CC BY
24ВЫСОКАЯ АКТИВНОСТЬ ТЕЛОМЕРАЗЫ, ПАРАСИМПАТИКИ И
СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ - ПРИЧИНА УКОРОЧЕНИЯ ТЕЛОМЕР У ПАЦИЕНТОВ С ЦЕРЕБРАЛЬНЫМ АТЕРОСКЛЕРОЗОМ И САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ
Тронько Н.Д.
ГУ «Институт эндокринологии и обмена веществ имени В.П. Комисаренко
НАМН Украины», г. Киев Черская М.С.
ГУ «Институт эндокринологии и обмена веществ имени В.П. Комисаренко
НАМН Украины», г. Киев Кухарский В.М.
ГУ «Институт геронтологии имени Д. Ф. Чеботарева НАМН Украины», г. Киев
Красненков Д.С.
ГУ «Институт геронтологии имени Д. Ф. Чеботарева НАМН Украины», г. Киев
Гурьянов В.Г.
Национальный медицинский университет имени А.А. Богомольца, г. Киев, Украина
HIGH ACTIVITY OF TELOMERASE, PARASYMPATHETIC AND SUPEROXIDE DISMUTASE -THE CAUSE OF TELOMERE SHORTENING IN PATIENTS WITH CEREBRAL ATHEROSCLEROSIS AND DIABETES MELLITUS
Тгонко N.
The State Institution "V.P. Komisarenko Institute of Endocrinology and Metabolism of the
National Academy of Medical Sciences of Ukraine", Kiev
Cherska M.
The State Institution "V.P. Komisarenko Institute of Endocrinology and Metabolism of the
National Academy of Medical Sciences of Ukraine", Kiev
Kukharskyy V.
The State Institution "D.F. Chebotarev Institute of Gerontology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine ", Kiev
Krasnienkov D.
The State Institution "D.F. Chebotarev Institute of Gerontology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine", Kiev
Guryanov V.
Bogomolets National Medical University, Kiev, Ukraine
Аннотация
Количество теломер, потерянных во время каждого деления клеток, варьируется у разных людей. Предыдущие исследования показали, что увеличение окислительного стресса и хронического воспаления связаны с ускоренным укорочением теломер, однако механизм, лежащий в основе объединения укорочения длины теломер с этими факторами риска, остается гипотетическим. Целями нашего исследования является: определение взаимосвязи длины теломер с активностью теломеразы, показателями оксидативного стресса и вариабельности ритма сердца у пациентов с церебральным атеросклерозом на разных стадиях, в том числе перенесших ишемический атеротромботический инсульт и сахарным диабетом 2 типа; выявление влияния вышеуказанных факторов на прогноз укорочения длины теломер у данной категории пациентов. Материалы и методы. В комплексном клинико-инструментальном исследовании приняли участие 161 пациента с ЦА 1-3-й степени и СД 2 типа. Все пациенты проходили общепринятое клиническое, лабораторное и инструментальное исследование (электрокардиография (ЭКГ), МРТ головного мозга). Результаты: Пациенты были разделены на 2 группы в зависимости от относительной длины теломер. Третий квартиль относительной длины теломер составил 3,8926. Все пациенты со значением длины теломер ниже этого показателя были отнесены к группе коротких теломер (II), а те, у которых этот показатель превышал данное значение — к группе длинных теломер (I). Пациенты обеих групп не различались между собой по полу, количеству пациентов с СД2 и перенесших ИИ. Для выявления связи показателей с укорочением длины теломер, использовался метод построения логистических моделей регрессии. Важно учитывать и тот факт, что именно комбинация факторов риска, а не каждый фактор риска по отдельности, может приводить к укорочению теломер. Результаты нашего исследования показали, что активность теломеразы, парасимпатическая активность вегетативной нервной системы и уровень супероксиддисмутазы у пациентов с церебральным атеросклерозом и сахарным диабетом 2 типа связаны с длиной теломер — маркером клеточного старения.
Abstract
The number of telomeres lost during each cell division varies from person to person. Previous studies have shown that increased oxidative stress and chronic inflammation are associated with accelerated telomere shorten-
ing, but the mechanism underlying the combination of telomere shortening with these risk factors remains hypothetical. The objectives of our study are: to determine the relationship of telomere length with telomerase activity, indicators of oxidative stress and heart rate variability in patients with cerebral atherosclerosis at different stages, including those who underwent ischemic atherothrombotic stroke and with DM; revealing the influence of the above factors on the prognosis of shortening the telomere length in this category of patients. Materials and methods. A comprehensive clinical and instrumental study involved 161 patients with grade 1-3 CA and DM. All patients underwent conventional clinical, laboratory and instrumental studies (electrocardiography (ECG), brain MRI). Results: The patients were divided into 2 groups depending on the relative telomere length. The third quar-tile of the relative telomere length was 3.8926. All patients with telomere length below this value were assigned to the group of short telomeres (II), and those in whom this indicator exceeded this value - to the group of long telomeres (I). Patients of both groups did not differ in gender, the number of patients with T2DM and those who underwent IS. To identify the relationship of indicators with shortening of telomere length, the method of constructing logistic regression models was used. It is also important to take into account the fact that it is a combination of risk factors, and not each risk factor separately, that can lead to telomere shortening. The results of our study showed that telomerase activity, parasympathetic activity of the autonomic nervous system, and superoxide dismutase levels in patients with cerebral atherosclerosis and type 2 diabetes mellitus are associated with telomere length, a marker of cellular aging.
Ключевые слова: длина теломер, активность теломеразы, вегетативная нервная система, оксидатив-ный стресс, церебральный атеросклероз, сахарный диабет 2 типа.
Keywords: telomere length, telomerase activity, autonomic nervous system, oxidative stress, cerebral atherosclerosis, diabetes mellitus.
Цереброваскулярные заболевания (ЦВЗ) -одна из важнейших причин заболеваемости и смертности среди взрослого населения. Наиболее часто основой поражения сосудистой системы мозга, приводящей к развитию острых и хронических форм нарушений мозгового кровообращения (НМК), является генерализованный атеросклероз [7]. Сахарный диабет (СД) сопровождается ускоренными изменениями сосудов, что делает его также ведущей причиной развития сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и смертности. Ключевое звено данных изменений — гипергликемия, инсу-линорезистентность, накопление конечных продуктов гликирования. Гиперинсулинемия и гипергликемия, как и физиологическое старение, активируют процессы хронического воспаления и окислительного стресса [6, 8]. В стареющем организме, как и в организме пациента с СД, повышается уровень различных маркеров воспаления, увеличивается активность перекисного окисления ли-пидов. Все это приводит к нарушению синтеза белков, апоптозу клеток и развитию дегенеративных процессов [8].
Одной из причин разной скорости старения сердца и сосудов у пациентов с СД2 является изначально разная генетическая защищенность от воздействия внешних факторов. Длина теломер и активность теломеразы могут претендовать на роль генетических маркеров биологического возраста сосудов. Количество теломер, потерянных во время каждого деления клеток, варьируется у разных людей. Предыдущие исследования показали, что увеличение окислительного стресса и хронического воспаления связаны с более высокой потерей теломер и ускоренным укорочением тело-мер [10, 12, 19]. Несколько общих факторов риска для сердечно-сосудистых заболеваний, такие как курение, сахарный диабет, гиперхолестеринемия, гипертензии, ожирение, низкая физическая активность, потребление алкоголя и психосоциальных
проблем были связаны с короткой длиной тело-мер. Однако механизм, лежащий в основе объединения укорочения длины теломер с этими факторами риска, остается гипотетическим.
Выяснение механизмов биохимических изменений при развитии цереброваскулярных заболеваний является одной из главных проблем современной медицины. Изменение функции и структуры сердечной мышцы в ответ на острую и хроническую ишемию головного мозга уже много лет рассматривают в рамках цереброкардиального синдрома - сложного комплекса метаболических, структурных и электрофизиологических сдвигов, возникающих в миокарде в ответ на острую или хроническую ишемию головного мозга [3]. Доказано, что ишемическое повреждение мозга играет важную роль в развитии электрической нестабильности миокарда, одним из проявлений которой является снижение вариабельности ритма сердца (ВРС), используемое для прогнозирования тяжести и исхода заболевания [1, 9, 11]. Острое и/или хроническое нарушение мозгового кровообращения приводит к изменению автономной регуляции сердечно-сосудистой системы, нарушению ВРС, повышению уровня катехоламинов плазмы и увеличению случаев кардиальных аритмий, что в свою очередь может обусловить увеличение вероятности внезапной смерти [1, 2, 5, 7, 12].
В условиях хронической церебральной ишемии запускается каскад биохимических реакций в ткани головного мозга, приводящий к внутриклеточному накоплению свободных радикалов, активации процессов перекисного окисления липидов, избыточной генерации активных форм кислорода и, как следствие, гибели нейронов. Как и в других тканях, в мозге есть антиоксидантная система (су-пероксиддисмутаза - СОД, каталаза, глутатионпе-роксидаза, глутатион - GSH), которая защищает его от свободных радикалов. Церебральная ткань восприимчива к окислительному стрессу из-за ее высокой потребности в кислороде. Система GSH
необходима для защиты нейронов в условиях окислительного стресса [15, 17].
При сочетании ХИМ и СД нарушается баланс в системе оксиданты/антиоксиданты. Установлено, что механизмы антиоксидантной защиты универсальны для всех живых организмов [14]. По мере развития современных представлений становится все более понятной роль оксидативного стресса, представляющего собой дисбаланс между проокси-дантами и антиоксидантными защитными механизмами организма, как центрального звена патогенеза ряда острых и хронических состояний, и заболеваний, таких как атеросклероз, СД, ишемия и др. [14]. В конечном итоге все эти воздействия могут приводить к напряжению и последующей декомпенсации механизмов антиоксидантной защиты организма, и развитию оксидативного стресса, проявляющегося на клеточном, тканевом и органном уровнях.
Целью нашего исследования: определить степень влияния показателей оксидативного стресса и вариабельности ритма сердца на укорочение длины теломер у пациентов с церебральным атеросклерозом и сахарным диабетом 2 типа
Материалы и методы.
В комплексном клинико-инструментальном исследовании приняли участие 161 пациент с ЦА 1-3-й стадии. Диагноз «Церебральный атеросклероз» формулировался в соответствии с классификацией атеросклероза Всемирной организации здравоохранения от 2015 года и подтверждался данными лабораторных и инструментальных исследований (ультразвуковая допплерография церебральных артерий, магнитно-резонансная томография (МРТ) головного мозга).
Дизайн исследования: простое, проспективное, нерандомизированное, с последовательным включением пациентов.
В исследование не включали пациентов со всеми формами фибрилляции предсердий, с некор-ригируемым артериальным давлением (АД) > 160/90 мм рт. ст., другими нарушениями ритма, требующими проведения антиаритмическои терапии, снижением ФВ < 40 % по данным двухмерной эхо-кардиографии (ЭхоКГ), клинически выраженной сердечной недостаточностью, значительно выраженными нарушениями функции почек и печени, с наркотической или алкогольной зависимостью, перенесенными острыми воспалительными заболеваниями в течение предшествующего месяца. Также в исследовании не принимали участие пациенты,
перенесшие реваскуляризацию, с нестабильной стенокардией или инфарктом миокарда и ревматическими пороками сердца.
Все пациенты проходили общепринятое клиническое, лабораторное (общий анализ крови и мочи, определение липидного профиля, уровня кре-атинина, мочевины, глюкозы, аспартатаминотранс-феразы, аланинаминотрансферазы, билирубина) и инструментальное исследование (трансторакальная ЭхоКГ, электрокардиография (ЭКГ), ультразвуковая допплерография сосудов головы и шеи, МРТ головного мозга).
Этические аспекты. Протокол исследования был одобрен комитетами по этике ГУ «Институт эндокринологии и обмена веществ имени В.П. Ко-миссаренко» и ГУ «Институт геронтологии имени Д. Ф. Чеботарева» (оба являются частью Национальной академии медицинских наук Украины). Все участники дали письменное информированное согласие. Хельсинкская декларация (2000 г.) и применимые национальные стандарты, касающиеся их участия в исследованиях, были учтены.
Сбор и хранение образцов крови. Образцы крови отбирали в вакутайнеры, содержащие ЭДТА. На протяжении 30 минут после забора крови производилось выделение мононуклеарных клеток периферической крови на градиенте (1.077г/см3). После выделения клетки замораживались и хранились в жидком азоте при -196°C. Выделение ДНК производили из размороженных клеток, используя метод фенол-хлороформной очистки [14]. Контроль чистоты, концентрации и целостности ДНК проводили с помощью спектрофотомерии и агарозного гель-электрофореза.
Измерение длины теломер (ДТ).
Относительные длины теломер (ОДТ) измеряли с помощью мультиплексной количественной полимеразой цепной реакцией в реальном времени (RT-qPCR - кПЦР-РВ) [4]. Реакционная смесь для ПЦР была приготовлена с использованием коммерческого набора реагентов Luna® Universal qPCR и RT-qPCR (New England Biolabs) с добавлением бетаина (Sigma-Aldrich) до конечной концентрации 1М. Для мультиплексной кПЦР, пара теломерных праймеров telg и telc (конечные концентрации каждого - 450 нмоль) были объединены с парой прай-меров альбумина albu и albd (конечные концентрации каждого - 250 нмоль) в мастер-микс. Список праймеров, используемых для анализа кПЦР-РВ, приводится ниже в таблице 1.
Таблица 1
Список праймеров, использованных для количественной полимеразой цепной реакцией в реальном времени (кПЦР-РВ)
Название праймера Последовательность нуклеотидов праймера
TS 5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'
ACX 5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3'
telg 5'-ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTG GGTTTGGGTTAGTGT-3'
tele 5'-TGTTAGGTATCC CTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA-3'
albu 5'-CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGAA ATGCTGCACAGAATCCTTG-3'
Профиль термоциклирования был следующим: 95°С - 15 мин; 2 цикла: 94 С - 15 с и 49 С - 15 с; 32 цикла: 94 С -15 с, 62 С - 10 с, 74 С - 15 с и с получением сигнала, 84 С - 10 с, 88 С - 15 с и с получением сигнала. Для формирования калибровочной кривой ПЦР проводили для четырех концентраций эталонной ДНК (в двух экземплярах), которые охватывают диапазон 27-кратных серийных разведений.
Все образцы ДНК были проанализированы в триплетах. Кривые амплификации были сгенерированы программным обеспечением Opticon Monitor 3. Для этого, после термоциклирования и сбора исходных данных, с помощью программного обеспечения Opticon Monitor 3 для каждой постановки были построены две стандартные кривые: для тело-мерного сигнала и для гена сигнала однокопийного гена альбумина. ОДТ были выражены в виде отношения T/S, где Т - число теломерных повторов, а S - число повторов гена альбумина.
Измерение активности теломеразы. Теломе-разную активность определяли с помощью протокола амплификации тандемных повторов с детекцией в реальном времени (ПАТП-РВ) [2]. Моно-нуклеарные клетки переферической крови и клетки HEK293 (положительный контроль) обрабатывали буфером для лизиса NP-40 от Invitrogen (50 ммоль Трис, рН 7.4, 250 ммоль NaCl, 5 ммоль ЭДТА, 50 ммоль NaF, 1 ммоль Na3V04, 1% Nonidet™ P40 (NP40) 0.02% NaN3) с 1 ммоль PMSF (Sigma-Aldrich) и 10 мкл/мл (об./об.) раствора с ингибитором протеаз (Sigma-Aldrich) на льду в течении 30 минут. Последующее центрифугирование проводили при 16400g в течение 20 мин при +4 C. 180 мкл супернатанта переносили в свежую пробирку. Измерение концентрации белка производили с помощью набора для анализа белка Pierce™ BCA (Thermo Scientific) согласно протоколам производителя.
Реакционную смесь для кПЦР-РВ готовили на основе Luna Universal qPCR и RT-qPCR (New England Biolabs) с добавлением EGTA до конечной кон-цетрации 5мМ, конечная концентрация праймеров была 400 нМ для ACX и 400нМ для TS. 2 мкл лизата добавляли к 23 мкл смеси ПАТП-РВ и инкубировали в течение 30 мин при 30 °C. Затем проводили ПЦР при следующих условиях: 95°С - 1 мин; 40 циклов: из 95°С - 15 с, 60 С - 1 мин и с получением сигнала. ПЦР-продукты были количественно определены с помощью Chromo4 (Bio-Rad) и проанализированы в программном обеспечении Opticon Monitor v3.1. Клетки НЕК293 использовали для генерации стандартной кривой, построенной на точках пяти вариантов разведений.
Измерение активности каталазы, суперок-сиддисмутазы, глутатиона и других маркеров оксидативного стресса. Для определения активности каталазы (КФ 1.11.1.6) использовали гемолизат крови, который получали путем осмотического гемолиза цельной крови с дистиллированной водой и одного цикла замораживания с последующим центрифугированием. Разведенный гемолизат крови инкубировали с раствором гидрогена пероксида и
спекгрофотометрически определяли активность каталазы по количеству продукта реакции остаточного гидрогена пероксида с молибдатом аммония [13]. Для создания калибровочного графика использовали раствор коммерчески доступной каталазы (Sigma, С9322). Результаты выражали в единицах активности фермента на 1 мл крови.
Активность СОД (КФ 1.15.1.1) в плазме крови определяли непрямым спектрофотометрическим методом на основе реакции супероксид-зависимого окисления кверцетина, в щелочной среде, в присутствии тетраметилетилендиамина [17]. Реакция сопровождается обесцвечением рабочего раствора в области пропускания с максимумом 406 нм. Фермент СОД перехватывает супероксид-радикалы и подавляет окисление кверцетина. При времени инкубации 20 мин. степень ингибиции строго количественно зависит от концентрации СОД. Содержание фермента в биологическом материале рассчитывается с помощью калибровочного графика, полученного на основании измерения активности коммерчески доступной СОД (Sigma, S9697). Активность СОД выражали в единицах активности на 1 л плазмы.
Концентрацию ТБК-активных продуктов (МДА) определяли, используя реакцию нагревания малонового диальдегида с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) в кислой среде с образованием окрашенного триметинового комплекса с максимумом флуоресцентного излучения 530 нм при условиях возбуждения светом при 484 нм [22, 23]. Плазму крови инкубировали с ТБК в присутствии трихлор-уксусной кислоты при нагревании. После охлаждения образцов экстрагировали ТБК-активные продукты н-бутанолом. Интенсивность флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре. Концентрацию ТБК-активных продуктов (МДА) рассчитывали за калибровочной кривой, созданной с использованием коммерческого МДА (Sigma, 63287) и выражали в мкМ/л.
Содержание GSH в плазме крови определяли спектрофлуориметрическим методом с использованием ортофталевого альдегида, в результате реакции которого с GSH образуются высокофлуоресцентные продукты, которые возбуждаются излучением при 350 нм и имеют четко выраженный пик флуоресценции при 420 нм [18]. Концентрацию GSH рассчитывали за калибровочной кривой, созданной с использованием коммерческого GSH (Синбиас, Украина) и выражали в мкМ/л. Интенсивность флюоресценции конечных продуктов гли-кирования в плазме крови измеряли при возбуждении 370 нм и эмиссии 440 нм с помощью спектро-флуорометра Varioscan и выражали в мкМ/л [7]. Для создания калибровочной кривой был приготовлен условный гликированный белок - альбумин-глюкоза, для чего смесь БСА и d-глюкозы в фосфатном буфере инкубировали при 37°С в течение 6 недель.
Исследование ВРС проводилось на аппарате Schiller AT-10 plus (Швейцария) с использованием статистического анализа временной области и спектрального анализа короткой (пятиминутной)
последовательности электрокардиографических интервалов R-R в состоянии покоя. Определялись следующие показатели временного анализа: стандартное отклонение (SDNN, мс), стандартное отклонение разностей продолжительности соседних интервалов R-R (RMSSD, мс). При выполнении
спектрального анализа определялись: общая мощ-
2
ность спектра ритма сердца (1Р, мс ), мощности в
2
диапазоне 0,00-0,04 Гц (УН, мс ), 0,04-0,15 Гц (Н, 22 мс ), 0,15-0,4 Гц (М, мс ) и соотношение НУМ. Спектральные составляющие Н и М анализировались как в абсолютных значениях, так и в производных от них нормализованных единицах (н.е.), которые автоматически рассчитывались по формулам: 1Нпогт = И / (№ - УН) х 100 % и Мпогт = М / ОР - УН) х
100 %. Определялась также структура спектра в процентном соотношении составляющих: %УН",
%н; %М
Измерение базовых характеристик. Систолическое артериальное давление (САД) и диастоли-ческое артериальное давление (ДАД) (мм рт. ст.) измеряли дважды с помощью стандартного сфиг-моманометра в положении пациента сидя после не менее 10 мин. отдыха. Уровни глюкозы в плазме определяли стандартным глюкозооксидазным методом.
Статистический анализ. Для представления результатов в случае количественных переменных рассчитывали среднее значение показателя и его среднеквадратическое отклонение (±8Б) в случае нормального закона распределения либо медианное значение показателя (Ме) и значения первого ^1) и третьего (0ш) квартилей в случае закона распределения, отличного от нормального. Проверку
распределения на нормальность проводили с использованием критерия Шапиро-Уилка. Для представления качественных признаков рассчитывали их частоту (%). При проведении сравнения количественных показателей в двух группах использованы ^критерий (в случае нормального закона распределения), критерий Манна-Уитни (в случае закона распределения, отличного от нормального). При проведении сравнения качественных показателей использован точный критерий Фишера. Критический уровень значимости во всех случаях р<0,05.
При проведении анализа связи факторных признаков с риском укорочения длины теломер использован метод построения и анализа моделей логистической регрессии. Для оценки адекватности моделей использован метод анализа кривых операционных характеристик (ЯОС-кривые), рассчитывалась площадь под кривой (АиС) и ее 95% доверительный интервал (95% ДИ). Для оценки направления и силы связи факторных признаков с риском укорочения длины теломер рассчитывался показатель отношения шансов (ОЯ) и соответствующий 95% ДИ. Статистический анализ выполнен в программе Ме^а1с V. 19.1.3 (Ме^а1с8о^аге1пс., Бгоек^гааг, Бельгия, 1993-2019) [10].
Результаты:
Пациенты были разделены на 2 группы в зависимости от относительной длины теломер (таб. 2). Третий квартиль относительной длины теломер составил 3,8926. Все пациенты со значением длины теломер ниже этого показателя были отнесены к группе коротких теломер (II), а те, у которых этот показатель превышал данное значение — к группе длинных теломер (I). Пациенты обеих групп не различались между собой по полу, количеству пациентов с СД2 и перенесших ИИ.
Таблица 2
Основные клинические характеристики и маркеры оксидативного стресса в зависимости от относитель-
Показатель I (n=21) II (n=64) Уровень значимости различия, p
возраст 67.9±9.6 65±9.8 0.233
Каталаза (САТ) 508±148 541±152 0.383
Глутатион (GSH) 3.575 (3.394-3.646) 3.455 (3.383-3.545) 0.179
Супероксиддисмутаза (SOD) 8.991 (7.928-9.653) 8.429 (7.988-8.951) 0.1
Тиобарбитурореактивные вещества (TBARs) 17.29 (15.843-18.55) 17.475 (16.1-18.85) 0.933
Конечные продукты глики-рования (AGE) 31.7±7.6 30.5±7.4 0.567
Активность теломеразы 3.51 (3.145-4.265) 2.845 (2.185-4.25) 0.066
Индекс HRV 7 (4.75-10.5) 7.5 (6-1) 0.58
Триангулярный индекс 104 (76-168) 104 (84-144) 0.838
ОНЧ 278 (44-755.75) 323.5 (58.5-581) 0.903
НЧ 128 (60.25-51) 114 (4-26) 0.32
ВЧ 49.75 (-54.165-593.75) 42 (-45.425-169.205) 0.287
НЧ/ВЧ 0.29 (-106.09-0.712) 0.36 (-98.805-1.885) 0.508
Примечание: приведено среднее значение ± 8Б в случае нормального закона распределения, Ме (01; 0ш) в случае закона распределения, отличного от нормального.
Для выявления связи показателей, представленных в таблице 2 с укорочением длины теломер, использовался метод построения логистических моделей регрессии. Важно учитывать и тот факт, что именно комбинация факторов риска, а не каждый фактор риска по отдельности, может приводить к укорочению теломер [16]. Для отбора совокупности значимых факторов риска использовался
метод пошагового включения/исключения признаков (Stepwise при пороге исключения p>0.3 и пороге включения p<0.2). На выделенных значимых факторах риска была построена многофакторная модель логистической регрессии, в которую вошли показатели, представленные в таблице 3.
Таблица 3
Многофакторный анализ прогнозирования укорочение длины теломер с показателями оксидативного
Независимые переменные Коэффициент регрессии, b±m Уровень значимости отличия коэффициента от 0, p OR (95% ДИ)
SOD -0.70±0.38 0.067 0.49 (0.23-1.05)
ВЧ -0.0005±0.0002 0.039 0.999 (0.999-1.000)
Активность теломеразы -0.17±0.09 0.069 0.84 (0.70-1.01)
Примечание: р I 0.05 - отличие коэффициента модели от 0 статистически значимо.
Выявлена согласованность выделенных факторных признаков с риском укорочения теломер -АиС=0.76 (95% ДИ 0.64 - 0.85) (рис.1), что может указывать на полноту модели и предикторов укоро-
чения длины теломер, рассмотренных в данном исследовании. Все представленные в таблице 3 показатели являются весомыми в общей многофакторной модели.
Рисунок 1. ROC-кривая 3-х факторной модели прогнозирования риска укорочения теломер,
AUC=0.76 (95% ДИ 0.64 - 0.85)
Обсуждение
Теломеры — это концевые участки линейной молекулы ДНК, постепенно укорачивающиеся при каждом делении клеток. Как только длина теломер-ной ДНК становится угрожающе низкой, запускается Р53/Р21 — индуцированное старение клетки при сохранении ее метаболической активности [2, 11]. Имеются данные, что длина теломер в лейкоцитах отражает длину теломер в стволовых клетках и соответствует их длине в эндотелиальных проге-ниторных клетках, что позволяет рассматривать данный параметр как биомаркер старения сосудов. Теломераза человека отвечает за поддержание и
удлинение теломер и состоит из теломеразного РНК-компонента (TERC) и теломеразной обратной транскриптазы (TERT), каталитического компонента. TERT использует TERC в качестве шаблона для синтеза новых теломерных повторений ДНК при одноцепочечном повторении для поддержания длины теломер. Некоторые клетки как стволовые клетки, кроветворные клетки-предшественники, активированные лимфоциты и большинство раковых клеток имеют высокий уровень деятельности теломеразы для того, чтобы укорачивать теломеры и поддержать безграничное де-
ление клетки. Однако, соматические клетки вообще имеют низкий или «undetectable» уровень деятельности теломеразы с лимитированной долговечностью. Теломера и ее целостность регулируются с помощью взаимодействия теломеразы и определенных белков [2]. Активность теломеразы снижается с возрастом, но заметно увеличивается в ответ на повреждение [2].
У людей теломеры состоят из сотен и тысяч повторяющихся последовательностей TTAGGG на хромосомных концах для поддержания геномной целостности [2, 12]. Поскольку репликация ДНК асимметрична вдоль двойной нити, последовательности в З'-гидроксильных концов теряет 30-200 нуклеотидов с каждой репликации ДНК и делением клеток [2]. Теломеры обеспечивают повторяющийся noncoding последовательность на 3 ' конце для того, чтобы предотвратить потерю критической генетически зашифрованной информации во время репликации. Кроме того, тело-меры покрыты комплексом из шести белков (те-ломер повторяю-обязательный фактор 1 (TRF1), теломер повторяю-обязательный Фактор 2 (TRF2), репрессора-активатора протеина 1 (Rapl), TRF1 и TRF2 взаимодействия ядерных белков 2 (TIN2), трипептидил-пептидазы 1 (TPP1), и защиты теломер 1 (POT1)), также таких известных белков [11], которые упакованы в компактную структуру T-петли для того, чтобы предотвратить от ошибок репликации. Поэтому теломеры были предложены как митотические часы, которые измеряют, сколько раз клетка разделилась. Количество теломер, потерянных во время каждого деления клеток, варьируется у разных людей. Предыдущие исследования показали, что увеличение окислительного стресса и хронического воспаления связаны с более высокой потерей теломер и ускоренным укорочением теломер. Несколько общих факторов риска для сердечно-сосудистых заболеваний, такие как курение, сахарный диабет, гиперхолестеринемия, гипертензии, ожирение, низкая физическая активность, потребление алкоголя и психосоциальных проблем были связаны с короткой длиной теломер. Однако механизм, лежащий в основе объединения укорочения теломер с этими факторами риска, остается гипотетическим.
Укорочение или повреждения теломер запускает повреждения ДНК, в результате чего происходит сенесценция или апоптоза клеток [19]. Поэтому при укорочении теломер растет пул так называемых сенесцентних клеток, которые являются известной причиной хронического воспаления [20] и соответственно растет уровень оксидативного стресса. Рост активности СОД является типичной адекватным ответом организма на усиление окси-дативного стресса. Следует заметить, что в свою очередь оксидативный стресс приводит к укорачиванию теломер [20], круг замыкается, организм неотвратимо движется к летальному исходу.
Многочисленные исследования подтвердили высокую прогностическую значимость определе-
ния спектральных показателей ВРС: НЧ/ВЧ отражает общую мощность спектра воздействия обоих отделов вегетативной нервной системы, ВЧ — изменения тонуса парасимпатической нервной системы, НЧ — симпато-парасимпатическое влияние, ОНЧ — гуморальную регуляцию [2, 3]. В поисках причин связи ВРС с относительной длиной теломер мы рассмотрели клеточное старение. В 1961г Hayflick L. экспериментально установил, что способность соматических клеток человека к пролиферации ограничена. После прекращения деления в клетках происходят необратимые изменения, ведущие к ее гибели. Старение клетки, основанное на лимите Hayflick L., получило название репликатив-ного. Укорочение теломер стало одной из теорий, объясняющих процесс репликативного старения. Когда длина теломер достигает критического размера, клетка переходит в терминальное неделяще-еся состояние — клеточное старение [9]. Существует предположение, что длина теломер как маркер биологического возраста связана с возрастными изменениями вегетативной регуляции ритма сердца. По результатам настоящего исследования прогноз укорочения ДТЛ ассоциирован с парасимпатическим отделом вегетативной нервной системы, причем констатирована обратно пропорциональная зависимость. Механизмом связи ДТЛ с ВЧ может быть репликативное старение нейронов ВНС и кардиомиоцитов.
Клинические работы по изучению взаимосвязи длины теломер с показателями ВРС немногочисленны. Было обнаружено, что у мужчин с более короткой ДТЛ отмечается замедленное восстановление временных параметров ВРС и систолического артериального давления в ответ на стресс по сравнению с группой мужчин с более длинными ДТЛ
[14].
Ученые выявили, что у детей 5-6 лет с короткими теломерами в ответ на задания (стресс) отмечалась более высокая симпатическая и низкая парасимпатическая активность. Эти данные дают основания предполагать, что реакция ВНС в ответ на стресс генетически предопределена и связана с длиной теломер [15].
Выводы:
Результаты нашего исследования показали, что активность теломеразы, изменения ВРС и SOD у пациентов с церебральным атеросклерозом связаны с длиной теломер — маркером клеточного старения. Длина теломер может стать ранним маркером ослабления автономной регуляции сердечной деятельности и отражать истинный биологический возраст ВНС.
Список литературы
1. Banerjee P, Jagadeesh S. Non-Radioactive Assay Methods for the Assessment of Telomerase Activity and Telomere Length. Methods in Molecular Biology 2009; 1: 383-394.
2. Bekaert S, De Meyer T, Rietzschel ER, et al. Telomere length and cardiovascular risk factors in a middle-aged population free of overt cardiovascular disease. Aging Cell. 2007; 6: 639-647.
3. Benetos A, Kark JD, Susser E, et al. Trackin and fixed ranking of leukocyte telomere length across the adult life course. Aging Cell. 2013; 12: 615-621.
4. Benetos A, Toupance S, Gautier S, et al. Short Leukocyte Telomere Length Precedes Clinical Expression of Atherosclerosis. Circulation Research. 2018; 122: 616-623.
5. Cawthon R. Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative PCR method. Nucleic Acids Research. 2009; 37: e21-e21.
6. Belsky D, Moffitt T, Cohen A, et al. Eleven Telomere, Epigenetic Clock, and Biomarker-Composite Quantifications of Biological Aging: Do They Measure the Same Thing? Am J Epidemiol. 2018; 187(6):1220-1230.
7. Das BK, Sun TX, Akhtar NJ, et al. Fluorescence and immunochemical studies of advanced glycation-related lens pigments. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998; 39: 2058-2066.
8. De Meyer T, Nawrot T, Bekaert S, et al. Telomere Length as Cardiovascular Aging Biomarker: JACC Review Topic of the Week. 2018. JACC; 72: 805-813.
9. De Meyer T, Rietzschel ER, De Buyzere ML et al. Systemic telomere length and preclinical atherosclerosis: the Asklepios Study. Eur Heart J. 2009; 30: 3074-3081.
10. Fiorenza Magi, Ivan Dimauro, Fabrizio Margheritini et al. Telomere length is independently associated with age, oxidative biomarkers, and sport training in skeletal muscle of healthy adult males. Free Radic.Res.2018; 52:639-647.
11. Goth L. A simple method for determination of serum catalase activity and revision of reference range. Clin Chim Acta.1991; 196: 143-151.
12. José Santiago Ibanez-Cabellosa, Giselle Pérez-Machadob, Marta Seco-Cerveraa, et al. Acute telomerase components depletion triggers oxidative stress as an early event previous to telomeric shortening. Redox Biology. 2018; 14:398-408.
13. Koriath M, Müller C., Pfeiffer N, et al. Relative Telomere Length and Cardiovascular Risk Factors. Biomolecules. 2019; 9:192.
14. Kostyuk VA, Potapovich AI. Superoxide-driven oxidation of quercetin and a simple sensitive assay for determination of superoxide dismutase. Biochem Int. 1989; 19:1117-1124.
15. Mokrasch LC, Teschke EJ. Glutathione content of cultured cells and rodent brain regions: a specific fluorometric assay. Anal Biochem.1984; 140: 506-509.
16. Nettle D, Andrews C, Reichert S, et al. Early-life adversity accelerates cellular ageing and affects adult inflammation: experimental evidence from the European starling. Sci. Rep.2017. 7: 40794.
17. Reichert S, Stier A, Zahn S, et al. Increased brood size leads to persistent eroded telomeres. Front. Ecol. Evol. 2014;2: 10114.
18. Sambrook J, Russell D. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol: Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006; 1; pdb.prot4455.
19. Saretzki G. Telomeres, Telomerase and Ageing. Subcell Biochem. 2018;90:221-308. doi:10.1007/978-981-13-2835-0_9
20. Shimizu I, Minamino T. Cellular senescence in cardiac diseases. J Cardiol. 2019;74(4):313-319. doi:10.1016/j.jjcc.2019.05.002
21. Toupance S, Labat C, Temmar M, et al. Short telomeres, but not telomere attrition rates, are associated with carotid atherosclerosis. Hypertension. 2017; 70: 420-425.
22. Tüközkan, Nurten, Hüsamettin Erdamar. Measurement of Total Malondialdehyde in Plasma and Tissues by High-Performance Liquid Chromatography and Thiobarbituric Acid Assay. Firat Tip Dergisi. 2006; 11: 88-92.
23. Wasowicz W, Neve J, Peretz A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid-reactive substances in serum: importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clin Chem. 1993; 39: 2522-2526.
