CC BY
33
ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К КАПСУЛЬНЫМ ПОЛИСАХАРИДАМ МЕНИНГОКОККОВ РАЗРАБОТАННЫМИ АСУМУ 135, АС И А ЛАТЕКСНЫМИ ДИАГНОСТИКУМАМИ В СЫВОРОТКАХ НАСЕЛЕНИЯ ЭФИОПИИ
А.В. Харитонова, А.П. Аллилуев
Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, 117198 Москва, Россия
С.А. Харт
Кафедра микробиологии и генитально-уринальной медицины Ливерпульский Университет Долби стрит, Дункан билдинг, Ливерпуль Ь69 ЗСА, Великобритания
Для определения чувствительности и специфичности АСУ\\М35, АС и А менингококковых латексных диагностикумов (ЛД) для выявления противоменингококковых антител были исследованы 192 образца сывороток населения Эфиопии. В реакции латекс-агглютинации продемонстрирована высокая чувствительность и специфичность связывания разработанных ЛД с капсульными полисахаридами (КП). Наибольшая чувствительность АСУ\\^ 135, АС и А серогрупп менингококковых ЛД была достигнута при использовании латекса, размер которого варьировал от 3 до 1,2 мкм и в сенсибилизирующей дозе 6,25 мкг/мл. Полученные данные подтвердили диагностическую ценность ЛД на основе группоспецифических полисахаридов и выявили достаточно высокий уровень антител к КП серогруппы А в сыворотках населения Эфиопии, что соответствует послеэпидемическому периоду 2003 года.
Ключевые слова: менингококковая инфекция, выявление антител, реакция латекс агглютинации.
Менингит и септицемия являются опасными инфекциями, вызывающими значительную заболеваемость и смертность. Эпидемия менингококкового менингита является большой проблемой здравоохранения в мире, наибольшее распространение зарегистрировано в Африке. В 1999 г. вспышка менингококковой инфекции наблюдалась в Гвинее-Бисау, регионе называемом менингитным поясом Африки [1]. Соответствующий чувствительный тест является необходимым для выявления наличия менингококковой инфекции (МИ) для раннего предупреждения возможности возникновения вспышки в данном регионе.
С большим успехом в последнее время используют для индикации антигенов и антител полимерные микросферы (латексы), позволяющие прочно связывать специфические антигены микробов или направленные к ним антитела [2; 3; 4; 5]. Простота, чувствительность и специфичность реакции латекс агглютинации (РЛА) при проведении скрининга больших популяций позволяет быстро и дешево выявлять людей с высоким уровнем противоменингококковых антител, защищающих их от заражения МИ. Ме-нингококковый антиген быстрее элиминируется из крови, тогда как антитела к нему
можно регистрировать в РЛА более длительное время. Ранее при использовании ЛД серологическое подтверждение диагноза на основании дополнительного выявления диагностического титра антител нами было получено в 89% случаев [10].
Целью этого исследования является выбор латекса и сенсибилизирующей рабочей дозы, соответствующих методов иммобилизации КП А, С, У, \V135 серогрупп Птепт^](1е8 антигенов на полимерные микросферы, оценка чувствительности и специфичности разработанных экспериментальных серий иммунохимических тест-систем, тестирование образцов сывороток крови населения Эфиопии э тими диагности-кумами для выявления антител к КП А, С, У, N¥135 серогрупп 1Ч.тепш^пс1е.ч.
Материалы и методы.
Была изучена способность латексов из полистирола разных размером: 0,8 мкм, 1,1 мкм, 3,0 мкм и цветов (белый и синий — «81^а-АИпсЬ», 1Ж) связываться с АСУ\У135, АС и А серогрупповыми КП менингококков. В качестве сенсибилизирующих агентов были использованы КП из АС, АСХУ\У135 серогрупп вакцин, выпускаемых фирмой («Мепеих», Франция), а также полисахаридной вакцины серогруппы А (Россия). Микросферы из полистирола были покрыты А, С, У, \V135, АС или А КП, которые реагировали с группоспецифичными антителами N. тепт^пёез.
Частицы латекса были отмыты двукратным центрифугированием фосфатным буфером pH = 7,8. Концентрация полимерной суспензии была 1 % до сенсибилизации. Латекс был смешан в эквивалентном объеме 1 мл с выбранной концентрацией 6,25 мкг/мл менингококкового антигена. Затем для инактивации свободных групп в течение часа инкубируют суспензию в глициновом буфере при pH = 7,8. Рабочая концентрация латекса в планшете 0,05%. Несенсибилизированный латекс был взят в качестве контроля неспецифического связывания.
Таблица 1
Зависимость чувствительности ЛД белого цвета от размера латексных микросфер и сенсибилизирующей дозы АСУ\¥135, АС, А КП
Размер, мкм Сенсибилизирующая доза, мкг/мл
1,5 6,25 12,5 25 50 100
0,8 - - - - - -
1,2 90 9К* 95 90 80 70
3,0 90 98 95 90 80 70
Примечание: * - пул сывороток, который давал наиболее высокий процент положи-
тельных реакций с исследуемыми сенсибилизирующими дозами латексов.
Таблица 2
Зависимость чувствительности ЛД синего цвета от размера латексных микросфер и сенсибилизирующей дозы АСУ\¥135, АС КП.
Размер, мкм Сенсибилизирующая доза, мкг/мл
1,5 6,25 12,5 25 50 100
0,8 - - - - - -
1,2 60 70* 65 60 50 40
3,0 60 70* 65 60 50 40
Примечание: * — пул сывороток, который давал наиболее высокий процент положительных реакций с исследуемыми сенсибилизирующими дозами латексов.
Была дана оценка чувствительности, специфичности и стабильности связывания АСУ\У135, АС, А КП (табл. 1, 2). При изучении чувствительности ЛД с различными антигенами выявлен титр антител, который давал РЛА со стандартной сывороткой в зависимости от вида и размера латекса. Ранее, соответственно схеме, была показана минимальная активная концентрация (МАК), А, С, У, X, \V135 КП (которой сенсибилизировали частицы латекса), в которой сенсибилизированные частицы латекса могут быть агглютинированы сывороткой, содержащей антитела к А, С, У, X, Т, В и \V135 серогруппам К.тетг^Шс^ [2]. Рабочая доза была выше МАК и давала максимальные титры антител в РЛА. Сыворотки забирались на 1-2-й и 7-10-й дни с момента постановки диагноза МИ.
Антитела к АСУ\¥135, АС, А КП менингококков были тестированы в сыворотках 194 людей из Эфиопии. Из них (93,8%) всего 182 были мужчины. Возраст обследованных был от 17 до 65 лет.
Результаты.
Разработанные ЛД, полученные при иммобилизации антигена на латекс, были использованы для выявления противоменингококковых группоспецифических антител. Было проведено сравнение способности этих серий латексов связываться менингококковыми АСУ\У135, АС, А серогрупп КП. Для оценки чувствительности были взяты пулы сывороток переболевших, которые давали тигры противоменингококковых антител 1:40 и выше. Специфичность ЛД была подтверждена тем, что РЛА не выявляла антител в сыворотках других серогрупп менингококков.
Таким образом, была подобрана сенсибилизирующая концентрация КП, в которой проявляется высокая специфичность и чувствительность менингококковых тест-систем АСУ\¥135, АС, А серогрупп. Наибольшая чувствительность и специфичность ЛД была достигнута при использовании латекса, размер которого варьировал от 3,0 до 1,2 мкм и сенсибилизирующей дозе 6,25 мкг/мл АСУ\\Ч35, АС, А КП (табл. 1, 2). Менингококковые АСУ\¥135, АС и А ЛД, основанные на полимерной суспензии белого цвета, были более чувствительными и стабильными, чем синие ЛД, активность которых резко упала после 2 месяцев (табл. 1, 2, 3).
Было показано, что процент выявления антител менингококковыми ЛД, которые содержали оптимальную концентрацию 6,25 мкг/мл и размер 3,0 мкм, 1,2 мкм был более эффективен, чем тест-систем с другими концентрациями КП (см. табл. 1,2).
Таблица 3
Стабильность ЛД белого цвета АС и АСУ\¥135 серогрупп
№ п/п Сенсибилизирующая доза на мкг/мл частиц латекса Титры АС, АСТ\¥135 антител в РЛА при храненни
1 нед. 3 мес. 6 мес. 9 мес. 1 год 1,5 года
1 1,5 3 3 2 2 1 1
2 6,25 5 5 5 5 5 5
3 12,5 5 4 4 3 2 1
4 25,0 4 4 4 3 2 1
5 50,0 3 3 3 2 2 1
6 100,0 2 1 1 0 0 0
Примечание: * — цифры обозначают логарифм обратной величины титра.
Таблица 4
Выявление уровней антител ЛД А, АС и АСУУУОБ серогрупп
№ п/п сер. Доза АГ, м кг/мл Число обследованных — группы Средний логарифм титра*
АС АСУ\У135 А
1 6,25 72 2,34+0,12 2,47±0,32 2,52±0,35
2 6,25 50 5,85±0,24 6,21+0,34 6,1 ±0,24
3 6,25 40 4,03+0,32 4,23±0,33 4,51±0,25
4 6,25 32 8,45±0,11 8,65±0,41 8,91+0,49
Примечание: * — достоверность различий р> 0,05 в группах.
Обсуждение.
В работах Оо1(1$Ьпе1с1аг и других [6] при изучении сывороток добровольцев показано, что при использовании бактерицидных антител индивидуумы с титром циркулирующих антител более 4 были защищены от заражения МИ серогруппы С. Полученные высокие титры противоменингококковых антител мы можем объяснить тем, что эти сыворотки были собраны от людей, перенесших эпидемии в Эфиопии в 1989, 1999 гг. [7]. Высокие титры противоменингококковых антител защищают людей от заболевания и смерти при менингококковой инфекции [8]. Нами было показано ранее [10], что уровень АТ (1:40) является протективным. Полученные данные также показали наличие зависимости между присутствием бактерицидных антител в сыворотке и защиту от заражения менингококковой инфекцией (обзор РгавЬ [9]). Безусловно, имея моновакцину серогруппы А, можно установить уровень АТ у переболевших менингококковой инфекцией серогруппы А. В нашем случае, кроме моновакцины А, дивакцины А+С и тетравакцины А+С У+\¥135, выявлены аналогичные титры антител. Различие уровней противоменингококковых антител к КП, выявленных при помощи АСУ\У135, АС и А серогрупп латексных диагностикумов, в одних и тех же сыворотках, было статистически незначимым (табл. 4). Таким образом, мы можем заключить, что выявленные антитела принадлежали серогруппе А и что титруются одни и те же антитела, синтезированные к КП серогруппы А. Это помогло подтвердить серологически, что эпидемия была вызвана менингококками серогруппы А, а также установить уровень коллективного иммунитета. Так как известно, что эпидемии в Эфиопии были вызваны А серогруп-пой К.тешг^йёез [7], мы можем подтвердить это также. На основе полученных данных можно прогнозировать количество людей, которые подлежат вакцинации.
Проведенное тестирование по выявлению уровня противоменингококковых антител сывороток из Эфиопии показало высокую диагностическую ценность разработанных ЛД. Данные о превалировании противоменингококковых антител серогрупп АСУ\У135 и АС, А у населения Эфиопии в литературе отсутствуют. Таким образом, является важным выявление уровня антител до проведения вакцинации менингококковой вакциной. Как и в изучении ОоИ8]1Г^с1аг и других [6], проводится сравнение заболеваемости по возрастным группам, и мы планируем дальнейшее изучение зависимости защиты для серогрупп АСУ\У135, АС и А МИ. Предложенный метод латексной агглютинации планируется использовать для диагностики уровня противоменингококкового иммунитета в регионах с высоким риском возникновения вспышки МИ, что является важным для эпидемиологического прогноза и решения вопроса вакцинации в этом регионе.
ЛИТЕРАТУРА
1. Anonymous (1999) Communicable Disease Surveillance and Response (CSR). World Health Organization, Geneva.
2. Аллилуев А.П., Яшина H.B., Котельникова О.В., Харитонова А.В. и др. Полимерные окрашенные микросферы для индикации антител к капсульным полисахаридов различных серогрупп менингококков // Биомедицинские технологии. — 1996. — № 4. — С. 77-8 J.
3. Severin, W.P.J. Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis // J. Clin. Path. — 1972. — Vol. 25. — P. 1079-1082.
4. Methods in Molecular Medicine, vol. 67: Methods and Protocols. Edited by: A.J. Pollard and M.C. J. Maiden. Humana Press Inc., Totowa, NJ.
5. Leinonen M. and Herba E. The latex agglutination test for the diagnosis of meningococcal and Haemophilus influenzae meningitis // Scand. J. Infect. Dis. — 1997. — Vol. 9.— P. 187-191.
6. Goldschneider /., Gotschlich E.C., Artenstein M.S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies // J Exp Med. — 1969.— Vol. 129 (6). — Jun 1, —P. 1307-1326.
7. Haimanot R.T., Caugant D.A., Fekadu D. et al. Characteristics of serogroup A Neisseria meningitidis responsible for an epidemic in Ethiopia, 1988-89 // Scand J Infect Dis. — 1990, —Vol. 22 (2).— P. 171-174.
8. Borrow R., Andrews N., Goldblatt D. et al. Serological basis for use of meningococcal serogroup С conjugate vaccines in the United Kingdom: revaluation of correlates of protection // Infect. Immun. — Vol. 69. — P. 1568-1573.
9. Frasch C.E. Meningococcal vaccines: past, present and future // K. Cartwright (ed.). Meningococcal disease. N.Y., John Wiley & Sons, 1995. P. 245-283.
10. Ariuiyee А.П., КС. Королева, Ю.Я. Венгеров и др. Реакция латекс-агглютинации для экстренной и ретроспективной диагностики менингококковой инфекции // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 1999. — Т. 128, —№ 11, —С. 541-544.
REVEALING THE ANTIBODIES TO CAPSULAR POLYSACCHARIDES OF MENINGOCOCCUS BY DEVELOPED ACYW135 AND AC LATEX DIAGNOSTICS IN THE SERA OF ETHIOPIA POPULATION
A.V. Kharitonova, A.P. Alliluev
Department of Medical Microbiology, Virology and Immunology Peoples’ Friendship University of Russia Miklukho-Maklaya St., 8, 117198 Moscow, Russia
C.A. Hart
Department of Medical Microbiology and Genito-Urinary Medicine University of Liverpool Duncan Building, Daulby Street, Liverpool L69 3GA, United Kingdom.
A total of 192 samples of serum of Ethiopia population were examined in order to determine the sensitivity and specificity of ACYW135 and AC meningococcal latex diagnostics for
meningococcal antibodies detection. Latex agglutination reaction demonstrated high sensitivity and specificity of binding of the new latex diagnostics to the capsular polysaccharides. The highest sensitivity of ACYW135 and AC meningococcal latex diagnostics was achieved, when used latex with si/e varied from 3,0 up to 1,2 mkm and the sensitizing doze of 6,25 mkg/ml. The obtained data have confirmed the diagnostic value of latex diagnostics based on groupspecific polysaccharides. And have revealed high level of antibodies to capsular polysaccharides serogroup A in sera Ethiopia population, that corresponds after epidemical period 2003 year.
Keywords: meningococcal infection, antibodies detection, latex agglutination reaction.
