CC BY
72
УДК 616-003.215-071+602.9
А.А. Чимитов Н.В. Рязанцева 2, Г.Ц. Дамбаев 2, Э.М. Бурлаева 3, В.Ф. Зеленцова 3, А.Н. Плеханов ‘, 5, А.П. Перинов Т.Д. Ханхашанова 1 , В.И. Медведев 1
ВЫДЕЛЕНИЕ ИЗ КРОВИ ДОНОРОВ С ПОМОЩЬЮ ГЕМОФИЛЬТРАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
1 Бурятский Республиканский онкологический диспансер (Улан-Удэ) 2 Сибирский государственный медицинский университет (Томск)
3 Бурятская республиканская станция переливания крови (Улан-Удэ)
4 Отделенческая клиническая больница на ст. Улан-Удэ ОАО «РЖД» (Улан-Удэ) 5 Бурятский филиал Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии
СО РАМН (Улан-Удэ)
В статье рассматриваются возможности применения специального устройства для выделения гемопоэтических стволовых клеток из крови доноров. Применение данного устройства для микропросеивания крови, позволяет, выделять гемопоэтические стволовые клетки, не вызывая, их повреждения. В виду простоты, и. быстроты, получения, результата устройство может, широко использоваться в лабораторной практике.
Ключевые слова: калиброванный фильтр, гемопоэтические стволовые клетки, донор
THE EXCRETION OF HAEMOPOETIC STEM CELLS FROM DONOR'S BLOOD BY MEANS OF HAEMOFILTRATION
A.A. Chimitov N.V. Ryazantseva 2, G.Ts. Dambayev 2, E.M. Burlaeva 3, V.F. Zelentsova 3, A.N. Plekhanov 4, A.P. Perinov ‘, T.D. Khankhashanova ‘, V.I. Medvedev 1
1 Buryat Republic Oncological Dispensary, Ulan-Ude
2 Siberian State Medical University, Tomsk 3Buryat Republican Blood Transfusion Station, Ulan-Ude
4 Department Clinical Hospital at the Station Ulan-Ude of Russian Railways Ltd., Ulan-Ude
5 Buryat Branch of Scientific Center of Reconstructive and Restorative Surgery SB RAMS, Ulan-Ude
The article review the possibilities of use of special device for excretion of haemopoetic stem, cells from donor's blood. The use of this device for blood microscreening allows to excrete haemopoetic stem, cells without their injury. This device can be widely used, in laboratory practice because of its simplicity and quickness of getting results
Key words: calibrated filter, haemopoetic stem cells, donor
В последнее время внимание исследователей и специалистов трансфузионной медицины привлекли гемопоэтические стволовые клетки периферической крови. Для понимания их роли большое значение имели труды начала ХХ века профессора А.А. Максимова, работавшего в Военно-медицинской академии г. Санкт-Петербурга, выдвинувшего и обосновавшего унитарную теорию кроветворения. В 90-е годы двадцатого столетия работами зарубежных ученых теория А.А. Максимова единодушно была поддержана на международных симпозиумах и получила мировое признание.
Согласно унитарной теории, все форменные элементы крови происходят из одной полипотент-ной недифференцированной (стволовой) клетки. Постепенное старение клетки приводит к нарушению обменных процессов и ее гибели. В организме человека повседневно погибает около 200 млрд. эритроцитов [3].
Стволовые клетки способны выходить из костного мозга в сосудистое русло, они в виде мононуклеаров до 1 % содержатся в циркулирующей крови и заполняют поврежденные области кроветворения в губчатых костях, восстанавливая гемопоэз [5].
Когда в организме возникает дефицит клеток крови, гемопоэтические стволовые клетки начинают делиться. Причем одна дочерняя клетка остается в нише, поддерживая численность популяции гемо-поэтических стволовых клеток на прежнем уровне, а другая, недолговечная, превращается в полипо-тентную стволовую клетку. Последняя в свою очередь делится, образуя родоначальные миелоидную и лимфоидную клетки. Потомки родоначальных клеток все более специализируются и постепенно утрачивают способность к пролиферации. В конце концов они перестают делиться и превращаются в полностью дифференцированные клетки крови, циркулирующие по всему организму.
Сегодня изучение стволовых клеток во многом помогает исследованию онкогенеза. За последние 50 лет удалось прояснить детали механизмов регуляции поведения нормальных стволовых клеток и их потомков. В результате выяснилось, что характерная для них иерархическая организация имеет место и в популяции раковых клеток опухоли. Раковые стволовые клетки, дающие начало злокачественным новообразованиям, обнаружены у пациентов, страдающих различными формами онкологических заболеваний крови, и у больных с
некоторыми солидными опухолями. Как и обычные стволовые клетки, они обладают способностью к самообновлению путем деления без дифференци-ровки и, следовательно, дают начало бесконечному числу аномальных дифференцированных клеток, из которых состоит опухоль [2].
Механический способ выделения клеток и клеточных ассоциаций из тканей является травматичным (разрушает значительное число клеток), вызывает повреждение клеточных структур, мембран, способствует цитолизу, нарушению клеточного цикла, процессов пролиферации, диф-ференцировки, созревания и функциональной активности клеток.
У пациентов костный мозг получают во время стернальной пункции, трепанобиопсии, операций на грудной полости (фрагменты ребер грудины) и трубчатых костях (бедро, голень, плечо). Стернальная пункция является достаточно болезненной операцией, производить которую нужно по строгим медицинским показаниям и с согласия пациента [4].
В костном мозге существуют ассоциации клеток, получивших название гемопоэтических островков (ГО). Гемопоэтические островки состоят из центральной клетки, представленной макрофагом или фибробластом, окруженным гемопоэтическими элементами. Макрофагальные островки окружены эритроидными или эритро-миелоидными клетками различной степени зрелости. Фибробласты образуют кластеры, преимущественно состоящие из клеток белой крови [1].
Цель исследования: разработать и изучить устройство для выделения гемопоэтических стволовых клеток из крови доноров.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Предлагаемое устройство состоит из стеклянной градуированной камеры, предназначенной для заполнения исследуемой венозной крови, внутри которой имеется съемный поршень, на дне камеры помещена пластмассовая решетка с закрепленным на ней калиброванным фильтром с диаметром пор 6 мкм. Для выделения из крови доноров гемопоэтических стволовых клеток, 9 мл венозной крови, взятой из локтевой вены, наливают в стеклянную камеру, затем под давлением поршня кровь фильтруется, при этом имеющиеся в крови гемопоэтические стволовые клетки оседают на фильтре. Осадок
наносим на предметные стекла, предварительно обезжиренные и охлажденные. Фиксируем мазки-отпечатки 3% спиртовым раствором Лейшмана 2 — 4 минуты. Затем смываем дистиллированной водой и красим азур-эозиновой смесью в соотношении 3 : 1
6 — 8 минут. После покраски промываем дистиллированной водой, сушим на воздухе и приступаем к просмотру под микроскопом.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Вышеуказанным методом исследована венозная кровь у 122 доноров. Их распределение по полу, возрасту и национальности выглядело следующим образом (табл. 1).
Таблица 1
Распределение доноров по полу, возрасту и национальности
Возраст 18-29 30-39 40-49 > 50
СО II с ю 2 = п 2 4 = п 9 3 = п
Пол мужской женский
п = 41 п = 81
Национальность буряты русские
п = 47 п = 75
Распределение доноров по групповой и резус принадлежности с учетом национальности отражено в таблице 2.
По активности кроводачи доноры были разделены на 3 группы: первичные доноры т.е. сдававшие кровь 1 раз в год; повторные доноры, сдававшие кровь до 3 раз в год; активные доноры, сдававшие кровь более 3 раз в год (табл. 3).
Из 122 обследованных доноров гемопоэти-ческие стволовые клетки были обнаружены у 49 активных доноров. Влияние национальности и возраста на частоту выявления гемопоэтических стволовых клеток не отмечено.
В заключение хотелось бы отметить, что проведенное исследование крови с помощью устройства для ее микропросеивания у 122 здоровых лиц, в нашем случае — доноров, раковых стволовых клеток у них не обнаружило.
Из 122 обследованных лиц гемопоэтические стволовые клетки были обнаружены у 49 активных доноров. Влияния национальности, возраста,
Таблица 2
Распределение доноров по групповой и резус принадлежности
Национальность буряты русские
47 75
Распределение групповой принадлежности О (I) А(11) В(111) АВ (IV) О (I) А(І I) В(ІІІ) АВ (IV)
10 14 19 4 30 20 21 4
% 21,3 29,8 40,4 8,5 40 26,6 28,1 5,3
Распределение резус-принадлежности КИ+ (пол.) КИ- (отр.) КИ+ (пол.) КИ- (отр.)
46 1 68 7
Таблица 3
Распределение доноров по активности
Из общего количества доноры распределены следующим образом: Доноры, у которых были обнаружены ГСК
Всего 122 49
Первичные доноры 14 -
Повторные доноры 16 -
Активные доноры 92 49
групповой и резус-принадлежности на частоту выявления гемопоэтических стволовых клеток не отмечено, но выявлена зависимость от активности донаций донорами.
ВЫВОДЫ
1. Простота конструкции устройства и быстрота получения результата исследования дает возможность его широкого применения в лабораторной практике.
2. Определение гемопоэтических стволовых клеток с помощью данного устройства не является травматичной, болезненной процедурой, требующей строгих медицинских показаний.
3. В отличие от механического способа выделения клеток во время стернальной пункции или трепанобиопсии не вызывает повреждения клеточных структур, мембран, цитолиза.
4. Отмечена зависимость выявления гемопоэтических стволовых клеток у активных доноров.
5. В крови здоровых лиц (доноров) раковых стволовых клеток не выявлено.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гольберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. — Томск : ТГУ, 1992. - 272 с.
2. Кларк М., Бекер М. Раковые стволовые клетки // В мире науки. — 2006. — № 10. — С. 29 — 35.
3. Руководство по трансфузиологии / под ред. Е.П. Сведенцова. — Киров : Бюро медицинской статистики, 1999. — 714 с.
4. Шахов В.П., Хлусов И.А., Дамбаев Г.Ц. и др. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей. — Томск : STT, 2004. — 386 с.
5. Neppert J. Therapie mit Granulozyten // Transfusionsmedizin. — Berlin : Verlag-Springer, 1996. —
S. 339 — 344.
Сведения об авторах
Чимитов Анатолий Агванович - кандидат медицинских наук, заместитель главного врача по лечебной работе ГУЗ «Бурятский республиканский онкологический диспансер» (670047, г. Улан-Удэ, ул. Пирогова, д. 32; тел.: 8 (3012) 43-96-26; e-mail: brod_omk@mail.ru).
Рязанцева Наталья Владимировна - доктор медицинских наук, профессор, проректор Сибирского государственного медицинского университета (634050, г Томск, ул. Московский тракт, д. 2; тел.: 8 (3822) 55-77-47).
Дамбаев Георгий Цыренович - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заведующий кафедрой госпитальной хирургии Сибирского государственного медицинского университета (634050, г. Томск, ул. Московский тракт, д. 2; тел.: 8 (3822) 41-75-70).
Бурлаева Энгельсина Матвеевна - главный врач ГУЗ «Бурятская республиканская станция переливания крови МЗ РБ» (670047, г. УланУдэ, ул. Пирогова, д. 7а; тел.: 8 (3012) 43-75-61).
Зеленцова Валентина Федоровна - заместитель главного врача ГУЗ «Бурятская республиканская станция переливания крови Минздрава республики Бурятия» (670047, г. Улан-Удэ, ул. Пирогова, д. 7а; тел.: 8 (3012) 43-75-61).
Плеханов Александр Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, главный врач НУЗ «Отделенческая клиническая больница на ст. Улан-Удэ ОАО «РЖД» (670001, г. Улан-Удэ, ул. Комсомольская, д. 1б; тел.: 8 (3012) 28-35-03, 8 (3012) 44-08-17; e-mail: plehanov.a@mail.ru).
Перинов Александр Петрович - кандидат медицинских наук, главный врач ГУЗ «Бурятский республиканский онкологический диспансер» (670047, г. Улан-Удэ, ул. Пирогова, д. 32; тел. 8 (3012) 43-72-40; e-mail: brod_omk@mail.ru). Ханхашанова Тамара Дмитриевна - врач клинической лабораторной диагностики (цитолог) ГУЗ «Бурятский республиканский онкологический диспансер» (670047, г. Улан-Удэ, ул. Пирогова, д. 32; тел. 8 (3012) 43-96-26).
Медведев Владимир Игоревич - эксперт-физик ГУЗ «Бурятский республиканский онкологический диспансер» (670047, г. Улан-Удэ, ул. Пирогова, д. 32; тел.: 8 (3012) 41-67-12; e-mail: guzbrod@yandex.ru).
