CC BY
9
УДК 630*232.311.3
ВЫХОД НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ QUERCUS ROBUR L. В ЗАВИСИМОСТИ ОТ МЕТОДА ЭКСТРАКЦИИ
Петюренко Марта Юрьевна
Кандидат сельскохозяйственных наук, научный сотрудник лаборатории биохимии,
молекулярной генетики и физиологии растений ФГБУ «Всероссийский научно-
исследовательский институт лесной генетики, селекции и биотехнологии»
В статье показана эффективность выхода нуклеиновой кислоты из вегетативных тканей дуба черешчатого (Quercus robur L.) в зависимости от метода экстракции ДНК. В наших исследованиях максимальный выход нуклеиновой кислоты отмечен с использованием СТАВ-буфера (выход составлял до 674 нг/мкл), но при этом использование коммерческого набора для выделения геномной ДНК из растительных образцов DNEasy Plant Mini Kit (Qiagen) давало так же высокий выход препарата дезоксирибонуклеиновой кислоты (до 280 нг/мкл) относительно трёх остальных коммерческих наборов, что позволяет получить образец ДНК пригодный для проведения большинства молекулярно-генетических исследований.
Ключевые слова: Quercus robur L, экстракция ДНК, СТАВ-буфер, коммерческие наборы, полимеразная цепная реакция (ПЦР), SSR-локус.
NUCLEIC ACID YIELD FROM QUERCUS ROBUR L. DEPENDING ON THE EXTRACTION METHOD
Peturenko M. Yu.
Candidate of Agricultural Sciences, Researcher at the Laboratory of Biochemistry, Molecular
Genetics and Plant Physiology of the All-Russian Research Institute of Forest Genetics,
Breeding and Biotechnology
The article shows the efficiency of nucleic acid release from vegetative tissues of English oak (Quercus robur L.) depending on the DNA extraction method. In our studies, the maximum yield of nucleic acid was observed using the CTAB buffer (yield was up to 674 ng/pl), but the use of the commercial kit for the isolation of genomic DNA from plant samples DNEasy Plant Mini Kit (Qiagen) also gave a high yield of the deoxyribonucleic acid preparation acids (up to 280 ng/pl) relative to the other three commercial kits, which makes it possible to obtain a DNA sample suitable for most molecular genetic studies.
Keywords: Quercus robur L, DNA extraction, CTAB buffer, commercial kits, polymerase chain reaction (PCR), SSR locus.
В настоящее время в изменяющихся условиях среды актуальной задачей является изучение генетической изменчивости у основных лесообразующих пород для последующего использования в мероприятиях по сохранению генофонда основных лесообразователей РФ. Одним из подобных приложений является молекулярное маркирование с помощью изменчивых участков ДНК для целей генетической идентификации и изучения популяционно-генетической
структуры [1]. В настоящее время к наиболее востребованным молекулярным методам можно отнести микросателлитные маркеры ББ1*$ и !ББ1*$, анализируемые на основе ПЦР. Известно, что ДНК-экстракция из древесных растений может вызывать сложности из-за большого количества метаболитов в образцах, в
особенности это касается и листьев дубов, содержащих высокое количество в вегетативных тканях фенольных соединений, которые могут влиять на очистку, количественное определение, амплификацию с помощью ПЦР [2, 3]. На сегодняшний день многочисленными исследованиями
подтверждено успешное проведение экстракции ДНК из растений со СТАВ, в том числе и дуба, однако для депротеинизации ДНК в этом методе используют токсичные органические растворители. В отличие от этого, коммерческие наборы для выделения ДНК, напротив, не требует экстракции фенолом или хлороформом или осаждения спиртом и включают минимальную обработку образца, но ограничивающим фактором выполнения анализов оказывается стоимость препаратов.
Поэтому целью нашей работы является сравнение эффективности выхода нуклеиновой кислоты из вегетативных тканей дуба черешчатого (Quercus robur L.) в зависимости от метода экстракции ДНК.
Ранее, нами была исследована эффективность выделения ДНК из вегетативных тканей Quercus robur L с использованием классического метода СТАВ и трёх коммерческих наборов для выделения ДНК из растительной ткани: diaGene (Диаэм), LumiPure from AnySample (Lumiprobe), набор реагентов «Фитосорб» (Синтол). Показано, что протокол выделения ДНК с использованием СТАВ-буфера дает максимальный выход нуклеиновой кислоты по сравнению с коммерческими наборами, использованными в исследовании, по причине их низкого выхода препарата дезоксирибонуклеиновой кислоты [4]. При оптимизации методики нами был протестирован дополнительно набор DNEasy Plant Mini Kit (Qiagen). Стоит особо отметить, что процедуры DNeasy Plant оптимизированы для использования не только с тканями листьев травянистых растений, но также с успехом могут использоваться для выделения ДНК из лесных древесных пород, в том числе и из вегетативных тканей дуба черешчатого, что является основным фактором включения данного коммерческого набора в исследование.
В работе использовали молодые вегетативные ткани листьев дуба черешчатого, экстракцию ДНК проводили согласно инструкции производителя. Качественный анализ на чистоту выделенной ДНК определяли путем электрофореза в 1,5% агарозном геле в 1 х трис-ацетатном электродном буфере (2М Трис-(гидроксиметил)аминометан, 50 мМ ЭДТА, 1М уксусная кислота, pH 8,4, Thermo Fisher Scientific, Литва). Для количественного определения ДНК использовали флуориметр настольный Qubit 2.0 (Invitrogen/Life Technologies, США) с использованием реагентов Qubit™. Для проверки реакционной способности препарата нуклеиновой кислоты после выделения на наборе DNEasy Plant Mini Kit проводили ПЦР реакцию, используя готовую смесь для ПЦР ScreenMix-HS (Евроген, Россия) с 5 микросателлитными локусами, подобранными к геному дуба черешчатого ZAG75, ZAG87, ZAG96, ZAG110, ZAG112. Процедуры амплификации проводили в соответствии с условиями, предложенными авторами [5].
Выделенная ДНК с помощью набора DNEasy Plant Mini Kit характеризовалась отсутствием примесей РНК и полисахаридов, что отражено при постановки ПЦР реакции с микросателлитными локусами, подобранными к геному дуба черешчатого (Рисунок 1).
Quercus robur L.
М 2449 2450 2449 2450 2449 2450 2449 2450 2449 2450 М ZAG 75 ZAG 87 ZAG 96 ZAG 110 ZAG 112
Рисунок 1 - Электрофореграмма результатов амплификации локусов 2А075, 2А087, 2А096, 2А0110, 2А0112. М - ДНК-маркер (фрагменты 1500-100 п. н.). В верхнем индексе - номера образцов
Оиегсиэ гоЬиг I.
При этом средний выход нуклеиновой кислоты с применением данного набора составлял в среднем до 280 нг/мкл, что почти на порядок выше значений полученных с использованием наборов diaGene, LumiPure from AnySample, «Фитосорб». Стоит особо отметить, что для избегания колебаний показаний концентрации препарата ДНК при анализе необходимо использовать
автоматические гомогенизаторы, тем самым добиться его максимального выхода для всех исследуемых образцов в выборке деревьев.
Таким образом, показано, что использование протокола со CTAB-буфером и
набором DNEasy Plant Mini Kit даёт более высокий выход нуклеиновой кислоты из вегетативной ткани дуба черешчатого (Quercus robur L.) по сравнению с коммерческими наборами diaGene, LumiPure from AnySample, «Фитосорб». Использование колонок DNEasy Plant Mini Kit позволяет проводить амплификацию специфических
микросателлитных локусов для полимеразной цепной реакции с целью проведения большинства молекулярно-генетических
исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Крутовский, К.В. Перспективы использования геномных исследований в лесном хозяйстве // Сибирский лесной журнал. - 2014. - № 4. - С. 11-15.
2. Рябушкина Н.А. Омашева М.Е., Галиакпаров Н.Н. Специфика выделения ДНК из растительных объектов // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. - 2012. - № 2. - С. 9-6.
3. Попова А. А., Гродецкая Т. А., Молчанов В. В., Евлаков П. М. Подбор и оптимизация методов экстракции ДНК из различного растительного материала // Вестник Поволжского государственного технологического университета. Сер: Лес. Экология. Природопользование. 2022. № 1 (53). С. 69-77.
4. Петюренко М.Ю. Сравнение эффективности выделения ДНК из Quercus robur L. с помощью коммерческих наборов реагентов // ФГБУ «ВНИИЛГИСБИОТЕХ» - НАУКА И ПРАКТИКА: сб.научн.тр. /М.: Изд-во «Перо», 2021. - С.215-223.
5. Kampfer S., Lexer Ch., Glossl J., Steinkellner H. Characterization of (GA)n microsatellite loci from Quercus robur // Hereditas. - 1998. - No. 129. - P. 183-186.
