CC BY
138
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН _2014, том 57, №3_
БИОХИМИЯ
УДК 577.1:579.6
Захра Дараб*, академик АН Республики Таджикистан М.М.Якубова**, Х.Юлдошев,
З.М.Хамрабаева
ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИМУТАГЕННОГО И АНТИКАНЦЕРОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ЭКСТРАКТОВ ИМБИРЯ (ZINGIBER OFFICINALE ROSCOE)
Таджикский национальный университет, Исламский свободный университет, отделение Арока, Иран,
Центр инновационной биологии и медицины Академии наук Республики Таджикистан
Приготовлены экстракты (водные, этаноловые и гексановые) из сухих корневищ имбиря (Zingiber officinale Roscoe), которые в дальнейшем в тесте Эймса проявили антимутагенную и антиканцерогенную активность в бактериальных тест-системах на штамме Salmonella typhimurium ТА100. Показано, что антимутагенная активность экстрактов имбиря, извлеченных водой, этанолом, гексаном, последовательно снижается. Антимутагенный эффект экстрактов усиливается при добавлении микросом печени крыс (S9).
Ключевые слова: Zingiber officinal Roscoe - антимутагенность - антиканцерогенность - тест Эймса.
Некоторые экологические факторы могут быть источником мутагенных веществ и вызывать более 75% случаев раковых заболеваний [1]. Отдельные исследователи считают, что ущербы и изменения, возникшие в нуклеотидной последовательности ДНК, изменение частоты генетических мутаций и другие повреждения в структуре хромосом играют важную роль в канцерогенезе. Исследования, проведённые Сундж и др. [2], показали, что генетические нарушения появляются после действия некоторых соединений и летучих химических веществ. Растительные ткани в большом количестве синтезируют фенольные соединения [3]. Показано, что большинство антиоксидантных веществ представлено флавоноидами, изофлавонами, флавонами, антоцианами, катехинами и другими фенольны-ми соединениями [4], которые обладают противораковыми и антимутагенными свойствами [5,6]. Более 80% антиоксидантных веществ встречаются во фруктах и овощах и считаются компонентами антиоксидантных витаминов [7], а также фенольные соединения-антиокислители, существуют в растениях и нейтрализуют действие свободных радикалов и активных форм кислорода [8].
В настоящее время для оценки антимутагенной активности используют различные бактериальные тесты, которые дают оптимальные результаты за короткий промежуток времени. Одним из таких методов измерения комбинированной мутации у бактерий служит тест Эймса, где в качестве тест-объекта используются некоторые штаммы бактерии Salmonella typhimurium. В тесте изучается возможность предполагаемого мутагена вызывать ревертивную мутацию данного гена, при которой штамм приобретает способность расти на среде, не содержащей гистидин. Наличие мутагенного эф-
Адрес для корреспонденции: Якубова Мухиба Мухсиновна. 734025, Республика Таджикистан, г. Душанбе, пр. Рудаки, 33, Президиум АН РТ. E-mail: mukhiba@mail.ru; Хамрабаева Зухра Мамаджановна. 734025, Республика Таджикистан, г. Душанбе, пр. Рудаки, 17, Таджикский национальный университет. E-mail: zuhrah62@mail.ru
фекта у исследуемого препарата учитывали по индукции обратных мутаций от ауксотрофности по гистидину к прототрофности.
Бактерии высеваются в чашки Петри в питательную среду с агаром, которая содержит небольшое количество гистидина. Этого количества гистидина в среде достаточно, чтобы обеспечить жизнедеятельность и рост бактерий в течение некоторого времени и дать возможность успеть за это время мутировать. После полного использования гистидина, содержавшегося в среде, выживают только ревертировавшие колонии, которые приобрели способность синтезировать собственный гис-тидин. Контролем служат бактерии, посеянные на среде, не содержащей исследуемого мутагенного фактора.
Материалы и методы исследования
В работе были использованы корневища имбиря лекарственного (Zingiber officinale Roscoe), привезенные из Индии и выращенные в климатических условиях Ирана (CIR). Имбирь лекарственный - многолетнее травянистое растение, образующее в почве довольно толстое, горизонтальное, клубневидное, ветвистое корневище.
Метод подготовки экстрактов. Образцы сушились в тени и были измельчены в порошок при помощи электрической мельницы. Затем 1 г сухого порошка смешивали с 80% этанолом, n-гексаном и стерильной водой, после 48 ч осуществлялась фильтрация смеси. Сырой экстракт подвергали вакуумной дистилляции при температуре 80°С в течение одного часа, летучие элементы должны медленно испаряться; полученный таким образом конденсат экстракта полностью готов к антимутагенному тесту.
Метод определения антимутагенной активности. Сущность полуколичественного метода учёта генных мутаций Эймса заключается в использовании двух основных компонентов: регистрирующего и активирующего [9]. Регистрирующую часть составляет индикаторный штамм Salmonella typhimurium ТА-100 (his G 46, rfa, Duvr b, +R), способный отражать действие мутагенов, вызывающих замены пар оснований в молекуле ДНК. Активирующий компонент включает постмитохондриальный супернатант гомогената печени крыс (фракция S9).
В расплавленный полужидкий агар вносят при 43-45°С 0.1 мл суспензии бактерий индикаторного штамма, 0.1 мл раствора мутагенного вещества азида натрия и 0.5 мл активирующей смеси, содержимое пробирки перемешивают и быстро наслаивают на нижний селективный агар. Чашки инкубируют при 37°С в течение 48 часов и учитывают количество колоний - ревертантов от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Если вещество проявляет мутагенную активность, то количество ревертантов в опытных чашках превышает количество ревертантов в контроле.
В данном тесте были рассмотрены положительные и отрицательные контроли. Отрицательный контроль (CN) содержал 0.5 мл стерильной воды и 0.1 мл свежей ночной культуры сальмонеллы TA100 и был смешан с раствором гистидина-биотина и верхнего агара, расплавленным и охлажденным в трубке.
Отрицательный контроль фактически является спонтанной мутацией в бактериальных штаммах и для каждого эксперимента необходимо учитывать его по отдельности. В положительном контроле (CP) использовался раствор канцерогена азида натрия, 0.1 мл которого добавляли к 0.1 мл ноч-
ных культур бактерий и 0.1 мл раствора гистидин-биотина, после чего распределяли по 3 мл в пробирку с охлажденным и расплавленным топ агаром. Учёт результатов проводили через 48 часов инкубации.
На каждый контрольный и опытный образец берут по 3 чашки. Эксперимент повторяют дважды. Результаты эксперимента учитывают при наличии мутагенного эффекта во всех вариантах позитивного контроля.
Результаты исследований
Результаты исследования антимутагенного действия различных экстрактов имбиря с использованием Salmonella typhimurium выявили, что наблюдается ингибирование индуцированного мутагенеза при внесении в питательную среду экстракта корневищ имбиря (водного (W), этанолового (Е) либо гексанового (N)) во всех образцах в присутствии S9 и в отсутствии S9 (табл. 1).
Таблица 1
Сравнительная характеристика антимутагенного действия экстрактов имбиря
в присутствии S9 и без S9
Образцы Тип образ- S. typhimurium ТА100 (-S9) S. typhimurium ТА100 (+S9)
цов Среднее % ингибирования Среднее % ингибирования
значение мутации значение мутации
W 169.67 49.20 108.33 60.07
CIR E 175.67 47.40 116.67 55.01
N 237.67 28.90 139.33 47.22
CP 334 -- 273 --
W 1.67 -- 1.67 --
CN E 12.67 -- 12.67 --
N 9.00 -- 9.00 --
Следует отметить, что процент ингибирования во всех трёх типах экстрактов (водный (W), этаноловый (Е), гексановый (К)) последовательно снижался. Во всех экстрактах в присутствии S9 (+S9) количество мутировавших бактерий значительно уменьшается.
Ингибирование мутагенного эффекта менее чем на 25% свидетельствует о слабом, от 25 до 40% - о среднем, выше 40% - о сильном антимутагеном эффекте, где данный аспект также достоверен в случае противораковых исследований с добавлением S9 для активации метаболических свойств
[9].
В числе наиболее активных в антимутагенном отношении оказались водные экстракты, которые снизили число ревертантов в пределах от 49 до 60%. Несколько ниже антимутагенный эффект у экстрактов, полученных на 80% этаноле, которые уменьшили число ревертантов до 47-55%. Средний уровень антимутагенной активности отмечен для экстрактов, полученных на п-гексане (снижали количество ревертантов в пределах 29-47%).
Экстракты печени S9 с активной системой цитохромов Р-450/Р-448 используются для активации некоторых противораковых препаратов [10]. Можно предположить, что, возможно, соединения в экстрактах имбиря доступны для активации ферментативной системой цитохрома Р450/Р448. Отмечено, что при наличии S9 все образцы проявляют наилучшие антимутагенные и противораковые
свойства, например водный экстракт корневищ имбиря обладает выраженным биоантимутагенным эффектом, снижая число колоний-ревертантов, индуцированных азидом натрия, на 60%.
Выводы
На основании проведённых тестов можно заключить, что все изученные экстракты корневищ имбиря обладают антимутагенным свойством, так как при их участии наблюдается уменьшение количества колоний ревертантов.
Обоснован антимутационный характер воздействия полученных экстрактов имбиря без использования фактора S9 и их противораковый эффект в присутствии данного фактора.
Показано, что антимутагенная активность экстрактов имбиря, извлеченных водой, этанолом, гексаном, последовательно снижается. По тесту Эймса определено предотвращение обратной мутации под действием полученных экстрактов корневищ имбиря, что позволило оценить достоверную вероятность степени торможения мутаций соответствующими экстрактами.
Поступило 06.01.2014 г.
ЛИТЕРАТУРА
1. Sissiqui I.A. - Antioxid Redox Signal, 2004, v. 6, № 3, pp. 571-582.
2. Sunj J., Chu YF., Wu X. - J. Agric. Food Chem., 2002, v. 25, pp. 7449-7454.
3. Loliger J. The use of antioxidants in foods. In: Auroma O.I., Halliwell B. (Eds.). Free Radicals and Food Additives. - London: Taylor & Francis, 1991, pp. 129-150.
4. Kahkonen M.P., Hopia A.I., Vuorela H.J. - J. Agric. Food Chem., 1999, v. 47, pp.3954-3962.
5. Ayrton A.D., Lewis D.F.V., Walker R., Loannides C. - Food and Chemical Toxicology, 1992, v. 30, pp. 289-295.
6. Edenharder R., Tang X. - Food and Chemical Toxicology, 1997, v. 35, pp. 357-372.
7. Miller J., Rice-Evans C.A. - Food Chemistry, 1997, v. 60, pp. 331-337.
8. Prior L., Cao G. - Horticulture Science, 2000, v. 35, pp. 588-592.
9. Maron M., Ames B.N. - Research Environmental Mutagenesis, 1983, v.113(3-4), pp.173-215.
10. Hakura, A., Shimada, H., Nakajima, M., Sui, H., Kitamoto, S., Suzuki, S., Satoh, T. - Mutagenesis, 2005, v. 20, pp. 217-228.
Захра Дороб*, М.М.Якубова**, ^.Юлдошев, З.МДамробоева ТАЭДИЦИ ТАЪСИРИ ЗИДДИМУТАГЕНЙ ВА ЗИДДИСАРАТОНИИ ШИРА^ОИ ЗАНЧДБИЛ (ZINGIBER OFFICINALE ROSCOE)
Донишго^и миллии Тоцикистон, *Донишго%и озоди исломи, во^иди Арок, Эрон, **Маркази инноватсионии биология ва тибби Академияи илмх;ои Цум^урии Тоцикистон
Аз решапоях,ои хушки занчабил (Zingiber officinale Roscoe) ширах,ои гуногун чудо карда шуданд, ки дар тести Эймс фаъолнокии зиддимутагенй ва зиддисаратониро бо истифодаи тест-системах,ои бактериявии штамми Salmonella typhimurium ТА100 зохдр намуданд. Нишон дода шуд, ки фаъолнокии зиддимутагении ширах,ои бо истифодаи об, этанол ва гексан тайёр карда
шуда пайдархам паст мешавад. Таъсири зиддисаратонии ширахо хангоми илова намудани микросомахои чигари калламуш (S9) зиёд мешавад.
Калима^ои калиди: Zingiber officinal Rosco - зиддимутагени - зиддисаратони - тести Эймс. Zahra DB^b*, M.M.Yakubova**, Kh.Yuldoshev, Z.M.Khamrabaeva
INVESTIGATION OF ANTIMUTAGENIC AND ANTICANCER ACTIVITIES OF ZINGIBER OFFICINALE ROSCOE RHIZOMES EXTRACTS
Tajik National University, Islamic Azad University, Arak branch, Iran, Innovative Center of biology and medicine of Academy of sciences of the Republic of Tajikistan
In the present study the dried rhizomes of Zingiber were extracted with water, ethanol, and n-hexane. The antimutagenicity of these extracts was assayed against the mutagenicity of sodium azide by Ames test using tester strain of Salmonella typhimurium (TA100). The antimutagenicity of the extracts was found in the order of water-ethanol-n-hexane. All the extracts decreased sodium azide mutagenicity in S. typhimurium strain (TA100) and showed strong antimutagenicity. Also by adding microsome of rat liver (S9) the anticancer effect of extracts was proved.
Key words: Zingiber officinal Roscoe - antimutagenicity - anticancer - Ames test.
