CC BY
65
ВЫДЕЛЕНИЕ ОБЩИХ ЛИПИДОВ ИЗ СЫРЬЯ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПИВА И РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В НИХ ФИТОСТЕРИНОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ (ВЭЖХ)
© Рапота М.О.*, Тырсин Ю.А.*
Московский государственный университет пищевых производств,
г. Москва
Для изучения содержания фитостеринов в сырье для производства пива, были выбраны хмель и солод. Исследования методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-детектированием показали, что в солоде и хмеле присутствуют следующие фитосте-рины: стигмастерин, бета-ситостерин, кампестерин и брассикастерин.
Ключевые слова фитостерины, сырье для производства пива, липи-ды, методы определения, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), кампестерин бета-ситостерин, стигмастерин.
Липиды представляют собой группу природных молекул, включающую жиры, воски, стерины, жирорастворимые витамины (А, D, Е и К), моногли-цериды, диглицериды, триглицериды, фосфолипиды и другие. Основные биологические функции липидов это выступление в качестве структурных компонентов клеточных мембран и хранение энергии.
Один из фитостеринов - бета-ситостерин
Рис. 1. Структурные формулы бета-ситостерина и холестерина
Фитостерины - растительные стерины, выделяемые из неомыляемой части липидов растений. Фитостерины структурно подобны животным сте-
* Аспирант.
* Профессор, доктор технических наук.
ринам. Но в отличие от стеринов животных (например, холестерина), боковая цепь в молекулах фитостеринов ненасыщена и содержит не 8, а 9 или 10 атомов углерода [1]. Сравнение формул бета-ситостерина и холестерина представлены на рис. 1.
Известно, что в природе существует более 200 фитостеринов. Наиболее распространёнными фитостеринами являются бета-ситостерин, стигмасте-рин и брассикастерин. Температуры плавления бета-ситостерин - 140 °С, стигмастерин - 170 °С, брассикастерин - 148 °С [2]. Структурные формулы данных фитостеринов представлены на рис. 2.
Рис. 2. Структура растительных стеринов: 1 - бета-ситостерин; 2 - стигмастерин; 3 - брассикастерин
В организм человека фитостерины попадают с растительной пищей. Существует теория о том, что содержание фитостеринов в пиве настолько значительно, что может оказывать негативное влияние на организм человека. Изучение содержания фитостеринов в сырье для производства пива является одной из новых проблем исследования, возникшего в связи со значительным увеличением потребления пива за последние годы [3].
Рассматривая подходы к определению фитостеринов в липидах сырья для производства пива, необходимо учитывать, что точное определение фи-тостеринов в растительной матрице сложно потому, что фитостерины присутствуют в растениях, как в «свободной», так и в «сопряженной» форме, как эфиры или гликозиды [4].
Содержание фитостеринов в ряде пищевых продуктов, таких как соя, морковь, инжир, кориандр и другие пищевые источники, регулируется Едиными санитарно-эпидемиологические и гигиенические требованиями к товарам, подлежащих санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) Таможенного Союза. Согласно Единым санитарно-эпидемиологическим и гигиеническим требованиям к товарам, подлежащих санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) Таможенного Союза верхний допустимый уровень потребления фитостеринов варьируется от 450 мг до 600 мг в сутки [5].
На сегодняшний день в Российской Федерации не существует утвержденных методов определения фитостеринов в пищевых продуктах. За рубежом содержание фитостериов в пищевых продуктах осуществляют при помощи газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии [6].
Преимуществами данных методов является высокая чувствительность. Для определения фитостеринов в сырье для производства пива, принимая
во внимание зарубежный опыт, был выбран метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Целью работы являлась разработка методики выделения общих липи-дов из сырья для производства пива и определения фитостеринов методом ВЭЖХ.
Материалы и методы
Хроматографическое определение проводилось на системе жидкостной хроматографии типа Agilent Technologies 1200 Series с детектором по светорас-сеиванию: Alltech 3300 ELSD, тип колонки: Agilent Hypersil ODS 2.0 x125 mm. А так же на системе жидкостной хроматографии типа Agilent 1100 Series LC/MS с масс-детектором, тип детектора: LC/MSD Trap SL. Центрифугирование образцов проводилось на центрифуге: Rotina 38 (ФРГ), встряхивание -на шейкере для встряхивания пробирок Biosan OS-10 (США).
При подготовке проб использовались следующие реактивы: вода дистиллированная, метанол, ацетонитрил для ВЭЖХ, дихлорметан.
Объекты исследования
Для разработки методики выделения общих липидов из сырья для производства пива и определения фитостеринов было выбрано сырье, которое используется для производства практически любых сортов пива: хмель и солод. Указанные продукты были приобретены в интернет-магазине Новопермского Пивоваренного Завода: http://pivoperm.ru/magazin.html.
Приготовление стандартного раствора
Навеску холестерина 1 мг поместили в мерную колбу на 100 см3, добавили навеску 1 мг бета-ситостерина, растворили в смеси 50 мл этанола +15 мл дихлорметана, добавили 35 мл дистиллированной воды, перемешали до полного растворения.
Подготовка пробы
Около 50 г солода подвергли измельчению в лабораторной мельнице. Навеску измельченного солода 5 мг поместили в мерную колбу на 100 см3, добавили 10 мл дистиллированной воды, добавили 5 мл дихлорметана, перемешали до полного растворения. Мерной пипеткой перенесли 1 мл приготовленного раствора в полимерную пробирку объемом 15 см3 с герметичной крышкой.
Навеску хмеля 5 мг поместили в мерную колбу на 100 см3, добавили 10 мл дистиллированной воды, добавили 5 мл дихлорметана, перемешали до полного растворения. Мерной пипеткой перенесли 1 мл приготовленного раствора в полимерную пробирку объемом 15 см3 с герметичной крышкой.
Получившиеся растворы центрифугировали в течение 5 мин, надоса-дочную жидкости исследовали.
Условия хроматографического разделения и детектирования
В ходе первой части эксперимента, был выбран метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с детектором по светорассеянию.
Условия детектирования: состав подвижной фазы: вода дистиллированная, ацетонитрил. Тип детектора: Agilent Technologies 1200 Series; детектор по светорассеиванию: Alltech 3300 ELSD. Условия хроматографирования: тип колонки: тип колонки: Agilent Hypersil ODS 2.0x125 mm, температура термостата 20 °C.
Однако детектирование по светорассеянию применить не удалось. Эксперимент показал, что определить фитостерины не представлялось возможным, на хроматограммах наблюдалось большое количество пиков различных веществ. Полученные хроматограммы представлены на рис. 3-4.
Рис. 3. Хроматограмма образца хмеля
Было принято решение использовать метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-детектированием [7]. Условия детектирования были выбраны следующие: состав подвижной фазы: вода дистиллированная, ацетонитрил. Тип детектора: Agilent 1100 Series LC/MS; ис-
точник ионов: APCI; скорость газа-распылителя (азот): 10 л/мин; давление небулайзера: 50 psi; температура газа-осушителя (азот): 350 °С; полярность: положительная; тип детектирования: LC/MSD Trap SL; энергия разрушения (амплитуда): 1,2. Условия хроматографирования: тип колонки: Agilent Hy-persil ODS 2.0x125 mm, температура термостата 20 °C.
В процессе масс-детектирования образца солода по молекулярным массам удалось установить наличие в образце бета-ситостерина, стигмастери-на, кампестерина, брассикастерина.
В процессе масс-детектирования образца хмеля удалось установить наличие: бета-ситостерина, стигмастерина и кампестерина. Полученные хро-матограммы представлены на рис. 5-6.
I-EIC 397.5 +All MS '
— EIC395.5 +All MS
EIC 383.5 +All MS
-EIC 381.5 +All MS
Рис. 5. Хроматограмма солода с разрушением основных ионов
+MS2(397.5), 13.4-13.9min #р43-567) 397.5
1.25
1.00
0.75
61.3
203.3
35.3
4 299.4
175.3
215.3
275.4
327.4 341.4
0.00
+MS2(395.5), 9.6-9.9min #(382-391) 395.5
1.5
1.0
0.5
311.4
161.3
203.3
3 215.3 229.3
325.4
241.3
339.4
123.4
0.0
38 +MS2(383.5),1 1.9-12.2min #(473-482) .5
24 3.3
13 5.314 73 16 1.3 18 175.3 20 1.3 3.3 215.3 I 229.3 25 7.4 27 30 3.4 1.4
1094-9,3, , Il Jli < Il 1 „, Il и, il 1 1 II 31341 . . 3655 ,
100 150 200 250 300 350 400 m/z
Рис. 6. Хроматограммы хмеля с разрушением основных ионов Результаты
Исследования методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-детектированием позволило сделать вывод, что в солоде и хмеле присутствуют следующие фитостерины, исходя из их молекулярных масс: стигмастерин, бета-ситостерин, кампестерин и брассикастерин.
Таким образом, проведенные исследования показали возможность качественного определения фитостеринов в сырье для производства пива методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Список литературы:
1. Heitmann Е. // Biochemistry of plant steroids. - 1963. - Vol. 14.
2. Джафаров М.Х., Зайцев С.Ю., Максимов В.И. // Стероиды. Строение, получение, свойства и биологическое значение, применение в медицине и ветеринарии. - СПб., 2010. - C. 153.
3. Kirin Research Institute of Drinking and Lifestyle // Beer Consumption in Major Countries. - 2005. - Vol. 29.
4. Bedner M., Schantz M.M., Sander L.C., Katherine E. // Journal of Chromatography A. - 2008. - Vol. 1192. - P. 2-3.
5. Едиными санитарно-эпидемиологические и гигиенические требованиями к товарам, подлежащих санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) Таможенного Союза. - C. 398-399.
6. Dutta P.C. // Phytosterols as Functional Food Components and Nutraceuti-cals. - 2003. - P. 453.
7. Lu B., Zhang Y., Wu X., Shi J. // Journal Analytica Chimica Acta. - 2007. -Vol. 588. - P. 1-2.
