CC BY
2
(MALDI-TOF MS) application for rapid identification of pathogenic microbes that affect food crops: delivered and future deliverables / I. Sivanesan, J. Gopal, N. Hasan, M. Muthu // RSC Advances J. 2023 Jun 9;13(25):17297-17314.
12. Sulaiman I. M. MALDI-TOF Mass Spectrometry and 16S rRNA Gene Sequence Analysis for the Identification of Foodborne Clostridium Spp. / I. M. Sulaiman, N. Miranda, S. Simpson // Journal of AOAC International. 2021. 104(5). P. 1381-1388.
13. Tsuchida S. Current Status of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in Clinical Diagnostic Microbiology /
S. Tsuchida, H. Umemura, T. Nakayama // Molecules. 2020 Oct 17;25(20):4775.
14. Wambui J. Detection of Psychrophilic Clostridium spp. Causing "Blown Pack" Spoilage in Meat Juice Samples from Chilled Vacuum-Packed Beef and Lamb Meat Imported from Different Countries to Switzerland / J. Wambui, S. Puntener, S. Corti, N. Cernela, R. Stephan // J Food Prot. 2020. Jan;83(1). P. 56-59.
15. Wieser A. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics - identification of microorganisms and beyond (mini review) / A. Wieser, L. Schneider, J. Jung, S. Schubert // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012. 93. P. 965-974.
DOI: 10.24412/2074-5036-2024-363-13-17 УДК 619:579.8:615.015.8:615.33:618.19-002:636.2
Ключевые слова: мастит коров, клинический мастит, возбудители мастита, антибиотикорезистентность, антибиотики, марбофлоксацин
Key words: cow mastitis, clinical mastitis, mastitis pathogens, antibiotic resistance, antibiotics, marbofloxacin
'Явников Н. В., 2Капай Н. А., 'Москвина А. Л., 3Анисько Р. В.
ВЫДЕЛЕНИЕ ПОЛЕВЫХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ -ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МАСТИТА КОРОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ
ISOLATION OF FIELD STRAINS OF MICROORGANISMS - CAUSES OF COW MASTITIS AND DETERMINATION OF THEIR SENSITIVITY TO ANTIBIOTICS
'ФГБОУ ВО Пензенский ГАУ Адрес: 440014, Пенза, ул. Ботаническая, 30
FSBEIHEPenza SAU. Adress: 440014, Penza, Botanicheskaya Str., 30 2ООО «АлексАнн». Адрес: 141705, Московская обл., г. Долгопрудный, ул. Виноградная, 13
AleksAnn LCC. Adress: 141705, Moscow region, Dolgoprudny, Vmogradnaya Str., 13 3ФГБОУ ВО Белгородский ГАУ Адрес: 308503 Белгородский район, Белгородская область,
п. Майский, ул. Студенческая, 1 FSBEIHE Belgorod SAU. Adress: 308503, Belgorod region, Mayskiy village, Studencheskaya Street, 1
Явников Назар Валентинович, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры ветеринарии,
E-mail: virus0401@mail.ru
Yavnikov Nazar Valentinovich, PhD of Veterinary Sciences, Associate Professor of the Department of Veterinary,
Е-mail: virus0401@mail.ru
Капай Надежда Анатольевна, кандидат биологических наук, начальник научного отдела ООО «АлексАнн»,
E-mail: nkapay@aleksann.ru
Kapay Nadezhda Anatolevna, PhD of Biological Sciences, Head of the Scientific Department of AlexAnn LLC,
Е-mail: nkapay@aleksann.ru Москвина Анна Леонидовна, аспирант кафедры ветеринарии, E-mail: moskvina.a.l@pgau.ru Moskvina Anna Leonidovna, Post-Graduate Student of the the Department of Veterinary, Е-mail: moskvina.a.l@pgau.ru Анисько Роман Владимирович, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент кафедры морфологии, физиологии, инфекционной и инвазионной патологии, E-mail: roman.anisko@yandex.ru Anisko Roman Vladimirovich, PhD of Agricultural Sciences, Associate Professor of the Department of Morphology, Physiology, Infectious and Invasive Pathology, Е-mail: roman.anisko@yandex.ru
Аннотация. Антибиотикорезистентные штаммы микроорганизмов являются одной из серьезнейших проблем в современном животноводстве. Вызванные ими случаи маститов тяжело поддаются лечению, имеют высокий процент рецидивов, тем самым значительно снижая выход и качество товарного молока. В статье приведены данные бактериологических исследований проб секрета молочной железы от коров с клинической формой мастита, полученные
из 4 молочных ферм Белгородской области. Культуры стрептококков были выделены из всех проб. В 20 % проб совместно со стрептококками присутствовали стафилококки, в 6,7 % - E. coli. Проводили типирование стрептококков как превалирующего патогена до вида. В 53,4 % проб идентифицированы специфические возбудители мастита коров Str. agalactiae и Str. uberis, в 33,3 % проб - Str. pyogenes, в 13,3 % проб - Str. faecalis. Диско-диффузным методом установлена высокая резистентность выделенных изолятов Str. agalactiae, Str. uberis, Str. pyogenes, Str. faecalis и Staphylococcus spp. к амоксициллину, в т. ч. с клавулановой кислотой, умеренная чувствительность к тилозину, тетрациклину и энроф-локсацину, и высокая чувствительность к гентамицину и норфлоксацину. Установлена минимально ингибирующая концентрация (МИК) марбофлоксацина для культур Str. uberis и Str. agalactiae: 0,50 мкг/мл и 0,44 ±0,13 мкг/мл, соответственно.
Summary. Antibiotic resistance ofpathogens is one ofthe most serious problems ofcurrent animal husbandry. The cases of mastitis caused by them are difficult to treat, have a high percentage of recurrence, thereby significantly reducing the yield and quality of commercial milk. The article presents data on the bacteriological studies of mastitis milk samples obtained from 4 dairy farms in the Belgorod region. Streptococcus spp. were isolated in all samples. In 20 % of the samples there were staphylococci in addition to streptococci, in 6.7 % of the samples - E. coli. Due to the differentiation of streptococci as predominant pathogen the specific mastitis-causing pathogens Str. agalactiae and Str. uberis (53.4 % of samples), and also Str. pyogenes (33.3 % of samples), Str. faecalis (13.3 % of the samples) were identified. Using the disk diffusion test were determined high resistance of isolated Str. agalactiae, Str. uberis, Str. pyogenes, Str. faecalis and Staphylococcus spp. to amoxicillin, including clavulanic acid, moderate sensitivity to tylosin, tetracycline and enrofloxacin, and high sensitivity to gentamicin and norfloxacin. The minimum inhibitory concentration (MIC) of marbofloxacin was established for cultures of Str. uberis and Str. agalactiae: 0.50 mcg/ml and 0.44 ±0.13 mcg/ml, respectively.
Введение
Эффективное лечение мастита КРС возможно только в случае чувствительности патогенной микрофлоры к выбранному антибактериальному препарату. Несоблюдение принципа ротации, прерывание антимикробной терапии (замена препаратов в ходе лечения), массовое бесконтрольное использование антибиотиков в хозяйстве провоцирует возникновение резистентных штаммов [1, 2, 4, 6].
Целью данного исследования являлась оценка чувствительности основных возбудителей мастита коров, включая Str. agalactiae и Str. uberis, к антибактериальным средствам, наиболее часто используемым при лечении мастита (амоксициллину, амоксициллину с клавулановой кислотой, гентамицину, норф-локсацину, тилозину, тетрациклину, энроф-локсацину и марбофлоксацину). Частной задачей данного исследования являлось определение МИК марбофлоксацина к возбудителям субклинического и клинического мастита Str. agalactiae и Str. uberis. Интерес именно к данному антибиотику обусловлен особенностями фармакокинетики марбофлоксацина: он быстро всасывается из места инъекции и проникает в молочную железу, создавая там терапевтическую концентрацию на протяжении до 48 часов. Но при этом срок ожидания по молоку составляет всего одни сутки. Из перечисленных антибиотиков у препаратов на основе марбофлоксацина наиболее короткий период ожидания по молоку. Это является важным преимуществом при выборе средств для лечения мастита [8].
Материалы и методы
Исследования выполнялись в Испытательной лаборатории ФГБОУ ВО «Белгородский ГАУ». Материал доставляли из 4 молочных комплексов, принадлежащим двум хозяйствам Белгородской области. В данных хозяйствах используется беспривязная система содержания дойных коров с доением в доильном зале на установках типа «Ёлочка» или «Параллель». Всего подвергнут исследованиям материал от 15 животных.
Отбирали секрет молочной железы от коров с клинической формой мастита. До отбора проб животных не подвергали лечению антибактериальными препаратами. Отбор проб из пораженных долей (четвертей) молочной железы происходил после санитарной обработки вымени и дезинфекции сосков. От каждого животного в одноразовые стерильные контейнеры отбиралась средняя и последняя пробы (порции) секрета общим количеством 40-60 мл.
Пробы доставлялись в лабораторию в течение 6-8 часов с момента отбора. Транспортировка проб осуществлялась в закрытом контейнере при температуре 4±2 оС.
На первом этапе исследований был произведен высев секрета на твердые питательные среды (кровяной агар, солевой агар, среда Эндо). Культивирование производилось в обычной атмосфере, при температуре +37 °С. Посевы на кровяном агаре и среды Эндо культивировали 17-18 часов, а на солевом агаре - 41-42 часа. Полученные колонии микроорганизмов предварительно дифференцированы на основании их культуральных, тинкториальных и морфологических свойств [3].
Согласно плану исследований проводили дифференциацию выделенных культур стрептококков. Типирование других выделенных культур микроорганизмов не проводили.
Для определения чувствительности бактерий был приготовлен инокулюм из исследуемых культур микроорганизмов (6-часовая бульонная культура). Для этого отбирали несколько однотипных изолированных колоний, петлей переносили незначительное количество материала в пробирку с 4,0-5,0 мл ГМФ-бульона. Инкубировали при +35 °С. Через 6 ч инкубации плотность микробной культуры доводили до 0,5 по МакФарланду путем добавления стерильного бульона или физиологического раствора. Плотность культур определяли визуально в сравнении со стандартами мутности.
Диско-диффузным методом определяли чувствительность всех выделенных культур микро-
организмов к амоксициллину, амоксициллину с клавулановой кислотой, гентамицину, норфлок-сацину, тилозину, тетрациклину и энрофлоксаци-ну. Дополнительно у культур Str. agalactiae и Str. uberis определяли МИК марбофлоксацина. Исследования проводили с использованием стандартных методик [5].
Результаты исследований
При проведении бактериологических исследований из 15 проб секрета молочной железы больных маститом коров были выделены следующие культуры микроорганизмов:
Str. agalactiae - 4 культуры;
Str. uberis - 4 культуры;
Str. pyogenes - 5 культур;
Str. faecalis - 2 культуры;
Staphylococcus spp. - 3 культуры;
E. coli - 1 культура.
Таблица 1
Чувствительность выделенных культур микроорганизмов к антибиотикам, установленным диско-диффузным методом
Культура № Антибиотик
Амокси-циллин Амокси-циллин + клавулано-вая кислота Гентами-цин Норфлок-сацин Тилозин Тетрациклин Энроф-локсацин
Результат исследований
Str. agalactiae 1 - - + + - + +
2 - - + + + + ±
3 - - + + + + +
4 - - + + + + +
Str. uberis 1 - - + + + + +
2 - - + + + + ±
3 - - + + + + +
4 - ± + + + + +
Str. pyogenes 1 - - + + + + +
2 - - + + + + ±
3 - - + + + + ±
4 - ± + + ± ± +
5 - - + + + ± ±
Str. faecalis 1 - - + + + ± ±
2 - - + + - + +
Staphylococcus spp. 1 - - + + + + +
2 - ± + + + + +
3 - - + + + ± +
E. coli 1 + + + + + + +
Чувствительны, % 5,3 5,3 100 100 84,2 78,9 68,4
Устойчивы, % 94,7 78,9 - - 10,5 - -
Умеренно чувствительны, % - 15,8 - - 5,3 21,1 31,6
Таблица 2
Значение МИК марбофлоксацина к культурам Str. agalactiae и Str. uberis
Вид стрептококка № культуры МИК марбофлоксацина, мкг/мл
Str. agalactiae 1 0,5
Str. agalactiae 2 0,5
Str. agalactiae 3 0,5
Str. agalactiae 4 0,25
Str. uberis 1 0,5
Str. uberis 2 0,5
Str. uberis 3 0,5
Str. uberis 4 0,5
Во всех исследованных пробах были выявлены культуры стрептококков. При этом в 11 пробах стрептококки были единственным обнаруженным патогеном, в 3 пробах также присутствовали стафилококки, в 1 пробе - кишечная палочка. Наиболее часто выявляли культуры Str. pyogenes, в 5 пробах (33,3 %), культуры Str. agalactiae и Str. uberis (специфические возбудители мастита коров) были выявлены в 8 пробах (53,4 %), Str. faecalis - в 2 пробах (13,3 %).
Выделенные культуры микроорганизмов имели различную чувствительность к антимикробным препаратам (табл. 1). Наименее устойчивой к воздействию антибиотиков была культура E. coli, которая проявила чувствительность к воздействию всех исследуемых препаратов. К воздействию гентамицина и норфлосакцина оказались чувствительны все изоляты, к тилозину были чувствительны все выделенные штаммы стафилококков, а из стрептококков устойчивыми оказались две культуры, и одна культура была умеренно чувствительна. К тетрациклину умеренная чувствительность была выявлена у трех культур стрептококков и одной культуры стафилококка, также шесть выделенных культур стрептококков оказались умеренно чувствительны к энрофлоксацину. Остальные выделенные культуры были чувствительны к этим двум антибиотикам. Наибольшая устойчивость выделенных культур микроорганизмов проявлялась в отношении амоксициллина (94,7 % устойчивых изолятов), в том числе в сочетании с клавулано-вой кислотой (78,9 % выделенных изолятов).
Согласно схеме исследования, после дифференциации выделенных стрептококков и получения чистых культур Str. agalactiae и Str. uberis (возбудителей маститов коров) была установлена МИК марбофлоксацина к данным штаммам.
Результаты данных исследований приведены в таблице 2.
Из данных таблицы 2 следует, что МИК мар-бофлоксацина для культур стрептококков - возбудителей маститов коров, за исключением одной культуры, составляет 0,5 мкг/мл. У одной культуры Str. agalactiae МИК марбофлоксацина составила 0,25 мкг/мл.
Таким образом средняя МИК марбофлоксацина для культур Str. uberis составляет 0,50 мкг/мл, а для культур Str. agalactiae - 0,44 ±0,13 мкг/мл.
Заключение
При проведении бактериологических исследований секрета молочной железы коров с клиническими признаками мастита стрептококки были выделены во всех отобранных пробах. В трех случаях (20 %) стрептококковая инфекция была ассоциирована со стафилококком, в одном случае (6,7 %) - с кишечной палочкой.
В результате типирования/дифференциации культур стрептококков как преобладающих патогенов были идентифицированы Str. pyogenes (33,3 %), Str. agalactiae (26,7 %), Str. uberis (26,7 %), Str. faecalis (13,3 %).
При оценке чувствительности к антибиотикам, наиболее часто используемым при лечении мастита (амоксициллину, амоксициллину с кла-вулановой кислотой, гентамицину, норфлокса-цину, тилозину, тетрациклину, энрофлоксацину и марбофлоксацину), были выявлены резистентные штаммы.
Так, к ß-лактамным антибиотикам признаки устойчивости проявили все изоляты стрептококков и стафилококков.
К энрофлоксацину 40 % выделенных культур стрептококков (представители Str. pyogenes, Str. agalactiae, Str. uberis, Str. faecalis) были умеренно чувствительны, что свидетельствует о формирующейся резистентности.
К тилозину и тетрациклину преобладающее количество изолятов (84,2 % и 78,9 %, соответ-
ственно) были чувствительны, но отдельные культуры Str. agalactiae; Str. faecalis, Str. pyogenes, Staphylococcus spp. (суммарно 15,8-21,1 %) демонстрировали различную степень устойчивости.
В отношении гентамицина, норфлоксацина, марбофлоксацина резистентных штаммов не выявлено.
Все выделенные от коров с клиническими признаками мастита культуры Str. agalactiae и Str. uberis были чувствительны к марбофлоксацину. МИК марбофлоксацина в отношении Str. uberis -0,50 мкг/мл, Str. agalactiae - 0,44±0,13 мкг/мл. Принимая во внимание, что через 0,5-1,5 часа после введения КРС терапевтической дозы мар-бофлоксацина (2 мг/кг) в крови достигается концентрация порядка 1,5-1,8 мкг/мл, а в органах концентрация марбофлоксацина выше, чем в плазме крови [7], можно ожидать, что при лечении мастита в тканях вымени будет создаваться концентрация марбофлоксацина, многократно превышающая МИК.
Выводы
Проведенные исследования выявили анти-биотикорезистентные штаммы возбудителей мастита, что подтверждает необходимость постоянных мониторинговых бактериологических исследований с определением чувствительности выделенной микрофлоры к антибактериальным препаратам.
Марбофлоксацин показал высокую ингибиру-ющую активность в отношении специфических возбудителей маститов коров (Str. agalactiae и Str. uberis), что позволяет использовать инъекционные препараты на основе этой субстанции для лечения мастита коров в данных хозяйствах. Препараты на основе норфлоксацина и гентами-цина также могут быть использованы против Str.
agalactiae и Str. uberis. Из данных антибиотиков у препаратов на основе марбофлоксацина наиболее короткий период ожидания по молоку (24 часа), что является важным фактором при выборе средств для лечения маститов.
Список литературы
1. Акназаров Б. К. Микробная обсемененность молочной железы у коров, больных маститом / Б. К. Акназаров,
A. А. Матиев, У Н. Абдыманап [и др.] // Вестник Кыргызского национального аграрного университета им. К. И. Скрябина. 2023. № 2 (65). С. 84-91. EDN ELYMNN.
2. Глотова Т. И. Устойчивость возбудителей мастита у коров к антибактериальным препаратам / Т. И. Глотова, С. В. Котенева, Т. Е. Судоргина [и др.] // Вестник КрасГАУ 2023. № 3 (192). С. 95-100. DOI 10.36718/1819-4036-2023-395-100. EDN ZUUOWB.
3. Карташова В. М. Методические рекомендации по микробиологическому исследованию молока и секрета вымени коров для диагностики мастита / Рос. акад. с.-х. наук; разраб. В.М. Карташовой, Л.А. Тарановой. М. : РАСХН, 1994. 52 с.
4. Медведев Г. Ф. Заболеваемость коров маститом, эффективность лечения и потери молока / Г. Ф. Медведев,
B. В. Великанов, В. В. Омельянчук // Животноводство и ветеринарная медицина. 2023. № 3 (50). С. 59-64. EDN MSOOQL.
5. Семина Н. А. Методические указания МУК 4.2.189004. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам / разраб. Н. А. Семиной, С. В. Сидоренко, С. П. Резван, С. А. Груди-ниной [и др.] // Электронный фонд правовых и нормативно-технических документов «Кодекс». - URL: https://docs.cntd. ru/document/1200038583 (Дата обращения: 17.01.2022)
6. Явников Н. В. Лечение коров, больных маститами / Н. В. Явников // Успехи современной науки. 2016. Т. 9. № 11. С. 68-70.
7. Elzoghby R. Pharmacokinetics, urinary excretion and milk penetration of marbofloxacin in lactating buffaloes / R. Elzoghby, M. Aboubakr // Journal of American Science. 2015. № 11 (4). С. 23-28.
8. Shem-Tov M. Pharmacokinetics and penetration of marbofloxacin from blood in to the milk of cows and ewes / M. Shem-Tov, G. Ziv, A. Glickmanand, A. Saran // J. Vet. Med. 1997. № 44 (9-10). С. 511-519.
" "чЛ
О журнале Редколлегия Авторам Рекламодателям Архив Подписка Контакты ЕМ Ри
v s rttvil
АЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ВЕТЕРИНАРНОИ БИОЛОГИИ
ACTUAL QUESTIONS OF VETERINARY BIOLOGY
Адрес нового сайта >KypHafiaSHTTP://AVVB.RU
W Ш * • , ■ •
