CC BY
873
ВЫДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ ИЗ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА: СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ
М.В. Егорова, С.А. Афанасьев
НИИ кардиологии СО РАМН, Томск E-mail: mwegorova@yandex.ru
ISOLATION OF MITOCHONDRIA FROM CELLS AND TISSUES OF ANIMALS AND HUMAN: MODERN METHODICAL APPROACHES
M.V. Egorova, S.A. Afanasyev
Institute of Cardiology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences
В обзоре представлены временные модификации методик, используемых для выделения и хранения митохондрий, полученных из свежей и замороженной ткани и пригодных для изучения различных митохондриальных процессов. Описано получение митохондрий как из органов и тканей лабораторных животных, так и из биопсийных образцов тканей человека и клеточных культур.
Ключевые слова: методы выделения, среда выделения, изолированные митохондрии, дыхательный контроль.
The review presents the current modification techniques used for separation and storage of mitochondria obtained from fresh and frozen tissue, and suitable for the study of various mitochondrial processes. We describe the reception of mitochondria from both organs and tissues of laboratory animals, and from biopsy samples of human tissue and cell cultures.
Key words: isolated techniques, the isolation medium, isolated mitochondria, the respiratory control.
Введение
Функциональная активность органов и тканей живого организма, согласованное протекание физиологических процессов в клетках обусловлено, в первую очередь, многочисленными процессами, протекающими в митохондриях (МХ). Изучение процессов, протекающих в митохондриях животных и человека, необходимо для понимания механизмов многих физиологических процессов и патофизиологических изменений в различных органах и тканях [9]. МХ являются главным участком энергопродукции в клетках. Мутации генов ядерного и митохондриального геномов, под контролем которых одновременно находятся белки дыхательной цепи, приводят к нарушению процесса окислительного фосфорилиро-вания и, как следствие, ухудшению энергетического метаболизма, что служит “благоприятным” фоном для возникновения различных патологических состояний [3, 11, 22, 25].
Достижения в области митохондриологии за последние почти полвека представлены в обзорах учеников и
последователей В.П. Скулачева, основателя школы биоэнергетики в нашей стране [1, 3, 5, 6, 8, 10]. Активные исследования в этой области, ведущиеся по всему миру, свидетельствуют об актуальности изучения МХ и процессов, протекающих в этих органеллах. Одной из острых проблем, например, является исследование окислительного стресса, основного компонента многих патологий, а также процесса естественного старения организма: механизмы генерации активных форм кислорода и их удаления
- одно из важнейших направлений в изучении функций МХ [1, 5, 31].
Большинство исследований МХ проведено с использованием органелл, полученных из органов (печени, мозга, сердца и др.) различных животных. В конце XX века были начаты и сейчас активно проводятся обширные исследования целого ряда патологий человека, развивающихся вследствие митохондриальных дисфункций [18,
21, 23, 25, 28, 30, 35, 40, 41]. В нашем обзоре мы поставили цель представить современные модификации наиболее востребованных технологий выделения МХ из тканей лабораторных животных, а также апробированные
методики выделения МХ из некоторых тканей человека. Особый интерес представляет также получение функционально активных МХ из замороженной ткани, что, несомненно, упрощает и расширяет возможности исследовательской работы с использованием интраоперацион-ных образцов ткани человека.
1. Основные условия и этапы выделения митохондрий из свежей ткани
Несмотря на все тонкости современных модификаций выделения МХ, имеются обязательные и неизменные условия, общие для выделения МХ из всех видов тканей [34, 36]:
1. Все этапы выделения МХ должны проводиться на льду и, при возможности, в холодной комнате при 0-2 °С, это обеспечивает инактивацию клеточных ферментов и исключение повреждения МХ. Среды выделения и оборудование должны быть хорошо охлаждены. Должны использоваться рефрижераторные центрифуги, поддерживающие температуру 0-2 °С. Нельзя допускать замораживания в процессе выделения.
2. Для выделения нормальных МХ среды выделения должны иметь известную осмотическую силу, могут быть неионными (например, 0,25 мМ сахароза, маннитол, сорбитол) или ионными (100-150 мМ КС1). Для приготовления растворов используется вода высокой чистоты (бидистиллированная, деионизованная). При низком качестве воды возможна низкая степень сопряжения окисления и фосфорилирования.
3. Поддержание величины рН среды выделения в предлагаемых методиках в разных случаях колеблется в пределах 7,0-7,8. Наиболее распространенная величина рН - 7,4; чаще всего используется буфер 5-20 мМ Тш-НО или Тп8-асе1а1е.
4. Для наилучшего результата в среды выделения добавляют хелаторы ионов кальция (например, 0,5-1 мМ ЭДТА) и бычий сывороточный альбумин (0,1-1% БСА). Кальций связывают для предотвращения его действия как разобщителя и активатора митохондриальных фосфолипаз. БСА связывает свободные жирные кислоты, лизофосфолипиды и другие детергенты.
5. Первоначально для разрушения межклеточных связей, клеточной стенки и плазматических мембран применяют механическую или ферментативную обработку ткани. Для ферментативной обработки (как правило, мышечной ткани, перед гомогенизированием) используют трипсин, коллагеназу, протеинкина-зу К и другие ферменты. Для мягкого растирания ткани ее предварительно измельчают ножницами, затем гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (гомогенизатор Поттера-Эльве-гейма). Соотношение “ткань (г) : среда (мл)” составляет обычно 1:5 или 1:10. При чрезмерно жесткой обработке возможна низкая степень сопряжения окисления и фосфорилирования.
6. Дифференциальное центрифугирование обычно включает два последовательных этапа. При первом центрифугировании на низких оборотах (около
1000 g 10 мин) происходит отделение неразрушенных клеток, обломков клеток, ядер (возможно повторное гомогенизирование и осаждение полученного осадка). Для второго этапа используют супернатант, который центрифугируют при высоких оборотах (10000 g 10 мин), получая уже осадок, содержащий МХ (его при необходимости отмывают в среде выделения и осаждают вторично). В некоторых случаях взвесь митохондрий дополнительно очищают от ли-зосом, пероксисом, меланосом и т.п., центрифугируя в градиенте фиколла, сахарозы, метризамида.
7. Осадок МХ суспендируют в минимальном количестве неионной (для предотвращения потери периферических белков) среды выделения. Концентрацию митохондриального белка определяют биуретовым методом, либо методом Лоури в зависимости от количества полученных МХ. При хранении МХ концентрация белка должна составлять не менее 40 мг на мл среды хранения. В дальнейшем при описании методик (если не оговорено особо) фраза “полученные МХ хранят в среде...” означает сохранение МХ в пробирке, погруженной в лед (не допускать замораживания!), в течение всего эксперимента (эксперимент проводить желательно сразу же после выделения МХ). Состояние полученных МХ оценивают по скорости поглощения кислорода митохондриями на фоне НАДН-зависимых субстратов и сукцината в присутствии и отсутствии АДФ. Дыхательный контроль в хорошо сопряженных митохондриях составляет не менее 4-5. Скорость поглощения кислорода обычно рассчитывают в мкг-ат кислорода в мин на мг митохондриального белка.
2. Выделение митохондрий из ткани, замороженной в жидком азоте
Важным и обязательным условием выделения МХ является использование свежей ткани: в этом случае митохондрии по своим характеристикам не отличаются от интактных [29, 36]. Однако часто у исследователей возникает необходимость использовать замороженную ткань, особенно в случаях накопления послеоперационного материала при исследовании МХ человека. Митохондриальные мембраны являются весьма чувствительными к температурным вариациям, а повреждение мембран, как клеточных, так и митохондриальных, делает невозможным эффективное разделение субклеточных фракций, а также изменяет их биохимические параметры. Предупредить подобные нарушения можно при использовании специальной заморозки [36].
После удаления органы животных взвешивают и добавляют в соотношении 1:1 среду хранения (0,21 М ман-нитол, 0,07 М сахароза, 20-процентный диметилсульфок-сид - ДМСО, рН 7,5). ДМСО используется как антифриз, он менее агрессивен, чем глицерол и быстро проникает в ткани. Необходимо предотвратить появление кристаллов льда, поэтому замораживание и оттаивание ткани должны производиться так быстро, насколько это возможно. Перед быстрой заморозкой в жидком азоте помещенные в среду хранения органы и кусочки ткани могут быть измельчены и гомогенизированы, однако жела-
тельно сохранить их целыми. Показано, что в органах, сохраненных интактными в жидком азоте, не наблюдается значительных изменений митохондриальных функций [29, 36]. Однако нужно иметь в виду, что только в нежных органах, таких как печень, среда хранения быстро диффундирует в ткани органа. Органы (такие как почки, сердце), содержащие фиброзные ткани, а также скелетные мышцы для облегчения проникновения в них среды рекомендуется разрезать на кусочки около 1 см3. Подготовленные таким образом образцы быстро замораживают и хранят в жидком азоте до выделения МХ.
Перед выделением МХ целые органы и кусочки ткани оттаивают: процедура оттаивания должна быть максимально быстрой. Среду для оттаивания (0,25 М сахароза,
0,01 М Тш-НСІ, рН 7,4) необходимо предварительно нагреть до 45 °С перед добавлением замороженной ткани (в соотношении ткань:среда = 1:4). Для печени в среду добавляют 0,4% БСА. После оттаивания процедура выделения МХ для каждого вида ткани проводится также, как и при выделении из свежеполученных органов. В некоторых случаях ткань, не размораживая, измельчают до порошкообразного состояния и, смешав со средой выделения, гомогенизируют [29].
3. Выделение митохондрий печени
Наиболее популярным объектом исследований являются МХ ткани печени крыс как наиболее доступные и легкие для получения их в больших количествах, для изучения фармакологического эффекта различных лекарственных препаратов и воздействия пищевых добавок. Ниже приводятся два способа выделения МХ: 1) основной, относительно простой и широко распространенный способ для получения большого количества МХ из ткани печени [13, 24, 34] и 2) способ выделения МХ из предварительно изолированных гепатоцитов [12, 43].
3.1. Выделение митохондрий из свежих образцов ткани печени
Свежую печень охлаждают на льду и отмывают в среде выделения (0,22 М маннитол, 0,07 М сахароза, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ Тш-НСІ, 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,2). Ткань измельчают ножницами и трижды отмывают от крови и сопутствующей ткани в среде выделения, содержащей 0.4% бСа Ткань взвешивают в охлажденной чашке Петри, гомогенизируют в охлажденном стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком, затем фильтруют. Гомогенат центрифугируют 1,5 мин при 3000 g, супернатант отбирают и сохраняют, а осадок вновь ресуспендируют в среде выделения и снова центрифугируют 1,5 мин при 3000 g. Оба супернатанта объединяют и центрифугируют 2,5 мин при 17500 g•, осадок ресуспендируют в среде выделения и центрифугируют 4,5 мин при 17500 g. Осадок ресуспендируют в среде, содержащей 0,22 М маннитол, 0,07 М сахарозу, 1 мМ ЭДТА, 0,01 М Тш-НСІ (рН 7,2), и центрифугируют 4,5 мин при 17500 g. Полученный осадок МХ суспендируют в этой же среде в соотношении 10 мл среды на 7 г исходной ткани. Полученные этим способом МХ содержат лизосомальную фракцию, однако при немедленном использовании имеют хороший дыхательный контроль.
3.2. Выделение митохондрий из гепатоцитов крысы
Изолированные гепатоциты (30 млн клеток) суспендируют в среде выделения (0,25 М сахароза, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ ШН2Р04, 2 мМ MgC12, 0,4% БСА, 0,01 М Тпсте, рН 8,0), выдерживают при -80 °С в течение 10 мин для разрушения плазматической мембраны и центрифугируют 5 мин при 760 g. Супернатант отбирают, а осадок разводят средой, гомогенизируют и снова центрифугируют 5 мин при 760 g. Оба супернатанта объединяют и центрифугируют 20 мин при 8000 g. Осадок ресуспендируют в среде выделения без БСА, центрифугируют 20 мин при 8000 g, супернатант отбрасывают, а осадок МХ снова ре-суспендируют и хранят в этой же среде. Митохондрии, полученные этим способом, имеют хорошую дыхательную активность.
4. Выделение митохондрий сердца
МХ, полученные из сердечной мышцы, имеют некоторые преимущества перед МХ других тканей: они остаются стабильными, сохраняя способность к окислению и фосфорилированию в течение недели при температуре хранения -4 °С и до года - при температуре -20 °С [36]. Функционально целые МХ получают из свежезабран-ного материала. Ниже представлены методики получения МХ из сердечной мышцы лабораторных животных [2, 13,
22, 26, 34] при механической обработке ткани, а также приведен пример получения МХ сердца с применением трипсина [4].
4.1. Митохондрии из сердца кролика и крысы
Для работы используют только что изолированное, неповрежденное сердце, которое немедленно помещают в ледяной раствор 0,9% КС1 (около 50 мл) и тщательно отмывают от крови. Отмытое сердце очищают от жира, соединительной ткани, вырезают сосуды, из внутренних полостей удаляют сгустки крови и еще раз отмывают ткань. Мышцу взвешивают и измельчают ножницами до почти гомогенного состояния в чашке Петри, стоящей на льду. Измельченную мышцу переносят в охлажденный гомогенизатор и добавляют (из расчета 10 мл среды на 1 г ткани) сахарозную среду выделения (0,3 М сахароза, 10 мМ ЭДТА, рН 7,5). Ткань в течение одной минуты гомогенизируют до получения однородной массы; гомогенат центрифугируют 10 мин при 600 g. Супернатант аккуратно отбирают и центрифугируют 15 мин при 11000 g. Плотный осадок МХ ресуспендируют в 2 мл сахарозной среды до гомогенного состояния, приливают до 40 мл сахарозной среды и вновь осаждают. Полученный осадок МХ ресуспендируют в 1,5-2 мл среды выделения (концентрация белка 40-60 мг/мл) и хранят на льду.
4-2. Выделение митохондрий из сердца кролика с применением трипсина
Измельченную ткань сердца кролика промывают ледяным 0,9%-ным раствором КС1; на каждый грамм ткани добавляют по 2,5 мл среды выделения (0,18 М КС1, 0,5 мМ ЭДТА, 10 мМ Тг18-НС1, рН 7,7) и 0,33 мг трипсина; инкубируют при 0-2 °С в течение 5 мин. После кратковременной гомогенизации (2 пасса пестика вниз-вверх в течение 10 с) гомогенат инкубируют еще 10 мин. Затем на
каждый грамм исходной ткани добавляют по 7,5 мл среды выделения, содержащей 1,66 мг соевого ингибитора трипсина. Снова быстро гомогенизируют (2 пасса пестика вниз-вверх в течение 10 с) и центрифугируют 5 мин при 600 g. Супернатант центрифугируют при 5500 g в течение 10 мин; с поверхности полученного осадка смывают средой выделения верхний рыхлый слой, а осадок ресуспендируют в среде, содержащей 0,18 М КС1, 20 мМ Тпб-НО, рН 7,35, при 0-2 °С. Дыхательный контроль полученных данным способом МХ составляет от 6 до 12.
5. Выделение митохондрий скелетной мускулатуры
В данном разделе представлены методики выделения МХ из скелетных мышц крысы [13, 34] и человека [30, 38, 45]. Выделение МХ скелетных мышц - довольно трудоемкий процесс, но он оправдан в случае изучения процессов при заболеваниях, связанных с нарушением метаболизма МХ (например, митохондриальных энцефало-миопатиях). Немаловажным является и тот факт, что мышцы, являясь постмитотической тканью, аккумулируют эндо- и экзогенные повреждения в течение всей жизни организма, что делает эту ткань ценной в отношении изучения биоэнергетических процессов. Поскольку для получения МХ из скелетной мускулатуры человека используют биопсийный материал, полученный после хирургического вмешательства, то предлагаются методики для разного количества имеющегося материала - от 25 мкг до 5 мг.
5.1. Выделение митохондрий из скелетных мышц крысы
МХ скелетной мускулатуры желательно выделять в ионной среде (0,1М КС1, 1 мМ MgC12, 0,05 М Тг1б-НС1, рН 7,4), так как в неионных растворах мышцы желатинируются и плохо разрушаются. У только что декапитирован-ной крысы быстро вырезают мышцы задних конечностей и помещают их в ледяную среду. Охлажденные мышцы освобождают от жира и сухожилий. Очищенные кусочки отмывают в ледяной среде выделения, взвешивают и измельчают ножницами или в мясорубке Латапи (б отверстия = 1,0-1,5 мм), добавляют среду выделения в таком количестве, чтобы ее объем превышал объем ткани в
4 раза. Смесь гомогенизируют в течение одной минуты, гомогенат центрифугируют 10 мин при 600 g. Осадок, содержащий обломки клеток, ядра и миофибриллы, отбрасывают; надосадочную жидкость центрифугируют 5 мин при 2000 g для более полного удаления миофибрилл. Полученный супернатант фильтруют через 4 слоя марли и центрифугируют 10 мин при 9000 g. К осадку МХ добавляют (из расчета 0,05 мл на 2 г исходной ткани) среду выделения, содержащую 0,1% БСА, осторожно ресуспен-дируют и хранят на льду.
5.2. Выделение митохондрий из скелетных мышц человека
а) Механический способ. Мышечную массу (около 1 г)
гомогенизируют в среде, содержащей 0,22 М манни-
тол, 0,07 М сахарозу, 1 мМ ЭДТА, 0,4% БСА, 2 мМ Тиб,
20 мМ НЕРБ8, рН 7,2 [45]. Гомогенат центрифугируют
80 с при 600 g. Супернатант отбирают и сохраняют, осадок вновь гомогенизируют и осаждают. Оба супернатанта объединяют и центрифугируют 2,5 мин при 17000 g. Полученный осадок еще два раза отмывают и осаждают; ресуспендируют и хранят в той же среде.
б) Ферментативная обработка. Этот метод выделения МХ предполагает их выделение из очень малого количества (25-100 мг) мышечной ткани [38, 45]. В этом случае мышечную ткань взвешивают и инкубируют 2 мин в 500 мкл среды выделения (0,1 М КС1, 5 мМ MgSO4, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ АТФ, 0,5% БСА, 50 мМ Тш-НСІ, рН 7,4) с добавлением протеиназы К (2 мг/мл). Через две минуты к среде инкубации добавляют еще 3 мл среды выделения, разбавляя таким образом фермент, и этот раствор аккуратно сливают. К обработанной мышечной ткани доливают свежую среду выделения и гомогенизируют. Гомогенат центрифугируют 5 мин при 300 g, осадок отбрасывают, супернатант центрифугируют 10 мин при 4500 g. Осадок отмывают в среде выделения, не содержащей АТФ, и центрифугируют при 7000 g в течение 10 мин. Полученный осадок МХ ресуспендируют в среде хранения (225 мМ маннитол, 75 мМ сахароза). Выход составляет 40-50%; МХ, полученные данным способом, являются хорошо сопряженными и имеют высокие скорости фосфори-лирующего дыхания.
6. Выделение митохондрий головного мозга
Многие нейродегенеративные заболевания человека связаны с митохондриальными дисфункциями и характеризуются, в частности, снижением активности ключевых митохондриальных ферментов энергетического метаболизма в мозге, накоплением ионов кальция и снижением синтеза АТФ [16, 21, 40, 41]. В данном разделе представлен процесс выделения как общей фракции МХ мозга, так и разделение ее на свободные и синаптосомаль-ные МХ [14, 15, 27, 29, 35].
После декапитации животного (или в процессе хирургического вмешательства) требуемую область мозга быстро иссекают (не более 20 с) и помещают в среду выделения (0,32 М сахароза, 1 мМ ЭДТА, 0,01 М Тш-НСІ, рН 7,4). Ткань гомогенизируют (при 800 об./мин проводят 5 пассов пестика вверх-вниз) и центрифугируют, постепенно увеличивая скорость до 1000 g в течение 4 мин, и при 1000 g - еще 11 с. Осадок вновь ресуспендируют, гомогенизируют и осаждают; процедуру повторяют еще раз (супернатанты сохраняют). После последнего центрифугирования супернатанты объединяют и снова центрифугируют 20 мин при 15000 g для получения “грубого” осадка МХ, содержащего синаптосомы.
Для отделения синаптосом осадок ресуспендируют в среде выделения и наслаивают на двуступенчатый градиент фиколла: 12% ^^) РісоІІ, 0,32 М сахароза, 50 мкМ ЭДТА, 0,01 М ТгіБ-НСІ, рН 7,4, и 7,5% БісоІІ, 0,32 М сахароза, 50 мкМ ЭДТА, 0,01 М ТгіБ-НСІ, рН 7,4; центрифугируют при 73000 g в течение 24 мин. Верхняя полоса - миелин, интерфаза между 7,5 и 12,5% фиколлом - синаптосомы, а осадок содержит свободные МХ.
Миелин удаляют, а фракцию синаптосом отбирают,
разводят средой выделения и центрифугируют при 15000 g в течение 20 мин. Полученный осадок ресуспендируют в 6 мМ Тп8-НС1, рН 8,1, гомогенизируют и центрифугируют 30 мин при 14000 g. Осадок разводят в среде с фиколлом (3% Исо11, 0,12 М маннитол, 30 мМ сахаро-
за, 25 мкМ ЭДТА, 5 мМ Тш-НС1, рН 7,4) и наслаивают на двухфазный градиент фиколла (6 и 4,5% Б1со11, 0,12 М маннитол, 60 мМ сахароза, 50 мкМ ЭДТА, 10 мМ Тш-НС1, рН 7,4). После центрифугирования при 10000 g в течение 30 мин осадок содержит фракцию тяжелых МХ. Среднюю фазу отбирают, разводят в среде выделения и центрифугируют 30 мин при 15000 g, получая осадок, содержащий легкие МХ.
Осадки, содержащие свободные и синаптосомальные (тяжелые и легкие) МХ, разводят в минимальном объеме среды хранения (0,22 М маннитол, 0,07 М сахароза, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ Тш-НС1, рН 7,2). Для длительного хранения МХ замораживают при -80 °С.
7. Выделение митохондрий из человеческой крови
Методики выделения МХ из человеческой крови [19, 25, 33] имеют существенный недостаток - требуется довольно большое количество венозной крови, а выход МХ невелик относительно объема исходного материала, однако этот недостаток искупается возможностью исследовать различные биохимические параметры у человека как в норме, так и при различных патологиях вне зависимости от хирургического вмешательства.
Берут 60-100 мл венозной крови [19, 25], смешивают с 25 мл среды, содержащей 5% декстран 250000, 0,12 М ШС1, 10 мМ ЭДТА, рН 7,4; и осаждают эритроциты в течение 45 мин при 4 °С. Верхнюю фазу собирают и центрифугируют 10 мин при 5000 g. Осадок суспендируют в гипотонической среде (10 мМ Тш-НС1, рН 7,6) в течение 7 мин; осмотический шок останавливают добавлением 0,25 М сахарозы. Суспензию центрифугируют 10 мин при 600 g, супернатант сохраняют, а осадок подвергают вторично осмотическому шоку и снова центрифугируют. Супернатанты объединяют и центрифугируют 20 мин при 12000 g для осаждения МХ. Осадок МХ суспендируют в среде, содержащей 0,25 М сахарозу, 2 мМ ЭДТА, рН 7,4.
8. Выделение митохондрий из культуры человеческих клеток
Культивируемые человеческие клетки представляют собой удобную экспериментальную модель для изучения различных биохимических параметров, физиологии и патофизиологии при различных нарушениях. Клетки легко культивировать и получать в больших количествах; митохондрии обычно используют для биохимического и генетического анализа [32, 36, 44].
Клетки, например, НеЬа-клетки [17, 20], отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 600 g в течение 10 мин, отмывают фосфатным буфером и ресуспендируют в 5 объемах среды выделения (0,25 М сахароза, 10 мМ КС1, 1,5 мМ MgC12, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ дитиотрейтол, 0,1 мМ фенилметилсульфанилфлю-
орид, 20 мМ HEPES-KOH, рН 7,5). Суспензию клеток гомогенизируют в стеклянном или стеклянно-тефлоновом гомогенизаторе (20 раз перемещение пестика вниз-вверх). Гомогенат центрифугируют 10 мин при 750 g, супернатант сохраняют, а осадок ресуспендируют в среде выделения и вновь центрифугируют при тех же условиях. Объединяют первый и второй супернатанты и центрифугируют 15 мин при 10000 g. “Грубый” осадок МХ ресуспендируют и хранят в среде выделения. По другой методике, гомогенат клеток центрифугируют 4 мин при 400 g и получают грубый митохондриальный осадок центрифугированием супернатанта при 27000 g в течение 10 мин.
Выделение очищенной фракции митохондрий.. Можно получить очищенную митохондриальную фракцию разделением в градиенте сахарозы [32, 42, 44]:
a. Процедура “two-step”: отмытые клетки ресуспендируют в среде, содержащей 10 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ Tris-HCl, рН 7,5. Клетки набухают в этой среде (4-5 мин, на льду), затем суспензию быстро гомогенизируют; доводят концентрацию глюкозы до 250 мМ (добавлением к гомогенату 2 М сахарозы в ТЭ-буфе-ре, содержащем 1 мМ ЭДТА и 10 мМ Tris-HCl, рН 7,6). Гомогенат центрифугируют 3 мин при 1300 g; супернатант снова центрифугируют при тех же условиях. Затем полученный супернатант центрифугируют 15 мин при 15000 g; осадок МХ трижды отмывают в 250 мМ сахарозе в ТЭ-буфере и ресуспендируют его в этой же среде. Суспензию МХ наслаивают на градиент сахарозы (1 и 1,7 М) в ТЭ-буфере и центрифугируют 40 мин при 70000 g. Интерфазу, содержащую митохондрии, разводят в эквивалентном объеме 250 мМ сахарозы в ТЭ-буфере и дважды отмывают в этой же среде. Конечный осадок МХ также ресуспендируют и хранят в этой же среде.
b. Процедура “one-step”: отмывают и ресуспендируют клетки по методике, описанной в предыдущей процедуре, однако набухание клеток останавливают добавлением 2 М сахарозы до гомогенизации. Гомогенат центрифугируют 3 мин при 1300 g; супернатант наслаивают на тройной объем 1,7 М сахарозы в ТЭ-бу-фере и центрифугируют 40 мин при 70000 g. Далее обработка идет так, как описано выше.
c. Процедура “no gradient”: клетки отмывают, гомогенизируют и центрифугируют, как описано в процедуре “one-step”. Супернатант центрифугируют 20 мин при 20000 g и дважды отмывают в среде, содержащей 0,21 М маннитол, 0,07 М сахарозу, 5 мМ ЭДТА и 5 мМ Tris-HCl, рН 7,5.
9. Выделение митохондрий из ткани коркового слоя надпочечников, тимуса и бурого жира
В этом разделе представлены методики выделения МХ коркового слоя надпочечников [37], тимуса [7] и бурого жира [39] в качестве примера решения более узких задач, связанных со специфическими функциями различных тканей. Так, например, МХ коры надпочечников содержат три монооксигеназные системы, вовлеченные в кор-
тикостероидогенез, и имеют 2 электронтранспортные системы, независящие друг от друга, а МХ бурого жира имеют в составе мембраны белок термогенин, работающий как регулируемый протонный переносчик.
9.1. Выделение митохондрий коры надпочечников
Надпочечники, например, свиньи [37], очищают от
соединительной и жировой ткани и удаляют мозговой слой. Ткань надпочечников измельчают ножницами и суспендируют в среде выделения (0,33 М сахароза, 2 мМ ЭДТА, 0,2% БСА, 20 мМ Tris-HCl, рН 7,4). Суспензию гомогенизируют сначала в рыхлом (слабопритертом) стеклянном гомогенизаторе, потом в плотном стекло-тефлоно-вом гомогенизаторе. Гомогенат центрифугируют 8 мин при 600 g, затем супернатант - 8 мин при 2000 g. Полученный осадок МХ ресуспендируют в среде без БСА (0,33 М сахароза, 0,5 мМ ЭДТА, 20 мМ Tris-HCl, рН 7,4) и отмывают три раза. Конечный осадок ресуспендируют и хранят в этой же среде (концентрация белка 50-60 мг/мл). Полученные митохондрии являются сопряженными, однако имеют не очень высокий АДФ/О.
9.2. Выделение митохондрий из лимфоцитов тимуса
Тимусы крыс помещают в ледяную среду выделения RPMI 1640 с глутамином. Каждый тимус последовательно очищают от нелимфоидной ткани на охлажденном тефлоновом бруске, разрезают бритвой на 3-4 части и мягко выдавливают лимфоциты тефлоновой палочкой. Добавив к клеткам 1-2 мл среды выделения, суспензию фильтруют через двойной слой марли, центрифугируют
5 мин при 800 g. Осадок суспендируют тефлоновой палочкой, приливают 4 мл Н2О, тщательно перемешивают
5-10 с; добавляют 0,5 мл среды Хенкса (10х), и суспензию фильтруют через двойной слой марли. После центрифугирования (5 мин при 800 g) осадок суспендируют в 5 мл среды, содержащей 70 мМ NaCl, 140 мМ сахарозу, 5,6 мМ KCl, 10 мМ пирувата, 8 мМ Mops, рН 7,4. Суспензию клеток разбавляют 5 мл среды, содержащей 5,6 мМ KCl, 1 мМ ЭГТА, 1% БСА, 10 мМ пируват, 8 мМ Mops, рН 7,4, и инкубируют 2 мин; добавляют 40 мл среды для выделения МХ (350 мМ сахароза, 1 мМ ЭГТА, 1% БСА, 5 мМ Mops, рН 7,4) и гомогенизируют в тефлоновом гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 g; супернатант центрифугируют 10 мин при 12000 g; полученный осадок МХ ресуспендируют в минимальном объеме среды для выделения МХ и хранят на льду. Дыхательный контроль полученных МХ - не менее 4.
9.3. Выделение митохондрий бурого жира
Бурый жир (например, хладоадаптированных животных или новорожденных) быстро вырезают, помещают в ледяную среду выделения (0,25 М сахароза, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Tris-HCl, рН 7,4) и тщательно очищают от посторонней ткани. Ткань гомогенизируют и центрифугируют 10 мин при 14000 g. Супернатант и поверхностный слой липидов удаляют; осадок ресуспендируют в среде выделения и центрифугируют при 8500 g в течение 10 мин; полученный осадок МХ ресуспендируют и хранят в среде выделения.
Заключение
Понимая острый интерес к исследованиям патологий человеческого организма, хотелось бы подчеркнуть, что, несмотря на все отличия, многие методики, представленные в обзоре, а также оставшиеся вне нашего рассмотрения, являются, по сути, схожими. При необходимости любые методики получения МХ животных можно адаптировать и к работе с соответствующими тканями человека. При этом следует признать, что совершенное владение технологическими приемами сделает этот процесс более быстрым и эффективным.
Литература
1. Андреев А.Ю., Кушнарева Ю.Е., Старков А.А. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях // Биохимия. -2005. - Т. 70. - С. 246-264.
2. Баласявичус Р.В., Толейкис А.И., Прашкявичус А.К. и др. Оценка структурно функциональной гетерогенности изолированных митохондрий нормального и ишемического миокарда // Биохимия. - 1985. - Т. 50. - С. 1685-1693.
3. Бра М., Квинан Б., Сузин С.А. Митохондрии в программированной гибели клетки: различные виды гибели // Биохимия. - 2005. - Т. 70. - С. 284-293.
4. Джея П.П., Кальвенас А.А., Толейкис А.И. и др. О функциональном сопряжении креатинфосфокиназы и аденилатки-назы с адениннуклеотидтранслоказой и его роли в регуляции дыхания митохондрий сердца // Биохимия. - 1983. -Т. 48. - С. 1471-1477.
5. Зоров Д.Б., Банникова С.Ю., Белоусов В.В. и др. Друзья или враги. Активные формы кислорода и азота // Биохимия. -2005. - Т. 70. - С. 265-272.
6. Мохова Е.Н., Хайлова Л.С. Участие анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в разобщающем действии жирных кислот // Биохимия. - 2005. - Т. 70. - С. 197202.
7. Паламарчук Л.А., Мансурова С.Э., Старков А.А. Тироксин обратимо ингибирует разобщающее действие протонофо-ров на энергетическое сопряжение в клетках лимфоцитов тимуса крыс // Биохимия. - 2002. - Т. 67. - С. 561-566.
8. Сарис Н.-Е.Л., Карафоли Э. Роль митохондрий в перераспределении внутриклеточного кальция: исторический обзор // Биохимия. - 2005. - Т. 70. - С. 231-239.
9. Таминова И.Ф., Гарганеева Н.П., Ворожцова И.Н. Оценка аэробного энергообразования и уровня физической работоспособности по результатам велоэргометрии у высококвалифицированных спортсменов с разной направленностью тренировочного процесса // Сибирский медицинский журнал (Томск). - 2008. - № 2. - С. 66-69.
10. Черняк Б.В., Плетюшкина О.Ю., Изюмов Д.С. и др. Биоэнергетика и смерть // Биохимия. - 2005. - Т. 70. - С. 294-301.
11. Baracca A., Barogi S., Carelli V. et al. Catalytic activities of the mitochondrial ATP synthase in patients with the mtDNA T8993G mutation in the ATPase 6 gene encoding for the a subunit // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275. - P. 4177-4182.
12. Barogi S., Baracca S., Cavazzoni M. et al. Effect of oxidative stress induced by adriamycin on rat hepatocyte bioenergetics during ageing // Mech. Aging Dev. - 2000. - Vol. 113. - P- 1-21.
13. Barogi S., Baracca A., Parenti Castelli G. et al. Lack of major changes in mitochondria from liver, heart, and skeletal muscle of rats upon ageing // Mech. Ageing Dev. - 1995. - Vol. 84. -P. 139-150.
14. Battino M., Bertoli E., Formiggini G. et al. Structural and functional aspects of the respiratory chain of synaptic and nonsynaptic mitochondria derived from selected brain regions
// J. Bioenerg. Biomembr. - 1991. - Vol. 23. - P. 345-363.
15. Battino M., Gorini A., Villa R.F. et al. Coenzyme Q content in synaptic and non-synaptic mitochondria from different brain regions in the ageing rat // Mech. Ageing Dev. - 1995. - Vol. 78.
- P. 173-187.
16. Beal M.F. Mitochondria, NO, and neurodegeneration // Biochem. Soc. Symp. - 1999. - Vol. 99. - P. 43-54.
17. Bestwick R.K., Moffett G.L., Mathews C.K. Selective expansion of mitochondrial nucleoside triphosphate pools in antimetabolite-treated HeLa cells // J. Biol. Chem. - 1982. -Vol. 257. - P. 9300-9304.
18. Bindoff L. Mitochondria and the heart // Eur. Heart J. - 2003. -Vol. 24. - P. 221-224.
19. Blass J.P., Cederbaum S.D., Kark RAP. Rapid diagnosis of pyruvate and ketoglutarate dehydrogenase deficiencies in platelet-enriched preparations from blood // Clin. Chim. Acta. - 1977.
- Vol. 75. - P. 21-30.
20. Bogenhagen D., Clayton D.A. The number of mitochondrial deoxyribonucleic acid genomes in mouse L and human HeLa cells: Quantitative isolation of mitochondrial deoxyribonucleic acid // J. Biol.Chem. - 1974. - Vol. 249. - P. 7991-7995.
21. Browne S.E., Beal M.F. The energetics of Huntington’s disease // Neurochem. Res. - 2004. - Vol. 29. - P. 531-546.
22. Capaldi R. A. Arrangement of proteins in the mitochondrial inner membrane // Biochem. Biophys. Acta. - 1982. - Vol. 694. -P. 291-306.
23. Biochemical features of mtDNA 14484 (ND6/M64V) point mutation associated with Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) / V. Carelli, A. Ghelli, L. Bucchi et al. // Ann. Neurol. -1999. - Vol. 45. - P. 320-328.
24. Cooper A.J.L., Krasnikov B., Okuno E. et al. L-alanine-glyoxylate aminotransferase II of rat kidney and liver mitochondria possesses cysteine S-conjugate p-lyase activity - A contributing factor to the nephrotoxicity/hepatotoxicity of halogenated alkenes // Biochem. J. - 2003. - Vol. 376. - P. 169-178.
25. Degli Esposti M., Carelli V., Ghelli A. et al. Functional alterations of the mitochondrially encoded ND4 subunit associated with Leber’s hereditary optic neuropathy // FEBS Lett. - 1994. -Vol. 352. - P. 375-379.
26. Fato R., Estornell E., Bernardo Di S. et al. Steady-state kinetics of the reduction of coenzyme Q analogs by complex I (NADH:ubiquinone oxidoreductase) in bovine heart mitochondria and submitochondrial particles // Biochemistry.
- 1996. - Vol. 35. - P. 2705-2716.
27. Genova M.L., Bovina C., Marchetti M. et al. Decrease of rotenone inhibition is a sensitive parameter of complexI damage in brain non-synaptic mitochondria of aged rats // FEBS Lett. - 1997. -Vol. 410. - P. 67-69.
28. Holmgren D., Wahlander H., Eriksson B.O. et al. Cardiomyopathy in children with mitochondrial disease - clinical course and cardiological findings // Eur.Heart J. - 2003. - Vol. 24. - P. 280288.
29. Krasnikov B.F., Kim S.-Y., McConoughey S.J. et al. Transglutaminase activity is present in highly purified nonsinaptosomal mouse brain and liver mitochondria // Biochemistry. - 2005. - Vol. 44. - P. 7830-7843.
30. Lee C.P., Martens M.E, Tsang S.H. Small scale preparation of skeletal muscle mitochondria and its application in the study of human disease // Meth. Toxicol. - 1993. - Vol. 2. - P. 70-83.
31. Mitochondria, oxidative stress, and antioxidant defences / G. Lenaz, C. Bovina, G. Formiggini et al. // Acta Biochim. Polon.
- 1999. - Vol. 46. - P. 1-21.
32. Magalhaes P.J., Andreu A.L., Schon E.A. Evidence for the presence of 5S rRNA in mammalian mitochondria // Mol. Biol. Cell. -1998. - Vol. 9. - P. 2375-2382.
33. Merlo Pich M., Bovina C., Formiggini G. et al. Inhibitor sensitivity of respiratory complex I in human platelets: A possible biomarker of ageing // FEBS Lett. -1996. - Vol. 380. - P. 176178.
34. Nedergaard J., Cannon B. Overview : Preparation and properties of mitochondria from different sources // Meth. Enzym. - 1979.
- Vol. 55. - P. 3-28.
35. Pallotti F., Genova M.L., Merlo Pich M. et al. Mitochondrial dysfunction and brain disorders // Arch. Gerontol. Geriatr. -1998. - Vol. 6. - P. 385-392.
36. Pallotti F., Lenaz G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines // Meth. Cell Biol. - 2001. - Vol. 65. - P. 1-35.
37. Popinigis J., Antosiewicz J., Mazzanti L. et al. Direct oxidation of glutamate by mitochondria from porcine adrenal cortex // Biochem. Int. - 1998. - Vol. 21. - P. 441-451.
38. Rasmussen H.N., Andersen A.J., Rasmussen U.F. Optimization of preparation of mitochondria from 25-100 mg skeletal muscle // Anal. Biochem. - 1997. - Vol. 252. - P. 153-159.
39. Rauchova H., Fato R., Drahota Z. et al. Steady-state kinetics of reduction of coenzyme Q analogs by glycerol-3-phospate dehydrogenase in brown adipose tissue mitochondria // Arch. Biochem. Biophys. - 1997. - Vol. 344. - P. 235-241.
40. Rego A.C., Oliveria C.R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases // Neurochem. Res. - 2004. - Vol. 28. - P. 1563-1574.
41. Schapira A.H. Mitochondrial involvement in Parkinson’s disease. Huntington’s disease, hereditary spastic paraplegia and Friedrich’s ataxia // Biochim. Biophys. Acta. - 1999. - Vol. 1410.
- P. 99-102.
42. Tapper D.P., Van Etten R.A., Clayton D.A. Isolation of mammalian mitochondrial DNA and RNA and cloning of the mitochondrial genome // Meth. Enzymology. - 1983. - Vol. 97. - P. 426-434.
43. Wells W.W., Seyfred M.A., Smith CD. et al. Measurement of subcellular sites of polyphosphoinositide metabolism in isolated rat hepatocytes // Meth. Enzymology. - 1987. - Vol. 141. - P. 92-99.
44. Yang J., Liu X., Bhalla K. et al. Prevention of apoptosis by Bcl-2: Release of cytochrome с from mitochondria blocked // Science.
- 1997. - Vol. 275. - P. 1129-1132.
45. Zucchini C., Pugnaloni A., Pallotti F. et al. Human skeletal muscle mitochondria in aging: lack of detectable morphological and enzymic defects // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1995. - Vol. 37. -P. 607-616.
Поступила 22.04.2010
