша с учетом морфогенетических и морфофизиологических корреляций позволил выявить ряд критических стадий эмбриогенеза растений, во время которых закрепляется жесткая детерминация пути развития зародыша. Последовательные стадии развития зародыша рассматриваются как процесс, при котором в различные критические точки времени и пространства происходит переключение на альтернативные пути, а те или иные части организма становятся «детерминированными» в
отношении их дальнейшей дифференциации (по [7]). В целом зародыш демонстрирует свойства динамичной системы с пульсирующим характером функционирования своих элементов [6].
Одна из критических стадий эмбриогенеза растений - автономность зародыша как особое структурно-функциональное состояние развивающегося растительного организма, отражающее его способность к саморегуляции, независимость от окружающих тканей и проявляющееся в способности завершить нормальный эмбриогенез вне материнского организма. Автономность зародыша может рассматриваться как один из этапов автономи-зации онтогенеза, с которого зародыш (новый спорофит) переходит на относительно самостоятельный путь развития [4].
Цель работы состояла в выявлении стадии автономности зародыша 10-ти гибридных комбинаций яровой мягкой пшеницы для дальнейшей разработки биотехнологии получения засухоустойчивых образцов. В экспериментальных условиях эмбриокультуры in vitro с использованием безгормональной питательной среды показано, что стадии автономности соответствует сформированный зародыш (20 суток после опыления, длина 2,1-
2,2 мм), характеризующийся наличием всех типичных для зародышей злаков органов.
Методика
Объектом исследования послужили 10 новых гибридных комбинаций яровой мягкой пшеницы поколения F1, полученных в лаборатории селекции яровой пшеницы Селекционного центра по растениеводству ГНУ «Башкирский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии» (г. Уфа): Боевчанка х Ирень, Л42938 х Салават Юлаев, Дуэт х Башкирская 28, Э43018 х Ту-лайковская золотистая, Л42809 х Л42866, Л42875 х Экада 70, Башкирская 26 х Экада 70, Л42875 х 76/98a, Воронежская 16 х Л42833, Боевчанка х Башкирская 26. Семена для исследования предоставлены согласно договору о творческом сотрудничестве на 2011-2015 гг. Донорные растения, выращенные в полевых условиях на экспериментальных участках научного стационара Института биологии Уфимского НЦ РАН (Уфимский район), срезали на 2.5-20.0-е сутки после искусственного опыления.
Использовали метод фенологических наблюдений за сезонным ритмом роста и развития растений пшеницы в полевых условиях [8], метод эмбриокультуры in vitro яровой мягкой пшеницы с учетом оригинальных методических эмбриологических и физиологических нюансов [9, 10].
Стадию автономности выявляли по способности зародышей, изолированных на последовательных стадиях эмбриогенеза, завершить эмбриогенез, дать нормальные проростки в условиях in vitro на безгормональной среде [4] и сформировать из таких проростков полноценные фертильные растения в условиях ex vitro [11]. Культивируемые зародыши размещали щитком вниз на индукционную питательную среду, составленную по прописи [12], без добавления гормонов. Культивирование проводили в темноте, при температуре +26°С.
Цито-гистологический анализ зародышей, зафиксированных через каждые 0.5 суток после искусственного опыления, вели согласно методикам, модифицированным применительно к биотехнологическим исследованиям
[13]. Препараты просматривали и фотографировали при помощи микровизора проходящего света ^VIZ0-103 (ОАО «ЛОМО», г. Санкт-Петербург).
Результаты
Для культивирования in vitro использовали незрелые зародыши, изолированные после искусственного опыления на следующих стадиях эмбриогенеза (по периодизации [14]): четырехклеточный зародыш (2.5 суток после опыления, длина зародыша у различных гибридных комбинаций колеблется от 0,12 до 0,14 мм); многоклеточный зародыш (4.0 суток после опыления, длина зародыша у различных гибридных комбинаций колеблется от 0,15 до 0,2 мм); органогенез в трех подстадиях: под-стадия 1 (8.0 суток после опыления, длина зародыша у различных гибридных комбинаций колеблется от 0,4 до 0,6 мм), подстадия 2 (12.0 суток после опыления, длина зародыша у различных гибридных комбинаций колеблется от 0,8 до 1,3 мм), подстадия 3 (17.0 суток после опыления, длина зародыша у различных гибридных комбинаций колеблется от 1,5 до 2,0 мм); сформированный зародыш (20.0 суток после опыления, длина зародыша у различных гибридных комбинаций колеблется от 2,1 до
2,2 мм).
Анализ полученных экспериментальных данных свидетельствует о следующем. Культивирование in vitro зародышей, инокулиро-ванных на стадиях четырехклеточного и многоклеточного зародыша, на подстадии 1 стадии органогенеза, к ответной реакции зародышей не приводило, и такие зародыши постепенно дегенерировали. При культивировании in vitro, зародышей, инокулированных на подстадии 2 стадии органогенеза, через 5-7 суток культивирования наблюдали формирование неморфогеных обводненных каллусов желтоватого цвета, неопределенной формы, рыхлой мягкой консистенции, постепенно дегенерировавших. Культивирование in vitro зародышей, инокулированных на подстадии 3 стадии органогенеза, приводило к формированию через 5-7 суток морфогенных каллусов
плотной компактной консистенции, матового желтовато-белого цвета, узловатой формы. Зародыши, инокулированные на стадии сформированного зародыша, после 10-12 суток культивирования in vitro давали начало проросткам, из которых далее, после переноса на среду для регенерации и в почвенные условия ex vitro, формировались нормальные фертильные растения.
Таким образом, автономным следует считать сформированный зародыш, имеющий определенный уровень эндогенных регуляторов роста, обеспечивающих его дальнейшее нормальное прорастание. Согласно цито-гистологическим данным, такой зародыш характеризуется наличием всех типичных для зародышей злаков органов: щиток (семядоля), лигула, колеоптиль, колеориза, эпибласт, дифференцированная почечка, состоящая из апекса побега и зачатков первого, второго и третьего листьев, зародышевый корень с корневым чехликом. Со стороны щитка зародыш
окружен эндоспермом.
Такие результаты получены для незрелых зародышей всех изученных гибридных комбинаций.
Выводы
На основании культивирования in vitro разновозрастных незрелых зародышей 10-ти гибридных комбинаций яровой мягкой пшеницы установлено, что стадии автономности соответствует сформированный зародыш (20.0 суток после опыления, длина 2,1-2,2 мм), характеризующийся наличием всех типичных для зародышей злаков органов. Такие автономные зародыши могут быть использованы для разработки экспресс-диагностической биотехнологии получения засухоустойчивых образцов.
Работа выполнена при поддержке гранта по программе фундаментальных исследований Отделения биологических наук РАН «Биологические ресурсы России: динамика в условиях глобальных климатических и антропогенных воздействий» (2012-2014 гг.) и гранта по программе «Ведущие научные школы России» (No. НШ-5282.2014.4, лидер - член-корр. РАН Т.Б. Батыгина).
Литература
1. Круглова Н.Н. Оценка коллекции генотипов яровой мягкой пшеницы по устойчивости автономных зародышей in vitro на селективных средах, имитирующих засуху // Известия Самарского НЦ РАН. 2012. Т. 16. No. 1. С. 2243-2245.
2. Круглова Н.Н. Лабораторная оценка регенерантов пшеницы, полученных в экспериментальной селективной эмбриокультуре in vitro // Пермский аграрный вестник. 2013. No. 1. С. 35-38.
3. Круглова Н.Н. Цитогенетический анализ регенерантов пшеницы, полученных в селективной эмбриокультуре in vitro // Вестник Башкирского государственного аграрного университета. 2013. No. 2. С. 16-18.
4. Батыгина, Т.Б. Хлебное зерно: Монография. Л.: Наука, 1987. 103 с.
5. Терёхин Э.С. Зародыш // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 2: Семя / Ред. Т.Б. Батыгина. СПб.: Мир и семья, 1997. C. 294-297.
6. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. Целесообразность системного подхода к проблеме дифференциации зародыша покрытосеменных растений // Онтогенез. 1983. Т. 14. No. 3. С. 304-311.
7. Ионова Е.В. Устойчивость сортов и линий пшеницы, ячменя и сорго к региональному типу засухи: Автореф. ... д-ра с.-х. наук. Краснодар, 2011. 48 с.
8. Челак В.Р. Система размножения пшеницы Triticum L. Кишинев: Штиинца, 1991. 320 с.
9. Круглова Н.Н., Сельдимирова О.А. Регенерация пшеницы in vitro и ex vitro: цито-гистологические аспекты. Уфа: Гилем, 2011. 124 с.
10. Круглова Н.Н. К вопросу об использовании эмбриокультуры in vitro пшеницы для биотехнологических целей // Достижения и проблемы генетики, селекции и биотехнологии: Сборник научных трудов. Т. 4. Киев: Логос, 2012. С. 542-546.
11. Круглова Н.Н. Выявление критической стадии автономности зародыша пшеницы в культуре in vitro // Известия Уфимского НЦ РАН. 2013. No. 1. С. 42-45.
12. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. N3. P. 473-497.
13. Световой микроскоп как инструмент в биотехнологии растений / Н.Н. Круглова, О.В. Егорова, О.А. Сельдимирова, Д.Ю. Зайцев, А.Е. Зинатуллина. Уфа: Гилем, 2013. 128 с.
14. Круглова Н.Н. Периодизация эмбриогенеза пшеницы как методологический аспект биотехнологических разработок // Известия Уфимского НЦ РАН. 2012. No. 1. С. 56-61.
DISCOVERY OF THE WHEAT EMBRYO AUTONOMY AS A STAGE OF ELABORATION OF EXPRESS-DIAGNOSTICAL BIOTECHNOLOGY FOR OBTAINING DROUGHT-RESISTANT SAMPLES
N. N. Kruglova, Dr. Bio.Sci.
Ufa Research Centre RAS Institute of Biology, Ufa, Russia E-mail: Kruglova@anrb.ru
ABSTRACT
In its development, the embryo passes through a series of discrete steps, differing morphophysiological processes, functional load, duration, value for the further development of the plant. Principal stage of accelerated development of such biotechnology is identifying autonomy stage of embryo. Each of the stages of embryogenesis, despite all the diversity occurring at this time of processes aimed at the implementation of the morphogenetic potential of the embryo as well as the developmental program individuals in general. Systematic approach to differentiation of the embryo, taking into account the correlation of morphological and morphogenetic revealed a number of critical stages of embryogenesis of plants, during which rigid determination of the development of the embryo is being fixed.
The purpose of the work consisted of the detection of the embryo autonomy stage in 10 hybrid combinations of spring soft wheat to the further elaboration to obtain drought-resistant samples. In the experimental conditions of embryo culture in vitro by using the hormone-free nutrition medium it was shown that the formed embryo (20 days after pollination, 2.1-2.2 mm of length) characterized by availability of all typical cereal embryo organs is in keeping with the stage of autonomy.
Key words: biotechnology, culture in vitro, embryo autonomy, drought-resistant, spring soft wheat, Triticum aestivum L.
References
1. Kruglova N.N. Otsenka kollektsii genotipov yarovoi myagkoi pshenitsy po ustoichivosti avtonomnykh zarodyshei in vitro na selektivnykh sredakh, imitiruyushchikh zasukhu (Assessment of spring soft wheat genotypes collection according to resistance of autonomus embryos in vitro upon selective media imitating drought), Izvestiya Samarskogo NTs RAN, 2012, Vol. 16, No. 1, P. 2243-2245.
2. Kruglova N.N. Laboratornaya otsenka regenerantov pshenitsy, poluchennykh v eksperimental'noi selektivnoi embri-okul'ture in vitro (Laboratory assessment of wheat regenerates received due to selective embrioculture in vitro), Permskii agrarnyi vestnik, 2013, No. 1, P. 35-38.
3. Kruglova N.N. Tsitogeneticheskii analiz regenerantov pshenitsy, poluchennykh v selektivnoi embriokul'ture in vitro (Cytogenetic analysis of wheat regenerates received due to selective embrioculture in vitro), Vestnik Bashkirskogo gosudar-stvennogo agrarnogo universiteta, 2013, No. 2, P. 16-18.
4. Batygina, T.B. Khlebnoe zerno: Monografiya (Bread grain), L.: Nauka, 1987, 103 p.
5. Terekhin E.S. Zarodysh. Embriologiya tsvetkovykh rastenii (Embryo. Embriology of flowering plants), Termi-nologiya i kontseptsii. Vol. 2: Semya / Red. T.B. Batygina, SPb.: Mir i sem'ya, 1997, P. 294-297.
6. Batygina T.B., Vasil'eva V.E. Tselesoobraznost' sistemnogo podkhoda k probleme differentsiatsii zarodysha pokry-tosemennykh rastenii (Reasonability of system approach to the issue of metasperms embryo differentiation), Ontogenez, 1983, Vol. 14. No. 3, P. 304-311.
7. Ionova E.V. Ustoichivost' sortov i linii pshenitsy, yachmenya i sorgo k regional'nomu tipu zasukhi: Avtoref. ... d-ra s.-kh. Nauk (Resistance of wheat, barley and sorgho varieties and lines to the regional type of drought), Krasnodar, 2011, 48 p.
8. Chelak V.R. Sistema razmnozheniya pshenitsy Triticum L. (System of wheat Triticum L. breeding), Kishinev: Shtiintsa, 1991, 320 p.
9. Kruglova N.N., Sel'dimirova O.A. Regeneratsiya pshenitsy in vitro i ex vitro: tsito-gistologicheskie aspekty (Regeneration of wheat in vitro and ex vitro: cytological aspects), Ufa: Gilem, 2011, 124 p.
10. Kruglova N.N. K voprosu ob ispol'zovanii embriokul'tury in vitro pshenitsy dlya biotekhnologicheskikh tselei (On embryoculture in vitro wheat application for biotechnological purposes), Dostizheniya i problemy genetiki, selektsii i bio-tekhnologii: Sbornik nauchnykh trudov, T. 4. Kiev: Logos, 2012, P. 542-546.
11. Kruglova N.N. Vyyavlenie kriticheskoi stadii avtonomnosti zarodysha pshenitsy v kul'ture in vitro (Determination of critical stage of wheat embryo autonomy during cultivation in vitro), Izvestiya Ufimskogo NTs RAN, 2013, No. 1, P. 42-45.
12. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures, Physiol. Plant, 1962, Vol. 15, No. З, P. 47З-497.
13. Svetovoi mikroskop kak instrument v biotekhnologii rastenii (Light microscope as tool in plant biotechnology), N.N. Kruglova, O.V. Egorova, O.A. Sel'dimirova, D.Yu. Zaitsev, A.E. Zinatullina. Ufa: Gilem, 201З, 128 p.
14. Kruglova N.N. Periodizatsiya embriogeneza pshenitsy kak metodologicheskii aspekt biotekhnologicheskikh raz-rabotok (Periodization of wheat embryogenesis as methodological aspect of biotechnological projects), Izvestiya Ufimskogo NTs RAN, 2012, No. 1, P. 56-61.
