CC BY
156ISSN 0868-5886
НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2019, том 29, № 3, c. 77-84
ОТ РЕДАКЦИИ (избранное: монографии ученых ИАП РАН)
РОССИЙСКАЯ академия наук
Институт аналитического приборостроения
Б. Г. Беленький
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Санкт-Петербург "Наука" 2009
9785020254084
УДК 543 ББК 24.4 Б44
Рецензенты: Л.Н. Галль, В.В. Малеев
Б44 Беленький Б. Г. Высокоэффективный капиллярный электрофорез. —
СПб.: Наука, 2009. —320 с.
ISBN 978-5-02-025408-4
Книга представляет собой практическое руководство по капиллярному электрофорезу — новому методу анализа, обладающему высокой разрешающей способностью и сочетающему преимущества электрофоретических методов разделения с возможностью автоматизации анализа и простотой количественного расчета, характерного для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Быстрота анализа и эффективность разделения в сочетании с широкой областью применения делают капиллярный электрофорез одним из наиболее совершенных аналитических методов.
Материал книги включает основы капиллярного электрофореза как метода анализа сложных биологических смесей и некоторые конкретные методики анализа.
Книга рассчитана на специалистов, работающих в области медицинского и биохимического анализа.
B. G. Belenkii
HIGH-PERFORMANCE CAPILLARY ELECTROPHORESIS
This book is a practical guide to capillary electrophoresis, a novel analytical technique with a high resolving power. Capillary electrophoresis combines the advantages of electrophoretic separation methods with the ability to automate the analysis and the simplicity of quantitation which are typical of high performance liquid chromatography.
Capillary electrophoresis combines fast analysis and efficient separation with wide applicability, making it one of the most advanced analytical techniques.
This book covers the principles of capillary electrophoresis as a preferred method to analyze complex biological mixtures as well as some examples of specific analytical methods.
This book is aimed at experts working in the field of medical and biochemical analysis.
ISBN 978-5-02-025408-4 © Б. Г. Беленький, 2009
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений ........................................................................................................................7
Глава 1. МЕТОД ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОГО
КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА (ВЭКЭ)......................9
I. Место ВЭКЭ в ряду аналитических методов ..................................................9
II. Физические основы метода ВЭКЭ........................................................................17
II. 1. Электрофорез..................................................................................................17
11.2. Электроосмос..................................................................................................19
11.3. Особенности электрофоретических процессов
в вариациях ВЭКЭ............................................................................................22
11.4. Тепловые эффекты в ВЭКЭ..................................................................24
11.5. Экстраколоночное размывание зон..................................................25
11.6. Параметры разделения..............................................................................26
III. Особенности сепарационных механизмов в вариациях метода ВЭКЭ..........................................................................................................................................27
IV. Некоторые методические вопросы ВЭКЭ........................................................31
ГУ.1. Устройство для капиллярного электрофореза..........................31
^.2. Чувствительность детектирования....................................................33
ГУ.3. Подготовка пробы для капиллярного
электрофореза................................................................................................34
ГУ.4. Ввод пробы......................................................................................................34
ГУ.5. Детекторы..........................................................................................................36
Литература............................................................................................................................................40
Глава 2. МЕТОДИКИ КАПИЛЛЯРНОГО
ЭЛЕКТРОФОРЕЗА..........................................................................................42
I. Матричные эффекты и разделение........................................................................42
II. Капиллярный зонный электрофорез......................................................................43
II. 1. Ионная сила пробы......................................................................................45
11.2. Белки....................................................................................................................45
П.3. Водородный показатель рН..................................................................46
П.4. Вязкость и объем пробы..........................................................................47
П.5. Стэкинг и полевая инжекция................................................................49
III. Мицеллярная электрокинетическая капиллярная
хроматография (МЭКХ)................................................................................................56
Ш.1. Объем пробы и ПАВ в электрофоретическом
буферном растворе......................................................................................57
Ш.2. Поверхностно-активные вещества и органические
растворители в пробе................................................................................59
Ш.3. Практические аспекты и примеры....................................................60
IV. Капиллярный ионный электрофорез....................................................................61
РУ.1. Фактор параллельного осмотического
потока..................................................................................................................62
РУ.2. Принцип детектирования на основе замещения
коионов электролита..................................................................................65
РУ.3. Методы ввода пробы..................................................................................69
РУ.4. Примеры............................................................................................................74
РУ.5. Модификаторы электроосмотического потока
для анионного анализа..............................................................................83
ГУ.6. Применение КИЭФ......................................................................................84
V. Очистка пробы....................................................................................................................87
V. 1. Разбавление и прямой ввод пробы....................................................87
V.2. Экстракция, фильтрация и диализ....................................................89
V.3. Депротеинация с помощью органических
растворителей..................................................................................................91
VI. Матрица пробы и точность..........................................................................................92
VI. 1. Факторы, влияющие на воспроизводимость высоты
пиков и на воспроизводимость времени миграции..............92
^.2. Практические аспекты..............................................................................93
VII. Практические рекомендации......................................................................................94
УП.1. Средства, необходимые для работы................................................94
УП.2. Уход за капиллярами и их использование..................................95
УП.3. Электролиты....................................................................................................96
Литература..............................................................................................................................................97
Глава 3. МЕТОДЫ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ
В КАПИЛЛЯРНОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗЕ........................................102
Введение..................................................................................................................................................102
I. Методы оптического детектирования для капиллярного
электрофореза......................................................................................................................104
11. Общие требования к характеристикам
и конструкции................................................................................................104
12. Прямое и непрямое детектирование................................................107
13. Детектирование по поглощению........................................................108
14. Детектирование по флуоресценции..................................................119
15. Другие способы оптического детектирования..........................133
II. Методы электрохимического детектирования в ВЭКЭ............................139
11.1. Потенциометрическое детектирование..........................................139
11.2. Детектирование по электропроводности......................................148
11.3. Амперометрическое детектирование..............................................156
Литература............................................................................................................................................161
Глава 4. ПРИМЕНЕНИЕ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПРОИЗВОДСТВЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ
СРЕДСТВ..................................................................................................................172
Введение..................................................................................................................................................172
I. Аттестация КЭ и вопросы чувствительности................................................174
1.1. Аналитические проверки........................................................................174
1.2. Повышение чувствительности............................................................175
II. Анализ фармацевтических препаратов и определение
примесей в них....................................................................................................................179
П.1. Анализ основных компонентов и определение
примесей........................................................................................................................179
П.2. Определение противоионов (ионный анализ)..........................184
П.3. Определение физико-химических свойств..................................186
III. Анализ природных лекарственных средств....................................................186
IV. Разделение гидрофобных и/или электрически нейтральных лекарственных препаратов..........................................................................................188
ГУ.1. Электрокинетическая хроматография (ЭКХ)..........................188
^.2. Капиллярная электрохроматография примесей......................190
РУ.3. Безводный капиллярный электрофорез........................................190
V. Анализ ДНК и белков......................................................................................................191
V.! Антисенс ДНК................................................................................................191
V.2. Анализ пептидов и белков......................................................................193
VI. Энантиомерные разделения........................................................................................194
У!1. Селекторы на основе ЦД и краун-эфиров....................................194
УГ2. Селекторы на основе полисахаридов, антибиотиков
и белков............................................................................................................196
УГ3. Мицеллярная электрокинетическая хроматография
(МЭКХ) и капиллярная электрохроматография (КЭХ)..............197
Литература..............................................................................................................................................198
Глава 5. КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДЛЯ АНАЛИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ
ЖИДКОСТЯХ......................................................................................................211
Введение..................................................................................................................................................211
I. Мониторинг лекарственных препаратов при лечении больного (МЛП)........................................................................................................................................213
11. Противоэпилептические средства....................................................214
12. Противоастматические средства........................................................216
13. Анальгетики....................................................................................................217
14. Иммуноподавляющие средства..........................................................217
15. Антидепрессанты..........................................................................................218
16. Бензодиазепины............................................................................................219
17. Антибиотики и противомикробные средства............................219
18. Противоаритмические и противогипертонические
средства................................................................................................................220
19. Средства, усиливающие функцию почек......................................221
Ы0. Противоопухолевые средства..............................................................222
II. Метаболические исследования................................................................................223
III. Применение в судебной медицине........................................................................229
Ш.1. Экстренная токсикология........................................................................229
Ш.2. Определение присутствия препаратов.
Криминалистический анализ................................................................231
Литература..............................................................................................................................................240
Глава 6. НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ КАПИЛЛЯРНОГО
ЭЛЕКТРОФОРЕЗА..........................................................................................246
Введение..................................................................................................................................................246
I. Микрофлюидные аналитические системы........................................................253
11. Безнасосная микрофлюидика..............................................................253
12. Лаборатории в формате чипа................................................................256
13. Аналитические особенности МФАС..............................................259
14. Конструкция и изготовление микрофлюидных чипов .... 263
15. Недостатки МФАС......................................................................................271
16. МФАС в анализе гетерогенных проб..............................................272
17. Последние достижения в МФАС......................................................275
II. Мультикапиллярный электрофорез (МКЭФ)..................................................281
П.1. МКЭФ и секвенирование ДНК............................................................281
П.2. Системы детектирования в МКЭФ..................................................288
П.3. Методы оптимизации МКЭФ............................................................297
П.4. Перспективы МКЭФ..................................................................................308
Литература ................................................309
TABLE OF CONTENTS
List of abbreviations........................................................................................................................7
Chapter 1. METHOD OF HIGHLY EFFICIENT CAPILLARY
ELECTROPHORESIS (HECE)............................................................9
I. The place of HECE among analytical methods ..................................................9
II. Physical basis of the method of HECE..................................................................17
II. 1. Electrophoresis............................................................................................17
11.2. Electrosmos....................................................................................................19
11.3. Peculiarities of electrophoretic processes in variations of
HECE................................................................................................................................22
11.4. Thermal effects in HECE......................................................................24
11.5. Extra column band broadening ......................................................25
11.6. Separation parameters..............................................................................26
III. Features of separation mechanisms in variations of the HECE method 27
IV. Some methodological issues of HECE..............................................................31
IV.1. Device for capillary electrophoresis..................................................31
IV.2. Detection sensitivity................................................................................33
IV.3. Sample preparation for capillary electrophoresis........................34
IV.4. Sample input................................................................................................34
IV.5. Detectors........................................................................................................36
Literature ..........................................................................................................................................40
Chapter 2. METHODS OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS..........42
I. Matrix effects and separation..................................................................................42
II. Capillary zone electrophoresis..................................................................................43
11.1. The ionic strength of the sample........................................................45
11.2. Proteins..............................................................................................................45
11.3. Hydrogen pH parameter ........................................................................46
11.4. Sample viscosity and volume....................................................................47
11.5. Stacking and field injection................................................................49
III. Micellar electrokinetic capillary chromatography (MECC)........................56
111.1. Sample volume and surfactant in electrophoretic buffer
solution..............................................................................................................57
111.2. Surfactants and organic solvents in the sample................................59
III.3. Practical aspects and examples..........................................................60
IV. Capillary ion electrophoresis....................................................................................61
IV.1. Parallel osmotic flow factor....................................................................62
IV.2. The principle of detection based on the replacement
of electrolyte coion......................................................................................65
IV.3. Methods of sample introduction..........................................................69
IV.4. Examples ............................................................................................................74
IV.5. Modifiers of electroosmotic flow for anion analysis..................83
IV.6. CIE application..........................................................................................84
V. Sample purification..............................................................................................................87
V.1. Dilution and direct injection of the sample ..................................87
V.2. Extraction, filtration and dialysis......................................................89
V.3. Deproteinization by organic solvents ................................................91
VI. Sample matrix and accuracy..........................................................................................92
VI. 1. Factors affecting the reproducibility of peak heights and
the reproducibility of migration time................................................92
VI.2. Practical aspects........................................................................................93
VII. Practical recommendations......................................................................................94
VII.1. Facilities required for the work..........................................................94
VII.2. Capillary care and use..............................................................................95
VII.3. Electrolytes ....................................................................................................96
Literature..............................................................................................................................................97
Chapter 3. METHODS OF DETECTION IN CAPILLARY
ELECTROPHORESIS....................................................................................102
Introduction............................................................................................................................................102
I. Methods of optical detection for capillary electrophoresis..........................104
1.1. General requirements for performance and design ....................104
1.2. Direct and indirect detection................................................................107
1.3. Absorption detection................................................................................108
1.4. Fluorescence detection............................................................................119
1.5. Other methods of optical detection..................................................133
II. Electrochemical detection methods in HECE..................................................139
11.1. Potentiometric detection........................................................................139
11.2. Conductivity detection..........................................................................148
11.3. Amperometric detection........................................................................156
Literature............................................................................................................................................161
Chapter 4. APPLICATION OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS IN THE PRODUCTION OF PHARMACEUTICAL
DRUGS ..................................................................................................................172
Introduction............................................................................................................................................172
I. CE certification and sensitivity issues..................................................................174
1.1. Analytical checks......................................................................................174
1.2. Sensitization..................................................................................................175
II. Analysis of pharmaceutical products and the determination
of impurities in them........................................................................................................179
11.1. Analysis of the main components and determination
of impurities..................................................................................................................179
11.2. Determination of counterions (ion analysis)................................184
11.3. Determination of physical and chemical properties........................186
III. Analysis of natural medicines....................................................................................186
IV. Separation of hydrophobic and / or electrically neutral drugs....................188
IV. 1. Electrokinetic chromatography ............................................................188
IV.2. Capillary electrochromatography of impurities............................190
IV.3. Anhydrous capillary electrophoresis................................................190
V. Analysis of DNA and proteins................................................................................191
V.1. DNA antisense................................................................................................191
V.2. Analysis of peptides and proteins....................................................193
VI. Enantiomeric separations........................................................................................194
VI.1. Selectors based on CDs and crown ethers....................................194
VI.2. Selectors based on polysaccharides, antibiotics and proteins 196 VI.3. Micellar electrokinetic chromatography (MEC) and capillary
electrochromatography (CEC)................................................................197
Literature..............................................................................................................................................198
Chapter 5. CAPILLARY ELECTROPHORESIS FOR ANALYSIS OF
DRUG SUBSTANCE IN BIOLOGICAL LIQUIDS..................211
Introduction............................................................................................................................................211
I. Monitoring of drug substances in the treatment of the patient (MDS).. 213
1.1. Antiepileptic drugs......................................................................................214
1.2. Anti-asthma drugs......................................................................................216
1.3. Analgesics........................................................................................................217
1.4. Immunosuppressive drugs......................................................................217
1.5. Antidepressants..........................................................................................218
1.6. Benzodiazepines............................................................................................219
1.7. Antibiotics and antimicrobials..............................................................219
1.8. Antiarrhythmic and antihypertensive drugs ..................................220
1.9. Drugs that enhance kidney function ................................................221
I.10. Antineoplastic agents................................................................................222
II. Metabolic studies............................................................................................................223
III. Application in forensic medicine............................................................................229
111.1. Emergency toxicology............................................................................229
111.2. Determination of the availability of drugs ......................................231
Literature..............................................................................................................................................240
Chapter 6. THE NEWEST METHODS OF CAPILLARY
ELECTROPHORESIS..................................................................................246
Introduction......................................................................................................................................246
I. Microfluidic analytical systems (MFAS)..................................................................253
1.1. Pumpless microfluidic devices..............................................................253
1.2. Labs in chip format....................................................................................256
1.3. Analytical features of MFAS ..................................................................259
1.4. Design and manufacture of microfluidic chips............................263
1.5. Disadvantages of MFAS................................................................................271
1.6. MFAS in the analysis of heterogeneous samples..........................272
1.7. Recent achievements in MFAS..............................................................275
II. Multicapillary electrophoresis (MCEF)....................................................................281
11.1. MCEF and DNA sequencing..................................................................281
11.2. Detection systems in MCEF....................................................................288
11.3. Methods for MCEF optimization............................................................297
11.4. Perspectives of the MCEF ........................................................................308
Literature............................................................................................................................................309
The book is freely available on the Network, placed in 3 files (in Russian):
https://yadi.sk/i/k8V1cpeTT_8yig https://yadi. sk/i/4udf4HtRdcGMu https://yadi. sk/i/iwaO SswrdcGQ2
Научное издание Беленький Борис Григорьевич
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Утверждено к печати Институтом аналитического приборостроения РАН
Редактор издательства Иванова О.В.
Компьютерный набор Кузина Н.Н.
Компьютерная верстка Беленков В.Д.
Дизайн обложки Куспанова Б.С.
Лицензия ИД № 02980 от 06 октября 2000 г.
Подписано к печати 3.03.2009. Формат 60x90/16. Усл. печ. л.20.0. Уч.-изд. л. 15.5. Тираж 300 экз. Тип. зак. №........
Санкт-Петербургская издательская фирма "Наука" РАН 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, 1 E-mail: [email protected] Internet: www.naukaspb.spb.ru
Отпечатано с готовых диапозитивов в типографии Издательства СПбГУ. 199061, С.-Петербург, Средний пр. ВО, 41.
Книга в свободном доступе в Сети, размещена в 3 файлах:
https://yadi.sk/i/k8V1cpeTT_8yig https://yadi.sk/i/4udf4HtRdcGMu https://yadi.sk/i/iwaOSswrdcGQ2
9785020254084
