CC BY
103
УДК 577.113.083
Боровкова Е.К. Красноштанова А. А.
ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ БИОМАССЫ ХЛЕБОПЕКАРНЫХ ДРОЖЖЕЙ
Боровкова Елизавета Константиновна, студентка 3 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии;
Красноштанова Алла Альбертовна, доктор химических, доцент, профессор кафедры биотехнологии, e-mail: aak28@yandex.ru ;
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
В данной работе методами экстракции и осаждения была выделена рибонуклеиновая кислота из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Очистка дрожжевой РНК от примесей производилась методом ультрафильтрации. Подобраны оптимальные условия экстракции РНК из клеток дрожжей. Определены количественные характеристики стадии ультрафильтрации.
Ключевые слова: нуклеиновые кислоты, экстракция, ультрафильтрация, осаждение, количественные методы. ISOLATION ACIDS FROM BAKER S YEAST BIOMASS Borovkova E.K., Krasnoshtanova A. A.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
In this paper ribonucleic acid was isolated from the biomass of Saccharomyces cerevisiae by extraction and precipitation. Separation of the yeast's RNA from impurities was made by an ultrafiltration method. Selected optimal conditions for the extraction of RNA from yeast cells. The quantitative characteristics of the ultrafiltration stage are determined.
Keywords: nucleic acid, extraction, ultrafiltration, precipitation, quantitative methods.
Введение
Нуклеиновые кислоты применяются прежде всего в медицине - как сырье для получения нуклеозидов, нуклеотидов и пр. Так, нуклеинат натрия (натриевая соль низкомолекулярной дрожжевой РНК, содержащая 1,5-1,6% белка и 2% ДНК) достаточно давно применяется в медицине для лечения широким спектром заболеваний. Лечебный эффект производных ДНК заключается в нормализации процессов метаболизма в тканях, находящихся в экстремальных условиях. Это очень важно для лечения онкологических заболеваний.
Выбор метода выделения РНК зависит, прежде всего, от поставленных задач [1], а также от ряда требований [2], основными из которых являются следующие: высокий выход выделяемой РНК; достаточная степень очистки конечного продукта, экономичность и простота метода.
Распространенным методом выделения нуклеиновых кислот является разрушение клеток микроорганизмов и животных тканей. В промышленности используют способ выделения ДНК из клеток микроорганизмов является метод, включающий обработку клеток буферным раствором, содержащим производные гуанидиния в концентрации 4-8 М, нагревание реакционной смеси при температуре 100 оС в течение 3-7 мин с последующим выделением из реакционной смеси
геномной ДНК, прочно ассоциированной с клеточными оболочками микроорганизмов [3]. В лабораторных условиях дезинтеграция клеток осуществляется с использованием жидкого азота или механическим перетиранием с оксидом кремния (или оксидом алюминия). Этот этап можно проводить непосредственно в лизис буфере, содержащим нуклеазы и протеазы [4].
В данной работе использовались классические методы жидкофазного выделения НК, такие как экстракция и осаждение. При экстракции лизис клеток, с одной стороны, проходит в жестких условиях, чтобы разрушить исходный материал. С другой стороны, в довольно мягких, для того чтобы не повредить целевую нуклеиновую кислоту. После экстракции для получение чистой нуклеиновой кислоты необходимо очистить раствор от примесей. Одним из таких методов является ультрафильтрация - разделение (очистка) с помощью мембраны [5].
Осаждение (или его еще называют метод концентрирования НК) происходит за счет водоотнимающего действия этанола или
изопропанола, тем самым снижая растворимость нуклеиновых кислот, а точнее их солей [6]. Методы
В качестве объекта исследования в работе использовали хлебопекарные сухие активные
дрожжи производства «САФ-ЛЕВЮР» с содержанием основного вещества 95% Концентрацию нуклеиновых кислот определяли методом Спирина [7]. Ультрафильтрацию проводили на мембране УАМ-10, задерживающей вещества с молекулярной массой 10 кДа. Экспериментальная часть
Согласно литературным данным для выделения РНК используется метод экстракции в щелочной среде (рН 9). При проведении эксперимента смешивали 100 г дрожжей и 900 мл подщелочной воды, выдерживали при температуре 90оС в течение 2 часов. В процессе экстракции через определенные промежутки времени отбирали пробы суспензии, отработанную биомассы отделяли центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин. В супернатантах определяли содержание нуклеиновых кислот методом Спирина. По полученным данным была построена зависимость степени экстракции нуклеиновых кислот от времени, приведенная на рис. 1.
i m__
£ 90 ^ 80 70 60 50 40 30 20 10
0 0 20 40 60 80 100 120 Рисунок 1 140 ^мин.
Оптимальное время экстракции составило 2 часа. Далее при выбранном оптимальном времени экстракции была наработана партия РНК-содержащего экстракта, содержащего 6,28 г/л РНК. Данная концентрация недостаточна для последующего осаждения нуклеиновых
компонентов в изоэлектрической точке.
Поэтому на следующем этапе работы с целью повышения выхода РНК при последующем проведении стадии осаждения, а также для очистки от низкомолекулярных примесей провели ультраконцентрирование экстракта РНК. Поскольку дрожжевая РНК имеет молекулярную массу не более 12 кДа для ее концентрирования использовали мембрану УАМ-10 с отсечкой по молекулярным массам 10 кДа. Экстракт был сконцентрирован в 4 раза. Концентрация РНК в пермеате составило 8,26 г/л, а дифференциальная селективность - 43%
Из полученного концентрата (концентрация РНК - 8,26 г/л) провели осаждение нуклеиновых
компонентов в изоэлектрической точке при рН 2 и температуре 4оС. Осадок нуклеиновых компонентов отделили центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин. В супернатанте определили концентрацию нуклеиновых кислот методом Спирина, она составила - 5,5 г/л. Таким образом, степень осаждения нуклеиновых компонентов составила - 46%. Осадок нуклеиновых кислот был высушен на воздухе, после чего был проанализирован на содержание нуклеиновых кислот, которое составило 45%. Достаточно низкое содержание нуклеиновых кислот позволяет предположить, что полученный препарат нуклеиновых кислот представляет собой белково-нуклеиновый комплекс и нуждается в очистке от белковых примесей. Разработка стадий очистки препарата от белковых примесей будет предметом дальнейших исследований.
Выводы:
1) Оптимальное время экстракции составило 2 часа;
2) Низкое содержание нуклеиновых кислот связано с недостаточной очисткой препарата от примесей белка.
Список литературы
1. Basic DNA and RNA Protocols, Methods in Molecular Biology. V. 58 / Harwood A.J. (editor). New Jersey: Humana Press, Totowa, 1994. P. 3-7.
2. Klintschar M., Neuhuber F. Evaluation of an Alkaline Lysis Method for the Extraction of DNA from Whole Blood and Forensic Stains for STR Analysis // J. Forensic Sci. 2000. V. 45. P. 669673.
3. Данилевич В.Н., Гришин Е.В. Способ выделения геномной ДНК из клеток микроорганизмов. //Патент РФ. 2185440. опубл. 20.07.2002. Бюл. № 20.
4. Лактионов П.П., Тамкович С.Н., Симонов П.А., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Способ выделения ДНК микроорганизмов. //Патент РФ 2232768. опубл. 20.07.2004. Бюл. № 20.
5. М.Мулдер Введение в мембранную технологию - М.: Мир, 1999.
6. Великов В.А. Молекулярная биология. Практическое руководство: Учеб. пособие-Саратов:Издательство «Саратовский источник», 2013. С. 14-15.
7. Методическое руководство для практикума по биохимии: Учебнометодическое руководство / Н.С. Сиянова, Т.А. Невзорова, С.Н. Неуструева. - Казань: КГУ, 2008. С. 15.
