CC BY
118
УДК 547.458.8: 546.215
ВЫДЕЛЕНИЕ ОЧИЩЕННОГО ФУКОИДАНА ИЗ ПРИРОДНОГО КОМПЛЕКСА С ПОЛИФЕНОЛАМИ И ЕГО ХАРАКТЕРИСТИКА
© А.М. Урванцева, И.Ю. Бакунина , Н.Ю. Ким, В.В. Исаков, В.П. Глазунов, Т.Н. Звягинцева
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДО РАН, пр-т 100-летия Владивостока, 159, Владивосток, 690022 (Россия), e-mail: bakun@list.ru
Разрушение комплекса полифенолов с фукоиданом было достигнуто в процессе обработки 5%-ным водным раствором Н2О2 при рН 8,3-8,7, 18 °С. Показана возможность применения метода флуоресценции для контроля процесса очистки полисахаридных фракций от полифенолов. Очищенный образец фукоидана имел молекулярную массу 40-50 кДа по результатам гельфильтрации (FPLC) и состоял главным образом из фукозы (94,6%). 13С-ЯМР спектр его был типичен для сульфатированного фукоидана, содержащего как а-(1^3)-, так и а-(1^4)-связанные остатки L-фукозы. По данным ИК спектроскопии содержание сульфатных групп в исходном и очищенном образцах фукоидана практически совпадало и соотношение сульфатов при С2 и С4 не изменялось. Фукоидан F2, обработанный перекисью, не проявлял восстанавливающей способности и мог быть использован в качестве субстрата для скрининга фукоиданаз в различных биологических объектах, исследования свойств этих ферментов и для изучения его биологической активности.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ № 03-04-49534 и программы РАН «Физикохимическая биология» (PCB RAS)
Введение
Морские бурые водоросли являются богатым источником различных соединений с хорошим потенциалом применения в медицине. Фукоиданы, матричные сульфатированные гетерополисахариды клеточных стенок [1], представляют большой интерес с точки зрения биологической активности. Исследованию биологической активности фукоиданов посвящено огромное количество публикаций, результаты которых суммированы в обзорах [2, 3]. Важным аспектом в этих исследованиях остается выявление взаимосвязи между структурой и биологической активностью этих полисахаридов.
Одним из наиболее богатых источников фукоидана является морская бурая водоросль Fucus evanescens. Она произрастает только на литорали у островов Курильской гряды. Разработан метод получения фукоидана [4]. Выход фукоидана при полной переработке этой водоросли достигает 15-20% от сухой массы [5]. Однако образцы этого полисахарида после такой переработки сохраняют бурую окраску.
Бурые водоросли накапливают большое количество полифенольных соединений (до 14% от сухой массы водоросли [6]), главным образом, флороглюцина (1,3,5-тригидроксибензола) и его полимеров -флоротаннинов [7]. Молекулярная масса флоротаннинов варьирует в пределах 126,5 Да - 650 кДа [7]. Полифенолы, прочно связанные с полисахаридами, уменьшают растворимость последних в воде [8]. Это приводит к потере водорослевого материала и мешает получить более полную информацию о составе водорастворимых полисахаридов.
В структурных исследованиях фукоиданов и других содержащих фукозу полисахаридов находят применение ферменты - фукоиданазы [9]. Влияние как свободных, так и связанных с полисахаридами
* Автор, с которым следует вести переписку.
полифенолов на активность фукоиданаз не исследовалось. Кроме того, высокая восстанавливающая сила флоротаннинов (4,15 meq/г) [10, 11] затрудняет тестирование активности фукоиданаз по увеличению восстанавливающей способности сахаров, появляющихся в результате гидролиза фукоидана. Поэтому крайне важно для изучения этих ферментов использовать субстрат, не содержащий полифенольных соединений.
В статье мы приводим способ получения фукоидана бурой водоросли Fucus evanescens, заключающийся в разрушении его комплекса с полифенольными соединениями с помощью перекиси водорода. Предложенный способ позволяет сохранить нативную структуру фукоидана.
Экспериментальная часть
Оборудование и материалы. В работе использовали рН-метр «Inolab» (Германия), центрифугу 2161 Midispin R «LKB Bromma» (Швеция) и «Typ 340» (Польша), мембрану для ультрафильтрации 1000 Да «Millipore» (Германия), FPLC «Acta» (Франция), углеводный анализатор IC-5001 «Biotronik» Германия. В качестве носителей для хроматографии использовали DEAE-целлюлозу «Reanal» (Венгрия) и сефадекс G-75 «Pharmacia» (Швеция), а в качестве стандартов - декстраны с молекулярными массами 80, 40, 20 и 10 кДа «Feral Berlin» (Германия), также моносахариды - фукозу, глюкозу, галактозу, ксилозу, маннозу и рамнозу «Sigma» (США). В работе был также использован родамин В «Wako Pure Chemical Industries» (Япония). Хлорид натрия, 30%-ный водный раствор перекиси водорода, фосфат натрия однозамещенный были производства «Реахим», а 10%-ный водный раствор NH3 - производства «Тамбовфармация» (Россия).
Выделение фукоидана. Бурую водоросль Fucus evanescens парамуширской популяции собрали в 1998 г. Сырую водоросль отмывали этиловым спиртом, а затем ацетоном и сушили на воздухе. Измельченную сухую водоросль обрабатывали горячей водой (60 °С, 4 ч) и выделяли фукоидан F0 по методике, описанной ранее [4].
Оптимизация условий обработки фукоидана F0 перекисью водорода. Фукоидан F0 (0,5 г) растворяли в 50 мл воды и при постоянном перемешивании добавляли 10, 25 и 50 мл 30% водного раствора перекиси водорода (конечная концентрация реагента - 5, 10 и 15% соответственно), 10% водным раствором NH3 доводили до исследуемого рН. Смесь оставляли в темноте на 17 ч при комнатной температуре. Нерастворимый осадок удаляли центрифугированием при 4500xg. Супернатант диализовали против воды, дважды осаждали этиловым спиртом, осадок центрифугировали и сушили ацетоном, затем эфиром на воздухе.
Обработка фукоидана F0 перекисью водорода в оптимальных условиях и его дальнейшая очистка. Полисахарид F0 обрабатывали 5% водным раствором Н2О2 при рН 8,5. Полученный полисахарид F хроматографировали на колонке (3x15 см) с DEAE-целлюлозой линейным градиентом 0-2 М вода / NaCl (500 мл / 500 мл) со скоростью 1,1 мл/мин. Обнаружение полисахарида проводили фенол-сернокислотным методом [12]. Полученные фракции полисахаридов F1 и F2 обессоливали ультрафильтрацией, упаривали и лиофильно сушили. Полная схема очистки представлена на рисунке 1.
Распределение молекулярных масс образцов полисахаридов устанавливали методом гельфильтрации на колонке с сефадексом G-75 (1,3x100 см, вода, 1,1 мл/мин). В качестве стандартов использовали декстраны.
Молекулярную массу полисахарида F2 оценивали методом гельфильтрации (FPLC) на колонке с супердексом 75HR (1,0x30 см, 0.01 М фосфатный буфер рН 7,2, 0,15 М NaCl, скорость 0,4 мл/мин, петля -
0,1 мл). В качестве стандартов использовали декстраны. Обнаружение полисахарида выполняли фенол-сернокислотным методом [12].
УФ-спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре «Cecil CE 7200» (Англия). Растворы образцов полисахаридов перед измерением центрифугировали в течение 15 мин при 15000xg.
Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре «Hitachi-850» (Япония) от 380 до 600 нм в кварцевой кювете с толщиной слоя 1 см, Хвозб - 366 нм. Спектры корректировали по родамину В и записывали в режиме интегрирования. Выход флуоресценции (S) определяли вычитанием из общей площади спектра площадь спектра буферного раствора, включая линию Раммановского рассеяния. Ширина щели на монохроматорах возбуждения и излучения - 5 нм, скорость записи спектров - 100 нм/см. Индекс флуоресценции определяли как I = f450/f500, где f450 и f500 - интенсивность флуоресценции при 450 и 500 нм.
Обезжиренная, измельченная бурая водоросль
^ ЩЛ 4 ч. б(ГС
Г і щрофобная хроматографі и на ПХ-1
Элюцня 159 ó этанолом
Ламннаран F0
5% Н202, рН=8,5
ДЭАЭ-
Рис. 1. Схема выделения и очистки фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens
Степень очистки от полифенольных соединений m определяли по формуле:
m = 1 - S/S0,
где S - выход флуоресценции исследуемых образцов очищенных полисахаридов и S0 - выход флуоресценции исходного образца фукоидана F0.
13С-ЯМР-спектры регистрировали на ЯМР-спектрометре «Bruker WM-250» (Германия), в D2O при 70 °С, в качестве внутреннего стандарта использовали метанол (50,15 мд от (CH3)4Si).
ИК-спектры полисахаридов регистрировали на спектрометре с Фурье преобразованием FTIR Vector 22, «Bruker» (Германия), в таблетках КВг, с разрешением 4 см-1. Разложение контура полос в спектре делали по программе «Fit curve», входящей в пакет программы «OPUS ver. 3,0», после стандартной процедуры сглаживания спектра по 17 точкам и коррекции базовой линии на рассеивание.
Оптическое вращение водных растворов полисахаридов ([a]D20 с 1 мг/мл, в воде) измеряли на поляриметре «Perkin-Elmer 141» (Германия).
Моносахаридный состав фукоиданов определяли после кислотного гидролиза полисахарида (5 мг) в 4 н HCl при 100 °С (4 ч) на углеводном анализаторе (анионообменная смола Durrum DA-X8-11, 3,2x385 мм), обнаружение моносахаридов проводили бицинхонинатным методом (интегрирующая система C-R2 AX, «Shimadzu», Япония). В качестве стандартов использовали моносахариды фукозу, глюкозу, галактозу, ксилозу, маннозу и рамнозу.
Общее содержание углеводов в образцах фукоидана определяли по фенол-сернокислотному методу
[12]. Фукозу использовали как стандарт.
Восстанавливающую способность очищенных образцов полисахарида определяли по методу Нельсона
[13] и рассчитывали как процент от восстанавливающей способности исходного полисахарида F0, которую принимали за 100%.
Содержание сульфатных групп в образцах полисахаридов определяли по турбодиметрическому методу
[14] и рассчитывали как процент от навески соответствующего полисахарида.
Обсуждение результатов
Бурая окраска, обусловленная полифенолами, сопровождала образцы полисахаридов на всех стадиях выделения их из бурой водоросли Fucus evanescens (рис. 1). Полифенолы не отделялись от полисахарида F0 также после осаждения этиловым спиртом в различных концентрациях, гельфильтрации на сефарозе СЬ-6В, сефадексе G-75, рехроматографии на гидрофобном сорбенте, после диализа против воды, ультрафильтрации и анионообменной хроматографии.
УФ-спектр поглощения образца фукоидана F0, выделенного по схеме, приведенной на рисунке 1, имеет характерный для ароматических соединений максимум при 268 нм. Монотонное уменьшение оптической плотности в районе 275-340 нм без ярко выраженных экстремумов может свидетельствовать о присутствии ряда веществ с высокосопряженными ароматическими структурами (рис. 2, кривая 1). Известно, что в этой области спектра поглощают флоротаннины бурых водорослей [15].
Выявить более достоверно присутствие полифенольных соединений в образце полисахарида можно с помощью метода флуоресценции. Флуорометрический метод, используемый для измерения флороглюциновых производных, как основных фенолов бурых водорослей, не является специфическим. Однако это чувствительный прямой метод для определения флуоресцирующих примесей, в том числе и фенольных. Главное его достоинство, в нашем случае, состоит в том, что он относительно прост для выполнения и позволяет быстро сделать заключение об эффективности различных стадий очистки полисахарида.
Спектры флуоресценции полифенолов, связанных с фукоиданами, прежде не исследовались. В литературе представлены спектры флуоресценции полифенолов, связанных с альгиновой кислотой из бурой водоросли Laminaria pallida и коммерческим альгинатом Manugel GHB. Широкие максимумы этих спектров расположены при 440-445 нм, индекс флуоресценции (I) для полифенолов, связанных с вышеназванными альгиновыми кислотами, составляет 1,96 [16, 17].
На флуоресценцию могут влиять различные факторы микроокружения, в том числе и заряженные ионогенные группы полисахарида. Поэтому применять метод флуоресценции для определения качественного и количественного состава полифенолов, прочно связанных с конкретным полисахаридом не представляется возможным до тех пор, пока не будут исследованы все детали образования комплекса и, главное, влияния структурных особенностей полисахарида на флуоресценцию связанных полифенолов. Однако для определения относительного содержания флуоресцирующих примесей в образце этот метод очень удобен.
Спектры возбуждения и флуоресценции образца F0 представлены на рисунке 2 (кривые 2 и 3 соответственно). Максимум возбуждения расположен при 366 нм. Спектр флуоресценции, возбужденный светом с длиной волны 366 нм, имеет широкий максимум при 450-455 нм и плечо в районе 530-550 нм. Известно, что форма спектра зависит от природы вещества, с которым полифенолы образуют прочный комплекс [16-19]. Ее характеризует индекс флуоресценции (I) - отношение интенсивности флуоресценции при 450 и 500 нм (f450/f500) [17]. Для флуоресценции полифенолов образца F0 - I = 1,15.
f,
отн.ед.
длина волны, нм
Рис. 2. УФ-спектр поглощения (1), возбуждения (2) и флуоресценции (Хвозб -366 нм) (3) полифенолов, прочно связанных с фукоиданом из бурой водоросли Fucus evanescens (F0) (1 мг/мл, 0,1М Na фосфатный буфер, рН 8,4)
Выход флуоресценции (S) полифенолов образца F0 возрастает линейно с увеличением концентрации его до 3 мг/мл и снижается по мере увеличения концентрации до 25 мг/мл (рис. 3 а). Выход флуоресценции (S) увеличивается в диапазоне рН от 5,6 до 8,6 по мере депротонирования свободных гидроксильных групп в полифенольных соединениях (рис. 3б, кривая 1). Индекс флуоресценции, напротив, незначительно уменьшается по мере увеличения рН (рис. 3б, кривая 2). В области рН 8,0-8,6 параметры флуоресценции стабильны, поэтому для контроля процессом очистки мы выбрали 0,1 М фосфатный буфер, рН 8,6.
Известно, что полифенолы прочно ассоциированы с полисахаридами, особенно альгиновыми кислотами и фукоиданами. Они могут связывать между собой несколько молекул различных полисахаридов или, как сеть, опутывать их. Природа взаимодействий пока не изучена, но можно предположить, что это - координационные взаимодействия, в которые легко может вступать кислород простой эфирной связи полифенолов, двухвалентные металлы и, в случае фукоидана, кислород сульфатных групп, также нельзя исключать водородные связи и гидрофобные взаимодействия. Поэтому необходимо было ввести стадию очистки, при которой происходит разрушение этих взаимодействий с сохранением полисахаридной цепи.
Для обесцвечивания природных полисахаридов используют перекись водорода [20], подбирая условия, при которых, по возможности, сохраняется структура полисахарида.
Мы воспользовались этим химическим агентом для разрушения трудно отделяемых примесей полифенолов. Однако с помощью перекиси водорода фукоидан можно фрагментировать, хотя для деструкции фукоидана требуются жесткие условия (кислые рН, Т>60°, ионы двухвалентных металлов) [21]. Для обработки фукоидана подбирали условия, изменяя концентрацию перекиси водорода и рН среды (табл. 1). Очистку фукоидана от примеси полифенолов контролировали методом флуоресценции, а возможные изменения молекулярной массы полисахарида - гельфильтрацией (рис. 4).
После обработки полисахарида 5, 10 и 15% водными растворами Н2О2 при рН 7,8-8,8 глубокое отделение полифенолов достигалось в равной степени при всех трех концентрациях перекиси водорода (ш^0,9) (табл. 1). Менее полидисперсным оказался образец, обработанный 5% водным раствором Н2О2 при рН 8,8 (рис. 4а, кривая 2), а наиболее деструктирован был образец, полученный после обработки исходного полисахарида 15% водным раствором Н2О2 (рис. 4а, кривая 4, табл. 1).
С целью выбора оптимального рН обработку полисахарида провели 5% водным раствором Н2О2 в интервале рН 4-9. Очистка от полифенолов была наивысшей при рН 8,5 (ш=1,0, табл. 1). Молекулярная масса полисахарида F была сравнима с таковой исходного образца F0 (рис. 4б, кривая 4).
Таким образом, оптимальным для обесцвечивания фукоидана F0, выделенного из бурой водоросли Fucus evanescens, оказался 5% водный раствор перекиси водорода в щелочной среде (7,8-8,8).
S*104,
S*10.
концентрация, мг/мл
I
б
Рис. 3. - Зависимость выхода флуоресценции от концентрации полисахарида (а); зависимость выхода флуоресценции (1) и индекса флуоресценции I (2) полифенолов, прочно связанных с полисахаридом, от pH (1 мг/мл, 0,1М № фосфатный буфер, Хвозб - 366 нм) (б)
После обработки исходного полисахарида Б0 5% водным раствором перекиси водорода при рН 8,5 получили образец полисахарида Б (рис. 1). Его подвергли анионообменной хроматографии (рис. 5), в результате которой получили две фракции полисахаридов Б1 и Б2, свободных от полифенольных соединений.
Полисахарид Б1 (табл. 2), выход - 8,4%, [а]Б20 = -90° (с 1.0, Н20) не содержал сульфатных групп (по данным турбдиметрического метода).
В спектре 13С полисахарида Б1 наблюдались сигналы в области резонанса 5 176,8-177,9 м.д. и сигналы в аномерной области 5 101,2-102,5 м.д., характерные для С6 и С1 атомов пиранозного кольца гликуроновых кислот (рис. 6а). Сигналы в области 60-62 м.д. и высокого поля (16-18 м.д.) полностью отсутствовали. Данные спектры соответствовали 13С-ЯМР спектрам альгиновой кислоты, состоящей из МММ-блоков, построенных из остатков Б-маннуроновой кислоты, с небольшим включением ввМ-блоков, содержащих в своем составе остатки Ь-гулуроновой и Б-маннуроновой кислот [22].
Таблица i. Характеристика образцов фукоидана Fo, полученных после обработки его перекисью водорода в различных условиях
№ Условия обработки Выход водорастворимой фракции, % * Общий сахар, % Восстанавливающая способность, % Степень очистки от полифенольных соединений, m
1 Н2О S2,3 45,5 100 0
2 5% Н2О2, рН 4,3 46,S б2,0 43,3 0,25
3 5% Н2О2, рН б,5 60,S 50,5 3,1 0,65
4 5% Н2О2, рН 7,4 60,S 52,5 7,9 0,S1
5 5% Н2О2, рН S,5 б0,0 49,0 7,1 1,00
б 5% Н2О2, рН S,7 50,4 53,9 0,SS
7 5% Н2О2, рН S,S 74,2 45,5 3,1 0,92
S 5% Н2О2, рН 9,б 54,0 66,0 32,3 0,79
9 10% Н2О2, рН S,3 77,S 52,5 S,7 0,90
10 15% Н2О2, рН 7,S 74,2 52,5 б,3 0,91
* Выход от навески исходного образца фукоидана Fo.
V, мл
V, мл
Рис. 4. Гельфильтрация исходного фукоидана Fo (i) и образцов F, полученных после обработки фукоидана Fo 5 (2), 10 (3) и 15-процентными (4) водными растворами перекиси водорода при рН 7,S-S,S (а); гельфильтрация исходного фукоидана Fo (i) и образцов F, полученных после обработки 5-процентным водным раствором перекиси водорода фукоидана Fo при рН б,5 (2); 7,4 (3); S,7 (4) (б). Колонка: сефадекс - G-75, 1,34x100 см, вода - 1,1 мл/мин.
Таблица 2. Характеристика образцов полисахаридов, полученных на различных стадиях очистки
Образец Выход полисахарида, %* Общий сахар, % Восстанавливающая способность, % Сульфатные группы, %** [а]в20, ° в Н2О Состав нейтральных моносахаридов,%
Fuc Rha Gal Glc Xyl
F0 100 45,5 100 14,3 -114,75 69,0 3,3 5,2 11,8 10,7
F 60 49 7,1 16,8 -124,2 74,2 0 9,0 0 16,8
F-1 8,4 48 11,0 0 -90 0 0 0 0 0
F-2 38 40 0,2 31,4 -173 94,6 0,3 4,2 0 0,9
* % от навески исходного полисахарида Б0.
** Количество сульфатных групп определено по турбидиметрическому методу и представлено как % от навески вещества.
D
490
Рис. 5. Фракционирование на ДЭАЭ-целлюлозе (3x15 см, 1,1 мл/мин) фукоидана F0, выделенного из бурой водоросли Fucus evanescens (1), и образца F, обработанного 5% Н2О2 при рН 8,5, (2); градиент 0-2 М NaCl (3)
V, мл
U
я
£
«
S
я
а
н
х
X
О
б
Рис. 6. 13С-ЯМР спектры полисахаридов F1 (а) и F2 (б), выделенных из бурой водоросли Fucus evanescens согласно схеме, изображенной на рисунке 1
Полисахарид F2, выход - 38%, [а]в20 - 173° (с 1.0, H2O), имел моносахаридный состав (Fuc : Rha : Gal : Xyl = 94,6 : 0,3 : 4,2 : 0,9), характерный для фукоидана из F. evanescens [23]. В процессе очистки, по-видимому, отделилась примесь полисахарида, в состав которого входили остатки глюкозы и рамнозы (табл. 2). По данным гельфильтрации (FPLC), образец фукоидана F2 - полидисперсный (4060 кДа). Степень очистки от полифенолов - 1, восстанавливающая способность у F2 практически полностью отсутствовала (0,2% от таковой фукоидана F0).
В 13С-ЯМР спектре полисахарида F2 (рис. 6б) наблюдались сигналы в области высокого поля 5 16,918,06 м.д., характерные для С6 атома фукопиранозы. Сигналы аномерных С-атомов при 100,2, 99,95, 98,36 и 94,96 м.д., а также сигналы в области 5 75-83,7 м.д. свидетельствовали о наличии фрагментов (1^4)-a-L-Fuc/>2SO3-, (1^3)-a-L-Fuc/>2,4SO3-, (1^3)-a-L-Fuc/>2SO3- [23, 24]. Можно предположить, что сульфатные группы в образце фукоидана F2 расположены преимущественно во втором положении. В спектре наблюдались сигналы в области 5 21-22 м.д., характерные для углерода ацетатных групп. Таким образом, полисахарид F2 оказался фукоиданом, сульфатированным преимущественно по С2, с невысокой степенью ацетилирования.
ИК-спектры полисахаридов F0 и F2 оказались идентичными. В них присутствовали интенсивные полосы поглощения при 1258-1263 см-1 (рис. 7а), характерные для SO3 групп. Оценка содержания сульфатных групп в исходном образце F0 и очищенном F2 выполнена по величинам отношения поглощения сульфатных групп и поглощения скелетного колебания сахарного кольца при 1027 см-1, за вычетом локальной базовой линии, экстраполированной прямой в области 1580-880 см-1 (рис. 7а). Отношение (0,90 и 0,88) совпадает в пределах ошибки оценки ±4%.
IV. J--------------1----------1----------1----------1----------1----------1----------1----------1----------1-----------1----------1----------1----------1----------1----------1----------1----------1----------1----------1----------1----------1----------1-----------1----------1----------Г
Рис. 7. ИК-спектр образца полисахарида Б2, прошедшего все стадии очистки - пунктиром обозначена базовая линия (а); результаты математического анализа контура полосы при 827 см-1 с разложением на составляющие компоненты (б)
Для этих образцов полисахарида в ИК-спектрах также наблюдались полосы поглощения при 823 и 827 см-1, соответственно, которые были ассиметричны с высокочастотного крыла (плечи при 845 см-1). Математический анализ контура этих полос с разложением на составляющие компоненты, описываемые лоренцевыми и гауссовыми кривыми, показал, что в исходном образце F0 полоса при 823 см-1 состоит из двух компонент с частотами при 848 и 819 см-1, характерными для сульфатных групп при С4 и С2 соответственно. Отношение их площадей составляет 0,78. Контур наблюдаемой полосы при 827 см-1в спектре образца полисахарида F2, прошедшего все стадии очистки, также дал два компонента при 844 и 820 см-1 (рис. 7б). Отношения их площадей (0,84) отличались всего лишь на 7% от таковых исходного образца F0. Согласно ИК-спектрам, в выделенном образце фукоидана преобладали сульфаты при С2.
Заключение
В результате проделанной работы мы получили образец фукоидана F2, свободный от полифенольных соединений, практически не имеющий восстанавливающей способности и примеси альгиновых кислот. Полисахарид F2 имел молекулярную массу 40-60 кДа и 13С ЯМР-спектр, характерный для фукана из бурой водоросли F. evanescens. По данным ИК-спектроскопии соотношение сульфатных групп в очищенном образце сохранялось. Полученный образец фукоидана пригоден для использования в качестве субстрата для скрининга фукоиданаз, исследования свойств этих ферментов, а также для изучения его биологической активности.
Список литературы
1. Kloareg B., Quatrano R.S. Structure of cell walls of marine algae and ecophysiological functions of the matrix polysaccharides // Oceanography and Marine Biology. New York, 1988. V. 26. P. 259-315.
2. Berteau O., Mulloy B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide // Glycobiology. 2003. V. 13. №6. P. 29R-40R.
3. Кузнецова Т.А., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н. Биологическая активность фукоиданов из бурых водорослей и перспективы их применения в медицине // Антибиотики и химиотерапия. 2004. (в печати)
4. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Popivnich I.B., Isakov V.V., Scobun A.S., Sundukova E.V., Elyakova L.A. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweed // Carbohydr. Res. 1999. V. 322. №1-2. P. 32-39
5. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Chizhov A.O., Krupnova T.N., Sundukova E.V., Isakov V.V. Water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds. Distribution, structure, and their dependence on the developmental conditions // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 2003. V. 294. №1. P. 1-13.
6. Ragan M.A., Jensen A. Quantitative studies on brown algal phenols. II. Sesonal variation in polyphenol content of Ascophyllum nodosum (L.) Le Jol. and Fucus vesiculosus (L.) // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1978. V. 34. №3. P. 245-258.
7. Ragan M.A., Glombitza K.V. Phlorotannins, brown algal polyphenolics // Progress in Phycological Research, Bristol. 1986. V. 4. P. 129-241.
8. Moen E., Larsen B., Ostgaard K. Aerobic microbial degradation of alginate in Laminaria hyperborea stipes contaning different levels of polyphenols // J. Appl. Phycol. 1997. V. 9. №1. P. 45-54.
9. Кусайкин М.И., Чижов А.О., Алексеева С.А., Бакунина И.Ю., Недашковская О.И., Сова В.В., Звягинцева Т.Н. Сравнительное исследование специфичности фукоиданаз морских микроорганизмов и беспозвоночных // Докл. АН. 2004. Т. 396. №5. С. 1-3.
10. Ragan M.A., Jensen A. Quantitative studies on brown algal phenols. I. Estimation of absolute polyphenol content of Ascophyllum Nodosum (L.) Le Jol. and Fucus vesiculosus (L.) // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1977. V. 30. №2. P. 209221.
11. Haug A., Larsen B. Phenolic compounds in brown algae I. The presence of reducing compounds in Ascophyllum Nodosum (L.) Le Jol // Acta Chem. Scand. 1958. V. 12. №4. P. 650-657.
12. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J., Roberts P.A., Smith F. Calorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. V. 28. №2. P. 350-356.
13. Nelson T.E. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose // J. Biol. Chem. 1944. V. 153. №1. P. 375-381.
14. &aigie J.S., Wen Z.C., Van der Meer J.P. Interspecific, intraspecific and nutritionally-determined variations in composition of agars from Gracilaria spp. // Bot. Mar. 1984. V. 27. № 2. Р. 55-61.
15. Pavia H., Brock E., Extrinsic factors influencing phlorotannin production in brown alga Ascophyllum nodosum // Mar. Ecol. Prog. Ser. 2000. V. 193. P. 285-294.
16. McKnight D.M., Boyer E.W., Westerhoff P.K., Doran P.T., Kulbe T., Anderson D.T. Spectrofluorimetric characterization of dissolved organic matter for indication of precursor organic materials and aromaticity // Limnol. Oceanografy. 2001. V. 46. №1. P. 3S-4S.
17. Chen J., Le Boeuf E. J., Dai S., Gu B. Fluorescence spectroscopic studies of natural organic matter fractions // Chemosphere. 2003. V. 50. №5. P. 639-647.
iS. Klock G., Frank H., Houben R., Zekorn T., Horcher A., Siebers U., Wohrl M., Federlin K., Zimmermann U. Prodaction of purified alginates sutable for use in immunoisolated transplantation // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. V. 40. №5. P. 63S-643.
19. Jork A., Thurmer F., Cramer H., Zimmermann G., Gessner P., Hamel K., Hofmann G., Kuttler B., Hahn H.-J., Josimovic-Alasevic O., Fritsch K.-G., Zimmermann U. Biocompatible alginate from freshly collected Laminaria pallida for implantation // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. V. 53. №2. P. 224-229.
20. Колмакова O.A., Пен P.З., Шапиро И.Л., Бывшев A.B., Тарабанько В.Е. Низкотемпературная окислительная делигнификация древесины. 11. Химические свойства пероксидной целлюлозы // Химия растительного сырья. 2003. №1. С. 39-43.
21. Nardella A., Chaubet F., Boisson-Vidal C., Blondin C., Durand P., Jozefonvicz J Anticoagulant low molecular weight fucans produced by radical process and ion exchange chromatography of high molecular weight fucans extracted from the brown seaweed Ascophyllum nodosum // Carbohydr. Res. 1996. V. 2S9. P. 201-20S.
22. Grasdalen H., Larsen B., Smidsrad O. 13C-n.m.r. studies of monomeric composition and sequence in alginate // Carbohydr. Res. 19S1. V. S9. №2. P. 179-191.
23. Bilan M.I., Grachev A.A., Ustuzhanina N.E., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens // Carbohydr. Res. 2002. V. 337. №S. P. 719-730.
24. Daniel R., Berteau O., Chevolot L., Varenne A., Gariel P., Goasdoue N. Regioselective desulfation of sulfated L-fucopyranoside by a new sulfoesterase from the marine mollusk Pecten maximus. Application to the structural study of algal fucoidan (Ascophyllum nodosum) // Eur. J. Biochem. 2001. V. 26S. №21. P. 5617-5626.
Поступило в редакцию 11 августа 2004 г.
После переработки 14 сентября 2004 г.
