Высокоэффективный капиллярный электрофорез Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ISSN 0868-5886

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2019, том 29, № 3, c. 77-84

ОТ РЕДАКЦИИ (избранное: монографии ученых ИАП РАН)

РОССИЙСКАЯ академия наук

Институт аналитического приборостроения

Б. Г. Беленький

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Санкт-Петербург "Наука" 2009

9785020254084

УДК 543 ББК 24.4 Б44

Рецензенты: Л.Н. Галль, В.В. Малеев

Б44 Беленький Б. Г. Высокоэффективный капиллярный электрофорез. —

СПб.: Наука, 2009. —320 с.

ISBN 978-5-02-025408-4

Книга представляет собой практическое руководство по капиллярному электрофорезу — новому методу анализа, обладающему высокой разрешающей способностью и сочетающему преимущества электрофоретических методов разделения с возможностью автоматизации анализа и простотой количественного расчета, характерного для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Быстрота анализа и эффективность разделения в сочетании с широкой областью применения делают капиллярный электрофорез одним из наиболее совершенных аналитических методов.

Материал книги включает основы капиллярного электрофореза как метода анализа сложных биологических смесей и некоторые конкретные методики анализа.

Книга рассчитана на специалистов, работающих в области медицинского и биохимического анализа.

B. G. Belenkii

HIGH-PERFORMANCE CAPILLARY ELECTROPHORESIS

This book is a practical guide to capillary electrophoresis, a novel analytical technique with a high resolving power. Capillary electrophoresis combines the advantages of electrophoretic separation methods with the ability to automate the analysis and the simplicity of quantitation which are typical of high performance liquid chromatography.

Capillary electrophoresis combines fast analysis and efficient separation with wide applicability, making it one of the most advanced analytical techniques.

This book covers the principles of capillary electrophoresis as a preferred method to analyze complex biological mixtures as well as some examples of specific analytical methods.

This book is aimed at experts working in the field of medical and biochemical analysis.

ISBN 978-5-02-025408-4 © Б. Г. Беленький, 2009

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений ........................................................................................................................7

Глава 1. МЕТОД ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОГО

КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА (ВЭКЭ)......................9

I. Место ВЭКЭ в ряду аналитических методов ..................................................9

II. Физические основы метода ВЭКЭ........................................................................17

II. 1. Электрофорез..................................................................................................17

11.2. Электроосмос..................................................................................................19

11.3. Особенности электрофоретических процессов

в вариациях ВЭКЭ............................................................................................22

11.4. Тепловые эффекты в ВЭКЭ..................................................................24

11.5. Экстраколоночное размывание зон..................................................25

11.6. Параметры разделения..............................................................................26

III. Особенности сепарационных механизмов в вариациях метода ВЭКЭ..........................................................................................................................................27

IV. Некоторые методические вопросы ВЭКЭ........................................................31

ГУ.1. Устройство для капиллярного электрофореза..........................31

^.2. Чувствительность детектирования....................................................33

ГУ.3. Подготовка пробы для капиллярного

электрофореза................................................................................................34

ГУ.4. Ввод пробы......................................................................................................34

ГУ.5. Детекторы..........................................................................................................36

Литература............................................................................................................................................40

Глава 2. МЕТОДИКИ КАПИЛЛЯРНОГО

ЭЛЕКТРОФОРЕЗА..........................................................................................42

I. Матричные эффекты и разделение........................................................................42

II. Капиллярный зонный электрофорез......................................................................43

II. 1. Ионная сила пробы......................................................................................45

11.2. Белки....................................................................................................................45

П.3. Водородный показатель рН..................................................................46

П.4. Вязкость и объем пробы..........................................................................47

П.5. Стэкинг и полевая инжекция................................................................49

III. Мицеллярная электрокинетическая капиллярная

хроматография (МЭКХ)................................................................................................56

Ш.1. Объем пробы и ПАВ в электрофоретическом

буферном растворе......................................................................................57

Ш.2. Поверхностно-активные вещества и органические

растворители в пробе................................................................................59

Ш.3. Практические аспекты и примеры....................................................60

IV. Капиллярный ионный электрофорез....................................................................61

РУ.1. Фактор параллельного осмотического

потока..................................................................................................................62

РУ.2. Принцип детектирования на основе замещения

коионов электролита..................................................................................65

РУ.3. Методы ввода пробы..................................................................................69

РУ.4. Примеры............................................................................................................74

РУ.5. Модификаторы электроосмотического потока

для анионного анализа..............................................................................83

ГУ.6. Применение КИЭФ......................................................................................84

V. Очистка пробы....................................................................................................................87

V. 1. Разбавление и прямой ввод пробы....................................................87

V.2. Экстракция, фильтрация и диализ....................................................89

V.3. Депротеинация с помощью органических

растворителей..................................................................................................91

VI. Матрица пробы и точность..........................................................................................92

VI. 1. Факторы, влияющие на воспроизводимость высоты

пиков и на воспроизводимость времени миграции..............92

^.2. Практические аспекты..............................................................................93

VII. Практические рекомендации......................................................................................94

УП.1. Средства, необходимые для работы................................................94

УП.2. Уход за капиллярами и их использование..................................95

УП.3. Электролиты....................................................................................................96

Литература..............................................................................................................................................97

Глава 3. МЕТОДЫ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ

В КАПИЛЛЯРНОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗЕ........................................102

Введение..................................................................................................................................................102

I. Методы оптического детектирования для капиллярного

электрофореза......................................................................................................................104

11. Общие требования к характеристикам

и конструкции................................................................................................104

12. Прямое и непрямое детектирование................................................107

13. Детектирование по поглощению........................................................108

14. Детектирование по флуоресценции..................................................119

15. Другие способы оптического детектирования..........................133

II. Методы электрохимического детектирования в ВЭКЭ............................139

11.1. Потенциометрическое детектирование..........................................139

11.2. Детектирование по электропроводности......................................148

11.3. Амперометрическое детектирование..............................................156

Литература............................................................................................................................................161

Глава 4. ПРИМЕНЕНИЕ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПРОИЗВОДСТВЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ

СРЕДСТВ..................................................................................................................172

Введение..................................................................................................................................................172

I. Аттестация КЭ и вопросы чувствительности................................................174

1.1. Аналитические проверки........................................................................174

1.2. Повышение чувствительности............................................................175

II. Анализ фармацевтических препаратов и определение

примесей в них....................................................................................................................179

П.1. Анализ основных компонентов и определение

примесей........................................................................................................................179

П.2. Определение противоионов (ионный анализ)..........................184

П.3. Определение физико-химических свойств..................................186

III. Анализ природных лекарственных средств....................................................186

IV. Разделение гидрофобных и/или электрически нейтральных лекарственных препаратов..........................................................................................188

ГУ.1. Электрокинетическая хроматография (ЭКХ)..........................188

^.2. Капиллярная электрохроматография примесей......................190

РУ.3. Безводный капиллярный электрофорез........................................190

V. Анализ ДНК и белков......................................................................................................191

V.! Антисенс ДНК................................................................................................191

V.2. Анализ пептидов и белков......................................................................193

VI. Энантиомерные разделения........................................................................................194

У!1. Селекторы на основе ЦД и краун-эфиров....................................194

УГ2. Селекторы на основе полисахаридов, антибиотиков

и белков............................................................................................................196

УГ3. Мицеллярная электрокинетическая хроматография

(МЭКХ) и капиллярная электрохроматография (КЭХ)..............197

Литература..............................................................................................................................................198

Глава 5. КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДЛЯ АНАЛИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ

ЖИДКОСТЯХ......................................................................................................211

Введение..................................................................................................................................................211

I. Мониторинг лекарственных препаратов при лечении больного (МЛП)........................................................................................................................................213

11. Противоэпилептические средства....................................................214

12. Противоастматические средства........................................................216

13. Анальгетики....................................................................................................217

14. Иммуноподавляющие средства..........................................................217

15. Антидепрессанты..........................................................................................218

16. Бензодиазепины............................................................................................219

17. Антибиотики и противомикробные средства............................219

18. Противоаритмические и противогипертонические

средства................................................................................................................220

19. Средства, усиливающие функцию почек......................................221

Ы0. Противоопухолевые средства..............................................................222

II. Метаболические исследования................................................................................223

III. Применение в судебной медицине........................................................................229

Ш.1. Экстренная токсикология........................................................................229

Ш.2. Определение присутствия препаратов.

Криминалистический анализ................................................................231

Литература..............................................................................................................................................240

Глава 6. НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ КАПИЛЛЯРНОГО

ЭЛЕКТРОФОРЕЗА..........................................................................................246

Введение..................................................................................................................................................246

I. Микрофлюидные аналитические системы........................................................253

11. Безнасосная микрофлюидика..............................................................253

12. Лаборатории в формате чипа................................................................256

13. Аналитические особенности МФАС..............................................259

14. Конструкция и изготовление микрофлюидных чипов .... 263

15. Недостатки МФАС......................................................................................271

16. МФАС в анализе гетерогенных проб..............................................272

17. Последние достижения в МФАС......................................................275

II. Мультикапиллярный электрофорез (МКЭФ)..................................................281

П.1. МКЭФ и секвенирование ДНК............................................................281

П.2. Системы детектирования в МКЭФ..................................................288

П.3. Методы оптимизации МКЭФ............................................................297

П.4. Перспективы МКЭФ..................................................................................308

Литература ................................................309

TABLE OF CONTENTS

List of abbreviations........................................................................................................................7

Chapter 1. METHOD OF HIGHLY EFFICIENT CAPILLARY

ELECTROPHORESIS (HECE)............................................................9

I. The place of HECE among analytical methods ..................................................9

II. Physical basis of the method of HECE..................................................................17

II. 1. Electrophoresis............................................................................................17

11.2. Electrosmos....................................................................................................19

11.3. Peculiarities of electrophoretic processes in variations of

HECE................................................................................................................................22

11.4. Thermal effects in HECE......................................................................24

11.5. Extra column band broadening ......................................................25

11.6. Separation parameters..............................................................................26

III. Features of separation mechanisms in variations of the HECE method 27

IV. Some methodological issues of HECE..............................................................31

IV.1. Device for capillary electrophoresis..................................................31

IV.2. Detection sensitivity................................................................................33

IV.3. Sample preparation for capillary electrophoresis........................34

IV.4. Sample input................................................................................................34

IV.5. Detectors........................................................................................................36

Literature ..........................................................................................................................................40

Chapter 2. METHODS OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS..........42

I. Matrix effects and separation..................................................................................42

II. Capillary zone electrophoresis..................................................................................43

11.1. The ionic strength of the sample........................................................45

11.2. Proteins..............................................................................................................45

11.3. Hydrogen pH parameter ........................................................................46

11.4. Sample viscosity and volume....................................................................47

11.5. Stacking and field injection................................................................49

III. Micellar electrokinetic capillary chromatography (MECC)........................56

111.1. Sample volume and surfactant in electrophoretic buffer

solution..............................................................................................................57

111.2. Surfactants and organic solvents in the sample................................59

III.3. Practical aspects and examples..........................................................60

IV. Capillary ion electrophoresis....................................................................................61

IV.1. Parallel osmotic flow factor....................................................................62

IV.2. The principle of detection based on the replacement

of electrolyte coion......................................................................................65

IV.3. Methods of sample introduction..........................................................69

IV.4. Examples ............................................................................................................74

IV.5. Modifiers of electroosmotic flow for anion analysis..................83

IV.6. CIE application..........................................................................................84

V. Sample purification..............................................................................................................87

V.1. Dilution and direct injection of the sample ..................................87

V.2. Extraction, filtration and dialysis......................................................89

V.3. Deproteinization by organic solvents ................................................91

VI. Sample matrix and accuracy..........................................................................................92

VI. 1. Factors affecting the reproducibility of peak heights and

the reproducibility of migration time................................................92

VI.2. Practical aspects........................................................................................93

VII. Practical recommendations......................................................................................94

VII.1. Facilities required for the work..........................................................94

VII.2. Capillary care and use..............................................................................95

VII.3. Electrolytes ....................................................................................................96

Literature..............................................................................................................................................97

Chapter 3. METHODS OF DETECTION IN CAPILLARY

ELECTROPHORESIS....................................................................................102

Introduction............................................................................................................................................102

I. Methods of optical detection for capillary electrophoresis..........................104

1.1. General requirements for performance and design ....................104

1.2. Direct and indirect detection................................................................107

1.3. Absorption detection................................................................................108

1.4. Fluorescence detection............................................................................119

1.5. Other methods of optical detection..................................................133

II. Electrochemical detection methods in HECE..................................................139

11.1. Potentiometric detection........................................................................139

11.2. Conductivity detection..........................................................................148

11.3. Amperometric detection........................................................................156

Literature............................................................................................................................................161

Chapter 4. APPLICATION OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS IN THE PRODUCTION OF PHARMACEUTICAL

DRUGS ..................................................................................................................172

Introduction............................................................................................................................................172

I. CE certification and sensitivity issues..................................................................174

1.1. Analytical checks......................................................................................174

1.2. Sensitization..................................................................................................175

II. Analysis of pharmaceutical products and the determination

of impurities in them........................................................................................................179

11.1. Analysis of the main components and determination

of impurities..................................................................................................................179

11.2. Determination of counterions (ion analysis)................................184

11.3. Determination of physical and chemical properties........................186

III. Analysis of natural medicines....................................................................................186

IV. Separation of hydrophobic and / or electrically neutral drugs....................188

IV. 1. Electrokinetic chromatography ............................................................188

IV.2. Capillary electrochromatography of impurities............................190

IV.3. Anhydrous capillary electrophoresis................................................190

V. Analysis of DNA and proteins................................................................................191

V.1. DNA antisense................................................................................................191

V.2. Analysis of peptides and proteins....................................................193

VI. Enantiomeric separations........................................................................................194

VI.1. Selectors based on CDs and crown ethers....................................194

VI.2. Selectors based on polysaccharides, antibiotics and proteins 196 VI.3. Micellar electrokinetic chromatography (MEC) and capillary

electrochromatography (CEC)................................................................197

Literature..............................................................................................................................................198

Chapter 5. CAPILLARY ELECTROPHORESIS FOR ANALYSIS OF

DRUG SUBSTANCE IN BIOLOGICAL LIQUIDS..................211

Introduction............................................................................................................................................211

I. Monitoring of drug substances in the treatment of the patient (MDS).. 213

1.1. Antiepileptic drugs......................................................................................214

1.2. Anti-asthma drugs......................................................................................216

1.3. Analgesics........................................................................................................217

1.4. Immunosuppressive drugs......................................................................217

1.5. Antidepressants..........................................................................................218

1.6. Benzodiazepines............................................................................................219

1.7. Antibiotics and antimicrobials..............................................................219

1.8. Antiarrhythmic and antihypertensive drugs ..................................220

1.9. Drugs that enhance kidney function ................................................221

I.10. Antineoplastic agents................................................................................222

II. Metabolic studies............................................................................................................223

III. Application in forensic medicine............................................................................229

111.1. Emergency toxicology............................................................................229

111.2. Determination of the availability of drugs ......................................231

Literature..............................................................................................................................................240

Chapter 6. THE NEWEST METHODS OF CAPILLARY

ELECTROPHORESIS..................................................................................246

Introduction......................................................................................................................................246

I. Microfluidic analytical systems (MFAS)..................................................................253

1.1. Pumpless microfluidic devices..............................................................253

1.2. Labs in chip format....................................................................................256

1.3. Analytical features of MFAS ..................................................................259

1.4. Design and manufacture of microfluidic chips............................263

1.5. Disadvantages of MFAS................................................................................271

1.6. MFAS in the analysis of heterogeneous samples..........................272

1.7. Recent achievements in MFAS..............................................................275

II. Multicapillary electrophoresis (MCEF)....................................................................281

11.1. MCEF and DNA sequencing..................................................................281

11.2. Detection systems in MCEF....................................................................288

11.3. Methods for MCEF optimization............................................................297

11.4. Perspectives of the MCEF ........................................................................308

Literature............................................................................................................................................309

The book is freely available on the Network, placed in 3 files (in Russian):

https://yadi.sk/i/k8V1cpeTT_8yig https://yadi. sk/i/4udf4HtRdcGMu https://yadi. sk/i/iwaO SswrdcGQ2

Научное издание Беленький Борис Григорьевич

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Утверждено к печати Институтом аналитического приборостроения РАН

Редактор издательства Иванова О.В.

Компьютерный набор Кузина Н.Н.

Компьютерная верстка Беленков В.Д.

Дизайн обложки Куспанова Б.С.

Лицензия ИД № 02980 от 06 октября 2000 г.

Подписано к печати 3.03.2009. Формат 60x90/16. Усл. печ. л.20.0. Уч.-изд. л. 15.5. Тираж 300 экз. Тип. зак. №........

Санкт-Петербургская издательская фирма "Наука" РАН 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, 1 E-mail: main@nauka.nw.ru Internet: www.naukaspb.spb.ru

Отпечатано с готовых диапозитивов в типографии Издательства СПбГУ. 199061, С.-Петербург, Средний пр. ВО, 41.

Книга в свободном доступе в Сети, размещена в 3 файлах:

https://yadi.sk/i/k8V1cpeTT_8yig https://yadi.sk/i/4udf4HtRdcGMu https://yadi.sk/i/iwaOSswrdcGQ2

9785020254084