CC BY
1УДК [502/504:579]:628.3
В.Ю. Жиленко, Д.О. Половнева, Ю.Е. Токач, Ю.К. Рубанов
Белгородский государственный технологический университет им. В.Г. Шухова,
Белгород, 308012 e-mail: Vilena33@mail.ru
ВЫДЕЛЕНИЕ МАГНИТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОЧНЫХ ВОД
В данной научной статье приводятся исследования по выделению из биопрепарата DOR-UNI штаммов микроорганизмов с магниточувствительными свойствами, в результате образования магнитосом, они иммобилизованы в носитель, являющийся комплексным адсорбентом, который состоит из электросталеплавильного шлака и железорудного концентрата, с развитой поверхностью и удельным весом, обеспечивающего его погружение в водную среду к донным отложениям.
Ключевые слова: антропогенные воздействия, очистка сточных вод, загрязнение поверхностных вод, магнитоуправляемые микроорганизмы.
V.Yu. Zhilenko, D.O. Polovneva, Yu.E. Tokach, Yu.K. Rubanov
Belgorod State Technological University named after V.G. Shukhova, Belgorod, 308012 e-mail: Vilena33@mail.ru
ISOLATION OF MAGNET-SENSITIVE MICROORGANISMS FOR BIOLOGICAL TREATMENT OF INDUSTRIAL WASTEWATER
This scientific article presents studies on the isolation of strains of microorganisms with magnetically sensitive properties from the biological preparation DOR-UNI, as a result of the formation of magnetosomes, they are immobilized in a carrier, which is a complex adsorbent, which consists of electric furnace slag and iron ore concentrate, with a developed surface and specific gravity, providing its immersion in the aquatic environment to the bottom sediments.
Key words: anthropogenic impacts, wastewater treatment, surface water pollution, magnetically controlled microorganisms.
Термин «магнитотактические бактерии» объединяет палочек, спирилл, вибрионов и других микроорганизмов. Внутри бактерии заключены крошечные частицы магнетита, размер каждой из них составляет всего 50 нм с каждой стороны. У разных бактерий это могут быть либо гранулы магнетита (Fe3O4), либо же гранулы грейгита (Fe3S4), окружены липопротеиновой мембраной. Ор-ганеллы, где синтезируются кристаллы, носят название магнитосомы. Внутри бактерий они могут быть объединены в цепочки, а в клетках магнитотактических бактерий их число может насчитывать несколько десятков или даже сотен (у одной из бактерий, Candidatus Magnetobacter bavaricum, обнаружено свыше тысячи магнетосом). Кристаллы магнетита и грейгита выстраиваются в клетках бактерий вдоль цепочки, ориентируясь параллельно магнитными дипольными моментами.
В настоящее время спектр бактерий, окисляющих железо, расширяется благодаря активным исследованиям в этой области. Однако поиск наиболее перспективных бактерий на сегодняшний день остается актуальным.
Известны различные способы иммобилизации микроорганизмов на носители [1], однако оптимальными методами с точки зрения сохранения интактности и жизнеспособности клеток является физическая адсорбция (адгезия) на поверхности пористых инертных материалов [2].
Очевидно, что твердые носители - адсорбенты, прежде всего, должны обладать адсорбционной емкостью по отношению к бактериальным клеткам и прочно удерживать их на поверхно-
сти. Эффективность процесса адсорбции определяется как химическими и физическими свойствами поверхности носителя, так и природой адсорбируемых микроорганизмов [7, 8, 10].
Иммобилизованные на носители микроорганизмы сохраняют высокую концентрацию клеток, они более устойчивы к действию токсикантов, размножаются быстрее, чем во взвешенном состоянии, характеризуются метаболической активностью. Помимо этого, иммобилизованные клетки микроорганизмов более устойчивы к неблагоприятному воздействию факторов окружающей среды, таких, например, как пониженная температура, засоленность почвы, высокие концентрации загрязнителей и другие [3].
Целью исследования было изучение способности выделенных и модифицированных бактерий к окислению Fe (II) при периодическом культивировании в жидкой среде. На основе проведенных исследований выделили наиболее перспективные бактериальные штаммы для использования их в биотехнологии очистки воды. Объектами исследования были следующие биосорбенты: Дестройл, Микрозим, DOR-UNI. Бактерии культивировали в 50 мл жидкой питательной среды в колбах Эрленмейера на 250 мл с широким горлом для обеспечения аэрации в настольном шейкере-инкубаторе В^сап ES-20 при 160 об/мин и комнатной температуре и рН 7,0 в течение 7 и 14 сут. В качестве жидких питательных сред объемом 150 мл (для трех биопрепаратов) использовали контроль (без добавления источника железа) составом, г/дм3: (Ш4)2804 - 0,5; №Ш3 - 0,5; К2НР04 - 0,5; ]^04 х 7Н2О - 0,5; лимонная кислота - 10,0; сахароза - 2,0; пептон - 1,0, а также с добавлением источника железа брали магнитную воду с учетом концентрации железа 11,8 г/дм3 массой 0,7 г соответственно на исследуемый объем. Концентрация каждого биопрепарата составила 10 г/дм3 при добавлении в питательные среды по 1 мл и соответствующим разбавлением в 51 раз. Следовательно, в исходных суспензиях концентрация микроорганизмов составила 0,196 г/дм3. В работе использовали методику получения магнетита на основе водного раствора солей железа (II и III) путем осаждения 25%-ным раствором аммиака [10].
Изучена способность ряда бактерий, выделенных из данных биопрепаратов с повышенным уровнем магниточувствительности, к окислению железа (II) в условиях периодического культивирования в жидкой среде. Оценка прироста биомассы бактерий через 7 сут культивирования способствовала выявлению штаммов с максимальными показателями роста. Размер бактерий составил в биопрепаратах DOR-UNI 1 мкм, Микрозим - 1 мкм, Дестройл - 0,8 мкм. Исследуемый объем в контроле составил DOR-UNI (К) - 39 мл, Микрозим (К) - 37 мл, Дестройл (К) -36 мл; в магнитной воде DOR-UNI (М) - 40 мл, Микрозим(М) - 35 мл, Дестройл (М) - 37 мл [4]. Определение остаточного содержания общего железа в культуральной жидкости различных биопрепаратов, содержащих магнитную воду и FeSO4х7H2O, проводили по стандартной методике в соответствии ГОСТ 4011-72 «Вода питьевая. Методы измерения массовой концентрации общего железа» с использованием цифрового фотоэлектроколориметра марки АР-101. Для получения культуральной жидкости исследуемых биопрепаратов использовали метод центрифугирования при 10 тыс. об/мин в течение 5-7 мин [5].
Начальная концентрация Feобщ в суспензиях с исследуемыми микроорганизмами составляла 0,68 г/дм3. Результаты оценки остаточного Feобщ в среде с магнитной водой при культивировании бактерий, образующих магнитосомы, представлена на рис 1.
Рис. 1. Оценка остаточного Feобщ в среде с магнитной водой при культивировании бактерий,
образующих магнитосомы
При определении остаточного содержания Fec^ с использованием суспензий с FeSO4*7H2O большая часть FeO образовалась в виде осадка. Наименьшее количество остаточного Fe^ в суспензиях после культивирования через 14 дней наблюдалось в присутствии DOR-UNI и составило 0,19 мг/дм3, а наибольшее - в присутствии биопрепарата Дестройл ^еобщ = 0,38 мг/дм3). Вероятно, клетки исследуемых микроорганизмов способны образовывать магнитосомы в большей или меньшей степени. Следовательно, в дальнейшем для создания нового эффективного сорбента, используемого при очистке воды от нефтепродуктов, следует применять в качестве микроорганизмов биопрепарат DOR-UNI. В Центре коллективного пользования научным оборудованием БГТУ им. В.Г. Шухова были подготовлены фотографии штаммов микроорганизмов, выделенных из биопрепаратов Дестроил и ДОР - UNI (рис. 2).
Рис. 2. Микрофотографии штаммов микроорганизмов, выделенных из биопрепаратов Дестроил (а)
и DOR-UNI (б)
В результате исследования было выявлено, что при добавлении в питательную среду источника железа наибольший прирост биомассы наблюдается у DOR-UNI (коэффициент прироста 369,4). У микроорганизмов, выделеннных из биопрепарата Дестройл, добавление железа в среду снижает прирост биомассы по сравнению с контролем. Следовательно, микроорганизмы из биопрепарата DOR-UNI образовали магнитосомы, о чем свидетельствует снижение концентрации Fe (рис. 1) и визуальный осмотр культур (рис. 2).
Иммобилизацию микроорганизмов-деструкторов в носитель производили посредством рассредоточения их биомассы и питательной среды в массе вещества носителя. Закрепление ассоциации микроорганизмов-деструкторов на адсорбентах-носителях осуществлялось за счет дефектной структуры поверхности частиц электросталеплавильного шлака, пористых частиц глины и микрочастиц железорудного концентрата (ЖРК, 1 мкм), налипших на «крупные» (0,1-0,3 мм) частицы за счет магнитного притяжения и обеспечивающих шероховатость поверхности. Физическое соединение микроорганизмов-деструкторов с материалом адсорбента-носителя осуществляли посредством увлажнения смеси материала адсорбента-носителя и биомассы микроорганизмов-деструкторов раствором минеральных солей и глюкозой до влажности 10-20%, для формирования гранул размером 3-10 мм с последующей сушкой гранул при температуре 20-30°С. Эффективность иммобилизации оценивалась методом определения числа клеток в пробе воды после выдержки полученного биоминерального комплекса в сосуде с водой в течение 10 часов при температуре 24-30°С. Исследования заключались в определении прироста бактериальных клеток в водной среде на мясопептонном агаре. Для этого на дно сосуда с водой помещали питательную среду в гелеобразном состоянии, на которую распределяли полученный биоминеральный комплекс. В результате исследований выявлено, что скорость прироста биомассы в начальный период для микроорганизмов, иммобилизованных на адсорбенте ЖРК+шлак, выше, чем для микроорганизмов, иммобилизованных на адсорбенте ЖРК+глина. В дальнейшем интенсивность увеличения числа клеток выравнивалась. Доставка биокомплекса к загрязненному участку донных отложений будет осуществляться за счет высокой скорости затопления биопрепарата, содержащего тяжелый железорудный концентрат. При этом практически не будет происходить отклонения при доставке биопрепарата к загрязненному участку при наличии подводных течений.
Таким образом, для магнитного манипулирования микроорганизмами необходима разработка технологии иммобилизации живых бактериальных клеток в магнитные носители. В нашей работе был проведен анализ возможности применения для этих целей следующего способа иммобилизации: включения бактериальных клеток в структуру сферических органелл - магнитосом, метода прикрепления на поверхность магнитного носителя путем прикрепления клеток с использованием магнитного поля. В качестве лучших носителей целесообразно использовать комплексный адсорбент, состоящий из электросталеплавильного шлака и железорудного концентрата, с иммобилизованным биопрепаратом, с развитой поверхностью и удельным весом, обеспечивающего его погружение в водную среду к донным отложениям. В ходе исследования образования магнитосом в бактериальной клетке было выявлено, что из всех рассматриваемых биопрепаратов наиболее эффективными являются штаммы, выделенные из биопрепарата DOR-UNI.
Работа выполнена в рамках реализации федеральной программы поддержки университетов «Приоритет 2030» с использованием оборудования на базе Центра высоких технологий БГТУ им. В.Г. Шухова.
Литература
1. Потапова Л.В., Владимцева И.В., Колотова О.В. Иммобилизация микроорганизмов активного ила на магнитные носители // Современные наукоемкие технологии. - 2005. - № 9. -С.69-71.
2. Разработка технологии очистки сточной воды с использованием иммобилизованной микрофлоры / Н.В. Кобызева, А.Г. Гатауллин, Н.Н. Силищев, О.Н. Логинов // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2009. - № 1. - С. 104-107.
3. Крякунова Е.В., Канарский А.В. Иммобилизация микроорганизмов и ферментов // Вестник Казанского технологического университета. 2012. - № 17. - C. 189-194.
4. Выделение и изменение штаммов микроорганизмов, с магниточувствительными свойствами из биопрепаратов / В.Ю. Жиленко, Д.О. Половнева, Ю.Е. Токач, Ю.К. Рубанов // Безопасность, защита и охрана окружающей природной среды: фундаментальные и прикладные исследования: Сборник докладов Всерос. науч. конф. (04-08 октября 2022 г.). - Белгород: Белгород. гос. технолог. ун-т им. В.Г. Шухова, 2022. - С. 242-250.
5. ГОСТ 4011-72 «Вода питьевая. Методы измерения массовой концентрации общего железа». - М.: Госстандарт России, 1998. - 14 с.
6. Desulfurization of light gas jil in immobilized-cell systems of Cordona sp. CYKS2 / J.H. Chang, Y.K. Chang, H.X. Ryu, H.W. Chang// FEMS Microbiol. Letters. - 2000. - Vol. 182, № 2. -Р.309-312.
7. Maksimova Ju.G., Demakov V.A. Immobilized bacterial cells of genus Rhodococcus hydrating acrylonitrile // Proceedings from V International Research/Practice Conference "Ecology and Scientific Technical Progress". - Perm, 2006. - P. 268-273.
8. Bonin P., Rontani J.F., Bondenave L. Metobolic differences between attached and free-living marine bacteria inadequacy of liquid cultures for describing in situ bacteria activity // FEMS Microbiol. Letter. - 2001. - Vol. 194. - P. 111-119.
9. Свергузова С.В., Мирошниченко Н.А., Дебердеев Т.Р. Адсорбция ионов Ni2+ альтернативным сорбционным материалом // Вестник Технологического университета. - 2022. - Т. 25, № 5. -С. 70-74.
10. Разработка комплексного адсорбента в качестве носителя нефтедеструктирующей биомассы / Ю.Е. Токач, Ю.К. Рубанов, В.Ю. Жиленко, Д.О. Половнева // Безопасность, защита и охрана окружающей природной среды: фундаментальные и прикладные исследования: Сборник докладов Всерос. науч. конф. (04-08 октября 2022 г.). - Белгород: Белгород. гос. технолог. ун-т им. В.Г. Шухова, 2022. - С. 282-287.
