ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ, ПЕРСПЕКТИВНЫХ ДЛЯ СОЗДАНИЯ БИОУДОБРЕНИЯ ПОД КОРМО-БОБОВЫЕ КУЛЬТУРЫ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

МРНТИ 34.27.17

И.Э. СМИРНОВА1, Э Р. ФАЙЗУЛИНА1, Л.Г. ТАТАРКИНА1, Ш.А. БАБАЕВА2 1ТОО «Научно-производственный центр микробиологии и вирусологии», Алматы,

Казахстан

Национальная Акдемия Наук Азербайджана, Институт микробиологии, Баку,

Азербайджан

ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ, ПЕРСПЕКТИВНЫХ ДЛЯ

СОЗДАНИЯ БИОУДОБРЕНИЯ ПОД КОРМО-БОБОВЫЕ КУЛЬТУРЫ

Аннотация

В Алматинской области Казахстана проведен сбор почв и целлюлозосодержащих природных субстратов из ризосферы здоровых растений донника и люцерны. В общей сложности было собрано 84 образца природных субстрата, из них - 46 образцов почвы и 38 растительных остатков. В лабораторных условиях проведено выделение целлюлолитических бактерий и получено 54 чистых культуры бактерий. Изучены их основные культурально-морфологические и биохимические признаки. Установлено, что выделенные культуры относятся к родам Bacillus, Bacterium, Pseudomonasrn Cellulomonas.

Ключевые слова: целлюлолитические бактерии, выделение, почва, целлюлозосодержащие природные субстраты, донник, люцерна.

Одной из насущных проблем Агропромышленного комплекса РеспубликиКазахстан является низкая продуктивностьживотноводства,которое является традиционной и приоритетнойотраслью Казахстана[1]. Главным сдерживающим фактором развития животноводства является недостаточность кормовой базы. В условиях высоких цен на минеральные удобрения,получение полноценных и дешевых кормов возможно путемразвития кормопроизводства с использованием кормо-бобовых культур, которые дают большой урожай зеленой массы с высоким содержанием протеина [2].Основными кормо-бобовыми культурами являются люцерна и донник [3].Люцерна -одна из наиболее ценных кормо-бобовых культур, поскольку отличаетсядолголетием, многоукосностью и дает высокий урожай зеленой массы [4]. Корма из люцерны богаты растительным белком, который содержит необходимые аминокислоты, каротином, кальцием, витаминами и другими необходимыми элементами питания [5]. Другой, не менее ценной культурой, является донник, который недостаточно используется в кормопроизводстве в настоящее время. Донник обладает комплексом значимых хозяйственных и эколого-биологических особенностей. Культура не требовательна к почвам, обладает зимостойкостью, дает высокий урожай раннего корма в засушливых условиях и является солеустойчивой [6]. Помимо высокой кормовой ценности, донник способствуют накоплению биологического азота и гумуса в почве. Однако при выращивании люцерны и донника существует проблема низкой всхожести семян, связанная с их биологической особенностью. Семена этих культур имеют очень плотную и твердуюоболочку (твердокаменность семян), препятствующую их всхожести.

Для решения проблемы низкой всхожести семян применяются различные способы. Наиболее часто используют скарификацию - механическое разрушение оболочки семян с использованием специальных машин-скарификаторов [7]. Однако этот способ зачастую влечет за собой повреждение зародыша семян, что приводит к их инфицированию различными фитопатогенами, вызывая плесневение, загнивание проростков и гибель

большей части посевного материала. Также, скарификация требует специального оборудования, значительные материальные и энергетические расходы.Одним из наиболее перспективных решений этой проблемы является применение биологических препаратов для повышения всхожести семян на основе целлюлолитических бактерий. Целлюлолитические бактерии синтезируют особые ферменты - целлюлазы, которые способны нарушать целостность твердой оболочки семян и, тем самым, повышать их всхожесть. Для разработки биопрепаратов такого действия необходимо выделить целлюлолитические бактерии из природных субстратов и получить новые штаммы с высокой целлюлазной активностью.

Целью настоящего исследования было выделение целлюлолитических бактерий из природных источников, получение чистых культур и изучение новыхштаммов целлюлолитических бактерий.

Материалы и методы

Объектами исследования служили целлюлолитические бактерии, выделенные из образцов почв и целлюлозосодержащих растительных остатков (разложившихся стеблей, листьев, корешков растений), собранных на полях Алматинской области Казахстана с высоким уровнем агротехники выращивания донника и люцерны.

Полевой сбор почв проводили в соответствие с ГОСТ [8]. Точечные пробы в количестве пяти штук отбирали на пробной площадке из одного почвенного горизонта (810 см) методом конверта. Объединенную пробу составляли путем смешивания пяти точечных проб массой от 200 до 250 г каждая, отобранных на одной пробной площадке. Образцы почв для выделения микроорганизмовотбирали с соблюдением правил асептики. Сбор целлюлозосодержащих растительных остатков проводили стерильным пинцетом и помещали в стерильную тару.

Целлюлолитические бактерии выделяли на элективной питательной среде Гетчинсона, используемой в качестве единственного источника углерода и энергии.Для выделения бактерий 15 г почвы разводили в 90 мл дистиллированной стерильной воды и перемешивали на шейкере при 180 об/мин в течение 2 часов. Далее проводили серию разведений, переносив 1 мл полученной суспензии в пробирку, содержащую 9 мл стерильной воды, и т.д. - до разведения 10" . Посев микроорганизмов осуществляли из разведении

10, 10-5, 10, 10-7 и10- в чашки Петри с агаризованной средой Гетчинсона, на поверхность которой помещали стерильную фильтровальную бумагу. Объем посевного материала составлял 1 мл почвенной суспензии. Для выделения бактерий из разложившихся природных субстратов на фильтровальную бумагу помещали кусочки проб величиной 1-2 мм. Затем фильтровальную бумагу и кусочки субстратов увлажняли жидкой средой Гетчинсона [9]. Засеянные чашки инкубировались в термостате при 28°С в течение 10 дней. Каждое разведение высевали в пятикратной повторности [10,11].

Выделение чистых культур бактерий проводили путем последовательных посевов на агаризованную питательную среду Гетчинсона с полоской фильтровальной бумаги (1^10 см) и длительным пассированием на среде с водорастворимой Na-карбоксиметилцеллюлозой (Na-КМЦ) и последующем отбором из отдельных колоний.

Культивирование целлюлолитических бактерий проводили на жидкой элективной среде Гетчинсона на шейкере при 180 об/мин и на твердых питательных средах (среда Гетчинсона, МПА) при температуре 28-30°С.

Учет численности целлюлолитические бактерий в почве проводили методом предельных разведений. Рост бактерий учитывали визуально по разложению фильтровальной бумаги. Культивирование целлюлолитических бактерий осуществляли на шейкере-инкубаторе при 28°С и 180 об/мин [12].

Чистоту выделенных культур микроорганизмов проверяли визуально и под микроскопом. Микроскопический контроль проводился с препаратами фиксированных окрашенных клеток с иммерсионной системой и препаратами живых клеток при помощи светового микроскопа с выходом на монитор компьютера и фотодокументацией.

Культуральные и физиолого-биохимические свойства данных культур исследовали по стандартным методикам [13-15]

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета программ «БТАТКТГСА 10.0» [16].

Результаты и обсуждение

Для выделения целлюлолитических бактерий проведен сбор образцов почв и целлюлозосодержащих растительных остатков (разложившиеся стебли, листья, корешки растений) на полях Алматинской области Казахстана с высоким уровнем агротехники выращивания донника и люцерны. В общей сложности собрано 84 образца природных субстратов, из них - 46 образцов почвы и 38 целлюлозосодержащих растительных остатков. В Енбекшиказахском районе собрано 26, Карасайском районе - 30, Талгарском районе - 28 образцов природных субстратов.Для выделения микроорганизмовотбор образцов осуществляли с соблюдением правил асептики.

Выделение бактерий из собранных образцов почвпроведено в лабораторных условиях на элективной среде Гетчинсона с фильтровальной бумагой.

Установлено, что численность целлюлитических бактерий в почвенных образцах высокая - от 104 до 105 КОЕ г/почвы (таблица).

Таблица - Численность микроорганизмов в почвах на полях донника и люцерны в Алматинской области Казахстана

Почва Численность микроорганизмов, КОЕ г/почвы

омч* ЦЛБ**

Енбекшиказахский район 2,7±0,2х108 3,3±0,2х105

Карасайский район 3,9±0,3х107 4,1±0,1х104

Талгарский район 4,6±0,32х108 2,8±0,2х105

Примечание - уровень доверительной вероятности р<0,05; * - общее число микроорганизмов; ** - целлюлолитические бактерии

Высокая численность целлюлолитических бактерий в почве является одной из ее положительных характеристик, так как известно, что именно этим микроорганизмам принадлежит ведущая роль в круговороте углерода в природе, и они отвечают за поддержание плодородия почвы. Высокая численность этих микроорганизмов в почвеявляется не только показателем плодородия, но и свидетельствует о высокой агротехнике ведения сельского хозяйства [17]. Кроме того, целлюлолитические бактерии,находясь в почве, обогащают ее легкодоступными элементами питания и поставляют растениям продукты своей жизнедеятельности, такие как ферменты, витамины, аминокислоты и др., что положительно влияет на урожайность агрокультур [18-20].

Чистые культуры бактерий выделяли путем последовательных пересевов на среду Гетчинсона с полоской фильтровальной бумаги и длительным пассированием на твердой агаризованной среде Гетчинсона с Ка-КМЦ до образования отдельностоящих колоний (рисунок 1).

Рисунок 1 - Чистые культуры целлюлолитических бактерий

Чистоту выделенных бактерий проверяли визуально и под микроскопом. Для этого готовили фиксированные препараты окрашенных клеток бактерий ипросматривали их с иммерсионной системой. Также готовили препараты «живая капля» и определяли чистоту клеток при помощи светового микроскопас выходом на монитор компьютера.

В результате проведенной работы выделено 54чистых культуры целлюлолитических бактерий. Изучены их основные культурально-морфологические и биохимические признаки.

Установлено, что выделенные культуры целлюлолитических бактерий имели существенные отличия в культурально-морфологических свойствах. Колонии бактерий,в основном, были круглые с выпуклымпрофилем и ровным краем,от 1,1 до 2,7 мм в диаметре, с мелкозернистой структурой. Цвет колоний преимущественно молочный, кремовый, консистенция различалась.

Исследование морфологии клеток показало, чтоцеллюлолитические бактерии были как спорообразующимибактериями, так неспорообразующими. Однако спорообразующиебактерии встречались значительно чаще. Форма клеток бактерий, преимущественно, палочковидная, у некоторых штаммов с возрастом клетки приобретали кокковиднуюформу. Бактерии, в основном, грамположительные подвижные палочки, реже встречались грамотрицательные культуры (рисунок 2).

* }' у '

у .* 'Д Л:

ил, ' »Ц -ГУ) V V >

- ' • V *

К '' г4-' • •<$ г > 4 / > л %<Л

И > ^ Аг^У

- т а >

^ «А

я

Рисунок 2 - Формы клеток целлюлолитических бактерий (х 1800)

Изучение биохимических признаков показало, что все исследуемые культуры каталазоположительные, аэробные или факультативные анаэробные бактерии.Установлено, что штаммы бактерий характеризуются различной способностью использовать соединения углерода для своего конструктивного и энергетического метаболизма.

По основным культурально-морфологнческнм и биохимическим признакам выделенные культуры целлюлолитических бактерийотносятся к родам Bacillus,Pseudomonas,Bacterium-aCellulomonas.

Заключение

Таким образом, проведен сбор образцов почв и целлюлозосодержащих растительных остатков на полях Алматинской области Казахстана. В общей сложности собрано 84 образца, из них - 46 образцов почв и 38 образцов целлюлозосодержащих растительных остатков. В лабораторных условиях из собранных образцов почвы и растительных остатков выделено 54 чистых культуры целлюлолитических бактерий. Изучение основных культурально-морфологических и биохимических признаковцеллюлолитических бактерий позволило определить их родовую принадлежность. Установлено, что выделенные культуры целлюлолитических бактерий относятся к родам Bacillus,Pseudomonas, BacteriumuCellulomonas.

Дальнейшее исследование выделенных целлюлолитических бактерийпозволит отобрать активные штаммы, которые будутиспользованы для созданиябиопрепаратов,повышающих всхожесть семян донника и люцерны.

Литература:

1 Сыздыкова Д., Кекчебаев Е., Жакупова Г. Маркетинговые исследования сельского хозяйства Казахстана. Анализ инвестиционной привлекательности рынка. - URL: http://marketingcenter.kz/20/rynok-selskoe-khoziaistvo-kazakhstan.html. (датаобращения 25.08. 2020)

2 Красовская А., ВеремейТ. Особенности биологии и технологии возделывания кормовых бобов. - URL: http://agrotime.info/?p=15619. (датаобращения 25.08.2020)

3 Roy A.K., MalaviyaD.R., KaushalP. Genetic improvement of fodder legumes especially dual purpose pulses.Indian Journal of Genetics and Plant Breeding. - 2016. - Vol. 76(4): -P.608-625. DOI: 10.5958/0975-6906.2016.00076.6

4 Kulkarni K.P., Tayade R., Asekova S., Song J.T., Shannon J.G., Lee J.D. Harnessing the potential of forage legumes, alfalfa, soybean, and cowpea for sustainable agriculture and global food security. Front Plant Science. -2018. -Vol. 9. -P.1314. doi:10.3389/fpls.2018.01314.

5 СоболеваН.В., БабичеваИ.А., КарамаевС.В., КарамаеваАС. Качествокормовизлюцерныпосевнойикозлятникавосточного // Известия Оренбургского государственного аграрногоуниверситета. - 2016. - № 5(61). - С.103-105.

6 Тимошкин О.А., Тимошкина О.Ю. Селекция донника двулетнего II Нива Поволжья. -2012. - №1. -С.63-67.

7 Ли А., Алланиязов С.У., Рузиев Ш.Н. О физико-механических свойствах и приемах уборки и очистки семян люцерны II Агроинженерия. - 2018. - № 3(85). - С.17-24.

8 ГОСТ 17.4.4.02-84 - Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического анализа. - М.: Стандаринформ, 2008. - 142 с.

9 Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. - М.:МГУ, 1991. - 304 с.

10 Егорова Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. - М.: МГУ, 1995. - 224 с.

11 Saha B., Roy S., Hossen F. Isolation and identification of cellulolytic bacteria from soil sample and their antibiogram. American Journal of Microbiological Research. - 2019. - Vol. 7(3). - P. 8390. DOI: 10.12691/ajmr-7-3-3.

12 ИвшинаИ.Б. Большойпрактикумпомикробиологии. - СПб.: роспектНауки, 2014. - 112 с.

13 Carter M.R., Gregorich E.G. Soil sampling and methods of analysis. - USA: CRC PressTaylor & Francis Group, 2014. - 587 p.

14 Аристовская T.B. и др. Большой практикум по микробиологии. - М.: Высшая школа, 2012. - 491 с.

15 Боровиков В.П. Популярное введение в современный анализ данных в системе STATISTICA. М.: Stat Soft, 2013. - 268 с.

16 Шмидт КН., Худайгулов Г.Г. Выделение новых штаммов-деструкторов целлюлозы, их роль в снижении антропогенной нагрузки на экосистему II Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия: Пищевые и биотехнологии. - 2016. - №4. - С. 54-63.

17 Саданов А.К., Смирнова И.Э.Целлюлолитические бактерии и их применение в сельском хозяйстве / Караганды: Литера. - 2015. - 260 с.

18 Heidarzadeh N, Baghaee-Ravari S. Application of Bacillus pumilus as a potential biocontrol agent of Fusarium wilt of tomato. Archives Phytopathology and Plant Protection. - 2015. - Vol. 48(13-16). - P. 841-849. DOI: 10.1080/03235408.2016.1140611.

19 Lawal T.E., Babalola O.O. Relevance of biofertilizers to agriculture. Journal of Human Ecology. - 2014. - Vol. 47(1). - P. 35-43.

20 Manici L.M., Caputo F., Saccà M.L. Secondary metabolites released into the rhizosphere by Fusarium oxysporum and Fusarium spp. as underestimated component of nonspecific replant disease. Plant Soil. -2017. - Vol. 415(1-2). - P. 85-91.

И.Э. СМИРНОВА1, Э Р. ФАЙЗУЛИНА1, Л.Г. ТАТАРКИНА1, Ш.А. БАБАЕВА2 ^Микробиология жэне вирусология гылыми-енд1рют1к орталыгы»ЖШС, Алматы,

^азакстан

Эз1рбайжан Улттьщ Гылым академиясы, Микробиология институты, Баку, Эз1рбайжан

ЖЕМШОП ПЕН БУРШАЦ ДАЦЫЛДАРЫ АСТЫ БИОТЬЩАЙ'ЩЫШТАРДЫ ЦУРУ УШ1Н ПЕРСПЕКТИВТ1, ЦЕЛЛЮЛОЛИТИКАЛЬЩ БАКТЕРИЯЛАРДЫ

БОЛ1П АЛУ

Тушн

Казакстанныц Алматы облысынан топырактар мен сау туйежоцышка мен жоцышка ес1мд1ктершщ ризосферасынан алынган целлюлозасы бар табиги субстраттар жинау журпз1лдгТабиги субстраттардан барлыгы 84 сынама жиналды, оньщ 46 топырак сынамалары жэне 38 целлюлозасы бар ес1мд1к калдыктары.Зертханалык жагдайда целлюлолитикалык бактериялар белшш алынып жэне бактериялардыц 54 таза дакылдары алынды.Белшш алынган дакылдардыц Bacillus, Bacterium, Pseudomonas жэне Cellulomonas тукымдастарына жататындыгы аныкталды.

Кштт1 сездер: целлюлолитикалык бактериялар,белш алу, топырак, целлюлозасы бар табиги субстраттар, туйежоцышка, жоцышка.

IRSTI 34.27.17

I.E. SMIRNOVA1, E.R. FAYZULINA1, L.G. TATARKINA1,SH.A.BABAEVA2 1LLP "Research and Production Center of Microbiology and Virology", Almaty, Kazakhstan 2National Academy of Sciences of Azerbaijan, Institute of Microbiology, Baku, Azerbaijan

ISOLATION OF CELLULOLYTIC BACTERIA PROSPECTIVE FOR THE CREATION OF BIOPROFERTILIZER FOR FORAGE-LEGUME CROPS

Summary

In the Almaty region of Kazakhstan, soil and cellulose-containing natural substrates were collected from the rhizosphere of healthy melilot and alfalfa plants. In total, 84 samples of natural substrates were collected, including 46 soil samples and 38 cellulose-containing plant residues. Under laboratory conditions, cellulolytic bacteria were isolated and 54 pure cultures of bacteria were obtained. Their main cultural, morphological and biochemical characteristics have been studied. It was found that the isolated cultures belong to the genera Bacillus, Bacterium, Pseudomonas and Cellulomonas.

Key words: cellulolytic bacteria, isolation, soil, cellulose-containing natural substrates, sweet clover, alfalfa.

One of the problems of the agro-industrial complex of Kazakhstan is the low productivity of animal husbandry, which is a traditional and priority industry in Kazakhstan [1]. The main limiting factor for the development of animal husbandry is the lack of a forage base. In conditions of high prices for mineral fertilizers, obtaining high-grade and cheap feed is possible

through the development of feed production using fodder and legumes, which give a large yield of green mass with a high protein content [2].The main fodder and legumes are alfalfa and sweet clover [3]. Alfalfa is one of the most valuable forage and leguminous crops, since it is distinguished by its longevity, multi-cutting capacity and gives a high yield of green mass [4]. Alfalfa feed is rich in vegetable protein, which contains essential amino acids, carotene, calcium, vitamin and other important nutrients [5].Another equally important crop is sweet clover, which is underutilized in fodder production. Melilot has a complex of valuable economic, ecological and biological features. The culture is not demanding on soils, has winter hardiness, gives a high yield of early forage in arid conditions and is a salt tolerant crop [6].In addition to their high forage value, these crops contribute to the accumulation of biological nitrogen and humus in the soil. However, when growing melilot and alfalfa, there is a problem of low germination of seeds associated with their biological characteristics. The seeds of these crops have a very dense and hard shell, which prevents their germination (seed hardness).

To solve the problem of low seed germination, various methods are used. The most commonly used scarification is the mechanical destruction of the seed coat using special scarifier machines [7]. However, this method often entails damage to the embryo of seeds, which leads to their infection with various phytopathogens, causing mold, rotting of seedlings and the death of most of the seed.Also, scarification requires special equipment, significant material and energy costs. One of the most promising solutions to this problem is the use of biological preparations to increase seed germination based on cellulolytic bacteria. These bacteria have the ability to synthesize special enzymes - cellulases, which are capable of disrupting the integrity of the hard shell of seeds and, thereby, increasing their germination. To develop biopreparations of such action, it is necessary to isolate cellulolytic bacteria from natural substrates and obtain new strains with high cellulase activity.

The purpose of this study was to isolate cellulolytic bacteria from natural sources, obtain pure cultures and study new strains of cellulolytic bacteria.

Materials and methods

The objects of the study were cellulolytic bacteria isolated from soil samples and cellulose-containing plant residues (decomposed stems, leaves, plant roots) collected in the fields of the Almaty region of Kazakhstan with a high level of agricultural technology for growing sweet clover and alfalfa.

Field collection of soils was carried out in accordance with GOST [8]. Point samples in an amount of five were taken on a test plot from one soil horizon (8-10 cm) by the envelope method. A pooled sample was made by mixing five spot samples, each weighing from 200 to 250 g, taken from one sample site. Soil samples for isolation of microorganisms were taken in compliance with the rules of asepsis. The collection of cellulose-containing plant residues was carried out with sterile tweezers and placed in a sterile container.

Cellulolytic bacteria were isolated on Hutchinson's selective medium used as the only source of carbon and energy. To isolate bacteria, 15 g of soil was diluted with 90 ml of distilled sterile water and stirred on a shaker at 180 rpm for 2 hours. Next, a series of dilutions was carried out by transferring 1 ml of the resulting suspension into a test tube containing 9 ml of sterile water, etc. before dilution 10 . The inoculation of microorganisms was carried out from dilutions 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, and 10-8

in Petri dishes with Hutchinson's agar medium, on the surface of which sterile filter paper was placed.The inoculum volume was 1 ml of soil suspension. When isolating bacteria from decomposed natural substrates, pieces 1-2 mm in size were placed on filter paper. Then, filter paper and pieces of substrates were moistened with Hutchinson's liquid medium [9]. The seeded dishes were incubated in a thermostat at 28 ° C for 10 days. Each dilution was plated five times. The dishes were cultivated at a temperature of 30 ° C for 7 days [10, 11].

Isolation of pure cultures of bacteria was carried out by sequential inoculations on Hutchinson's medium with a strip of filter paper (1 x 10 cm) and long-term passage on a medium

with water-soluble Na-carboxymethylcellulose (Na-CMC) and subsequent isolation of pure cultures of bacteria from individual colonies.

Cultivation of cellulolytic bacteria was carried out on a liquid elective Hutchinson's medium on a shaker at 180 rpm and on solid nutrient media (Hutchinson's medium, MPA) at a temperature of 28-30 ° C.

The number of cellulolytic bacteria in the soil was counted by the method of limiting dilutions. The growth of bacteria was counted visually by the decomposition of the filter paper. Cellulolytic bacteria were cultivated on an incubator shaker at 28 ° C and 180 rpm [12].

The purity of the isolated cultures of microorganisms was checked visually and under a microscope. Microscopic control was carried out with preparations of fixed stained cells with an immersion system and with preparations of living cells using a light microscope with access to a computer monitor and photo documentation.

The cultural and physiological-biochemical properties of these cultures were studied using standard methods [13-15]

Statistical processing of the results was carried out using the «STATISTICA 10.0» software package [16].

Results and discussion

To isolate cellulolytic bacteria, samples of soils and cellulose-containing plant residues (decomposed stems, leaves, plant roots) were collected in the fields of the Almaty region of Kazakhstan with a high level of agricultural technology for growing sweet clover and alfalfa. In total, 84 samples of natural substrates were collected, including 46 soil samples and 38 cellulose-containing plant residues. In Enbekshikazakh region, 26 samples were collected, Karasai region -30, Talgar region - 28 samples of natural substrates. For isolation of microorganisms, samples were taken in compliance with the rules of asepsis.

The selection of soils and plant residues was carried out in the fields of peasant farms with a high level of agricultural technology for growing sweet clover and alfalfa. Bacteria were isolated from the collected soil samples under laboratory conditions on Hutchinson's elective medium with filter paper.

It was found that the number of cellulite bacteria in soil samples is high and ranged from 104 to 105 CFU g / soil (Table).

Table - The number of microorganisms in soils in the fields of sweet clover and alfalfa in the Almaty region of Kazakhstan_

Soil s samples The number of microorganisms, CFU g / soil

TMC* CB**

Enbekshikazakh district 2,7±0,2x108 3,3±0,2x105

Karasay region 3,9±0,3x107 4,1±0,1x104

Talgar region 4,6±0,32x108 2,8±0,2x105

Note - confidence levelp<0,05; * - Total microbial count; ** - Cellulolytic bacteria

The high number of cellulolytic bacteria in the soil is one of its positive characteristics, since it is known that it is these microorganisms that play a leading role in the carbon cycle in nature, and they are responsible for maintaining soil fertility. The high number of these microorganisms in the soil is not only an indicator of fertility, but also indicates the high agrotechnology of agriculture [17]. In addition, being in the soil, cellulolytic bacteria enrich it with readily available nutrients, make the soil fertile and supply plants with their vital products, such as enzymes, vitamins, amino acids, etc., which has a positive effect on agricultural productivity [18-20].

Pure cultures of bacteria were isolated by inoculation on Hutchinson's medium with a strip of filter paper and prolonged inoculation on solid Hutchinson's agar medium with Na-CMC

until the formation of free-standing colonies, from which pure cultures of bacteria were isolated (Figure 1).

Figure 1 - Isolation of pure cultures of cellulolytic bacteria from colonies growing on Hutchinson's

medium

The purity of the isolated bacteria was checked visually and under a microscope. For this, fixed preparations of stained bacterial cells were prepared and viewed with an immersion system. Also, preparations were prepared "living drop" and the purity of cells was determined using a light microscope with output to a computer monitor.

As a result of this work, 54 pure cultures of cellulolytic bacteria were isolated. Then we studied their main cultural, morphological and biochemical characteristics of cultures.

It was found that the isolated cultures of bacteria had significant differences in cultural and morphological properties. Colonies of bacteria were generally round with a convex profile and a smooth edge, from 1.1 to 2.7 mm in diameter with a fine-grained structure. The color of the colonies was predominantly milky, cream, the consistency varied.

The study of cell morphology showed that cellulolytic bacteria were both spore-forming bacteria and non-spore-forming bacteria. However, spore-forming bacteria were found much more frequently. The bacterial cells are predominantly rod-shaped; in some strains, with age, the cells acquired a coccoid shape. The bacteria were mainly gram-positive movable rods, less often gram-negative cultures were found (Figure 2).

Wf'^MO^ ¿tid <

Figure 2 - Forms of cells of cellulolytic bacteria (x 1800)

The study of the biochemical properties of bacteria showed that all the studied cultures were catalase-positive, aerobic, or facultative anaerobic bacteria. It was found that bacterial strains were characterized by different ability to use carbon compounds for their constructive and energy metabolism.

According to the main cultural, morphological and biochemical characteristics, the isolated cultures of cellulolytic bacteria belong to the genera Bacillus, Pseudomonas, Bacterium and Cellulomonas.

Conclusion

Thus, we collected samples of soils and cellulose-containing plant residues in the fields of the Almaty region of Kazakhstan. A total of 84 samples were collected, of which 46 soil samples and 38 samples of cellulose-containing plant residues. Under laboratory conditions, cellulolytic bacteria were isolated from the collected soil samples and plant residues on Hutchinson's selective medium. As a result of this work, 54 pure cultures of cellulolytic bacteria were isolated. A study of their main cultural, morphological and biochemical characteristics was carried out, which made it possible to determine the generic affiliation of cellulolytic bacteria. It was found that the isolated cultures of cellulolytic bacteria belong to the genera Bacillus, Pseudomonas, Bacterium, and Cellulomonas.

Further research of cellulolytic bacteria will make it possible to select active strains that will be used to create biopreparation that increase the germination of melilot and alfalfa seeds.

References:

1 Syzdykova D., Kekchebaev E., Zhakupova G. Marketingovye issledovanija sel'skogo hozjajstva Kazahstana. Analiz investicionnoj privlekatel'nosti rynka. - URL: http://marketingcenter.kz/20/rynok-selskoe-khoziaistvo-kazakhstan.html. (data obrashhenija 25.08. 2020)

2 Krasovskaja A., Veremej T. Osobennosti biologii i tehnologii vozdelyvanija kormovyh bobov. -URL: http://agrotime.info/?p=15619. (data obrashhenija 25.08.2020)

3 Roy A.K., Malaviya D.R., Kaushal P. Genetic improvement of fodder legumes especially dualpurpose pulses. Indian Journal of Genetics and Plant Breeding. - 2016. - Vol. 76(4): -P.608-625. DOI: 10.5958/0975-6906.2016.00076.6

4 Kulkarni K.P., Tayade R., Asekova S., Song J.T., Shannon J.G., Lee J.D. Harnessing the potential of forage legumes, alfalfa, soybean, and cowpea for sustainable agriculture and global food security. Front Plant Science. -2018. - Vol. 9. -P.1314. doi:10.3389/fpls.2018.01314.

5 Soboleva N.V., Babicheva I.A., Karamaev S.V., Karamaeva AS. Kachestvo kormov iz ljucerny posevnoj i kozljatnika vostochnogo. Izvestija Orenburgskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. -2016.- №5(61).-S.103-105.

6 Timoshkin O.A., Timoshkina O.Ju. Selekcija donnika dvuletnego. Niva Povolzh'ja. - 2012. -№1. -S. 63-67.

7 Li A., Allanijazov S.U., Ruziev Sh.N. O fiziko-mehanicheskih svojstvah i priemah uborki i ochistki semjan ljucerny. Agroinzhenerija. - 2018. - № 3(85). - S. 17-24.

8 GOST 17.4.4.02-84 - Ohrana prirody. Pochvy. Metody otbora i podgotovki prob dlja himicheskogo, bakteriologicheskogo analiza. - M.: Standarinform, 2008. - 142 s.

9 Zvjagincev D.G. Metody pochvennoj mikrobiologii i biohimii. - M.:MGU, 1991. - 304 s.

10 Egorova N.S. Rukovodstvo k prakticheskim zanjatijam po mikrobiologii. - M.: MGU, 1995. -

224 s.

11 Saha B., Roy S., Hossen F. Isolation and identification of cellulolytic bacteria from soil sample and their antibiogram. American Journal of Microbiological Research. - 2019. - Vol. 7(3). - P. 8390. DOI: 10.12691/ajmr-7-3-3.

12 Ivshina I.B. Bol'shoj praktikum po mikrobiologii. - SPb.: rospekt Nauki, 2014. - 112 s.

13 Carter M.R., Gregorich E.G. Soil sampling and methods of analysis. - USA: CRC PressTaylor & Francis Group, 2014. - 587 p.

14 Aristovskaja T.V. i dr. Bol'shoj praktikum po mikrobiologii. - M.: Vysshaja shkola, 2012. -

491 s.

15 Borovikov V.P. Populjarnoe vvedenie v sovremennyj analiz dannyh v sisteme STATISTICA. M.: Stat Soft, 2013. -268 s.

16 Shmidt K.N., Hudajgulov G.G. Vydelenie novyh shtammov-destruktorov celljulozy, ih rol' v snizhenii antropogennoj nagruzki na jekosistemu. Vestnik Juzhno-Ural'skogo gosudarstvennogo universiteta. Serija: Pishhevye i biotehnologii. - 2016. -№4. - S. 54-63.

17 Sadanov A.K., Smirnova I.Je. Celljuloliticheskie bakterii i ih primenenie v sel'skom hozjajstve / Karagandy: Litera. - 2015. - 260 s.

18 Heidarzadeh N, Baghaee-Ravari S. Application of Bacillus pumilus as a potential biocontrol agent of Fusarium wilt of tomato. Archives Phytopathology and Plant Protection. - 2015. - Vol. 48(13-16). - P. 841-849. DOI: 10.1080/03235408.2016.1140611.

19 Lawal T.E., Babalola O.O. Relevance of biofertilizers to agriculture. Journal of Human Ecology. - 2014. - Vol. 47(1). - P. 35-43.

20 Manici L.M., Caputo F., Saccà M.L. Secondary metabolites released into the rhizosphere by Fusarium oxysporum and Fusarium spp. as underestimated component of nonspecific replant disease. Plant Soil. -2017. - Vol. 415(1-2). - P. 85-91.

МРНТИ 34.25.29

A.M. БАЙМУХАМЕТОВА1, Н С. ОНГАРБАЕВА1,2, H.T. САКТАГАНОВ1, Т.И.

ГЛЕБОВ А1, М.Г. ШАМЕНОВА1, С.Б.БАЙСЕЙ1Т1, ДА. ИСМАГУЛОВА1,2, Г.В.ЛУКМАНОВА1, Н.Г. КЛИВЛЕЕВА1, Е.И. ИСАЕВА3 1TOO «Научно-производственный центр микробиологии и вирусологии», г. Алматы,

Казахстан

Казахский Национальный Университет имени аль-Фараби, г. Алматы, Казахстан ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и

микробиологии им. почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ; Москва,

Россия

ВИРУСЫ ГРИППА, ЦИРКУЛИРУЮЩИЕСРЕДИ СВИНЕЙ И ЛЮДЕЙ В

КАЗАХСТАНЕ В 2020 ГОДУ

Аннотация

Популяции свиней играют важную роль в эволюции вирусов гриппа, так как они являются уникальным резервуаром для реассортации возбудителей инфекции от разных хозяев.

В 2020 году в Алматинской, Северо-Казахстанской и Карагандинской областях Казахстана от больных людей в поликлиниках и лечебных учреждениях получен 531 носоглоточный смыв. В крестьянских животноводческих хозяйствах от свиней 2-5 мес. возрастов собрано 172 носоглоточных смыва.

В полимеразной цепной реакции 531 образца, собранного от людей, генетический материал вируса гриппа А был обнаружен в 6,21% случаев, вируса гриппа В - в 1,13%. При субтипировании РНК вируса гриппа A/HlNl/09pdm идентифицирована в 2,64% проб, A/H3N2 - в 1,69%. В 172 носоглоточных смывах, полученных от свиней, генетический материал вируса гриппа был обнаружен в 6,97% проб, из них РНК вируса гриппа A/H1N1 - в 5,23%, вируса гриппа A/H3N2 - в 0,58%.

Результаты, полученные при скрининге носоглоточных смывов в полимеразной цепной реакции, указывают на социркуляцию вирусов гриппа A/H1N1 и A/H3N2 у людей и свиней в Алматинской, Северо-Казахстанской и Карагандинской областях РК.

При вирусологическом исследовании носоглоточных смывов, собранных от людей в Алматинской области, на куриных эмбрионах выделено три гемагглютинирующих агента, идентифицированных в полимеразной цепной реакции, реакции торможения гемагглютинации и реакции ингибиции нейраминидазной активности как вирусы гриппа A/H3N2.

Результаты вирусологических исследований свидетельствуют о необходимости проведения постоянного надзора за циркуляцией возбудителей гриппа среди людей и свиней в различных регионах Казахстана с целью своевременного прогнозирования эпидемических вспышек и проведения профилактических мероприятий.

Ключевые слова:вирус гриппа, циркуляция, изолят, гемагглютинин, нейраминидаза.

Введение

Согласно антигенным характеристикам, различают три серотипа вируса: А, В и С. Вирусы гриппа А поражают свиней, птиц, лошадей, описаны вспышки у тюленей, норок, верблюдов, также они были обнаружены у китообразных и летучих мышей. Имеются данные, описывающие возможности передачи вируса гриппа А между птицами и