CC BY
58
УДК 663.15.:577.15
ВИДІЛЕННЯ ІНУЛІНАЗИ З КУЛЬТУРАЛЬНОЇ РІДИНИ Pénicillium sp. 225 ТА ХАРАКТЕРИСТИКА ЇЇ ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ
В. І. Стойко1
Н. М. Жданова1 1Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного
В. Л. Айзенберг1 НАН України, Київ
Г. П. Капічон1
В. В. Коновалова2 2Національний університет «Києво-Могилянська академія»,
А. Ф. Бурбан2 Центр мембранних досліджень, Київ
Е-mail: v_stoiko@mail.ru
Інуліназа каталізує реакцію гідролізу інуліну з переважним утворенням фруктози. Цей ензим має значні перспективи для використання: попередня обробка доступної сільськогосподарської сировини, зокрема такої, як топінамбур і цикорій, одержання фруктозних сиропів. Інтерес до процесів ензиматичного гідролізу інуліну рослинного походження пов’язаний також із перспективою отримання цукристих речовин, етанолу та молочної кислоти. Вивчено два різних способи виділення інулінази з культуральної рідини Penicillium sp. 225. У разі осадження органічними розчинниками (етанолом, ізопропанолом, ацетоном) найкращим осаджувачем виявився етанол. Для концентрування інулінази використовували метод ультрафільтрації. За допомогою підібраної полісульфонової мембрани UH-030P ступінь очищення одержаного з концентрату препарату становив 2,2 раза. При осадженні інулінази досягнуто ступеня очищення препарату 1,55 раза. Встановлено оптимальні умови дії ензиму: рН 5,0, температура 65 °С. Отриманий препарат інулінази характеризується рН- та термостабільністю.
Ключові слова: мікроскопічні гриби, інуліназна активність, виділення, ультрафільтрація, оптимальні умови дії.
Інуліназа (2,1 -в^-фруктозанфрукта-ногідролаза, КФ 3.2.1.7) каталізує реакцію гідролізу інуліну до фруктози та незначної кількості глюкози. Велика увага до цього ензиму зумовлена можливістю його використання в харчовій та мікробіологічній промисловості, а саме: для отримання фрук-тозних сиропів, промислового одержання фруктози, як реактив для діагностики вмісту фруктози в продуктах споживання, у виробництві молочної кислоти та етилового спирту тощо [1-6]. Інуліназа має високу термічну стійкість, що становить значний інтерес у зв’язку з перспективою проведення ензиматичного гідролізу інулінвмісної сировини, включаючи відходи, за високих значень температури [7].
Здатність до біосинтезу інулінази притаманна мікроскопічним грибам, дріжджам та бактеріям [6-10]. Перші здебільшого продукують позаклітинну екзоінуліназу, що є технологічно більш вигідним. Бактерії та дріжджі частіше утворюють ендоінуліназу, виробництво якої має низку недоліків. Передусім це труднощі під час виділення ензи-
му — руйнування клітинної структури, втрата активності на стадії виділення, складність виробничого контролю ензиматичної активності на стадії отримання цільового продукту під час культивування мікроорганізму.
У результаті проведеного нами скринін-гу щодо здатності до синтезу інулінази серед 301 колекційної культури 106 видів 39 родів мікроміцетів було селекціоновано новий ефективний штам РепісШіит ер. 225 (мезо-фільна культура) [11]. Розроблено склад живильного середовища для вирощування продуцента і проведено оптимізацію умов його культивування для досягнення максимального біосинтезу інулінази.
Метою цієї роботи було отримання та вивчення властивостей технічного ензимно-го препарату інулінази з РепісШіит ер. 225.
Матеріали і методи
Об’єктом дослідження був штам гриба РепісШіит ер. 225, який відібрано з колекції культур відділу фізіології та систематики
мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології НАН України.
Культивування досліджуваного мікроскопічного гриба проводили на живильному середовищі такого складу (г/л): нітрат калію — 2; дигідрофосфат калію — 1; сульфат магнію — G,5; хлорид калію — G,5; сульфат заліза — G,G1; жмих топінамбура — 2G.
Культуру вирощували в глибинних умовах у колбах Ерленмеєра об’ємом 75G мл за температури 2G-25 “С.
Ензимний препарат осаджували органічними розчинниками з культуральної рідини за температури 4 “С. При цьому використовували етанол (ректифікат), ізопропа-нол (х. ч.) та ацетон (х. ч.) у кількісному співвідношенні ензимний розчин — осаджу-вач 1:1; 1:2; 1:2,5; 1:3; 1:3,5; 1:4.
Ультрафільтрацію проводили в установці непроточного типу Amicon 82GG (Millipore, США) за робочого тиску 2GG кПа. У роботі застосовували целюлозні (UC-G1GT, C-G3GFM — з відсікальною здатністю за молекулярною масою cut off 1G та 3G кДа) та полісульфонові (P-G1GF, UH-G3GP, UH-G5GP, cut off 1G, 3G та 5G кДа відповідно) мембрани (виробництво Microdyn Nadir, Німеччина), сформовані на пористій поліпропіленовій підкладці. Ефективність роботи мембран оцінювали за їхньою продуктивністю, яку розраховували за формулою:
Інуліназну активність (A¡) рідких форм ензиму визначали за формулою [13]:
P=
V
St ’
л/м2 • год,
де V — об’єм фільтрату, який відібрано за час £ (V = 5 мл); 5 — поверхня фільтрації, м2 (5 = 13,4 см2); £ — тривалість відбору 5 мл фільтрату, год, а також за селективністю (коефіцієнтом затримування), яку визначали за формулою:
я = А1 - А 2100%,
А1
де А1 — активність ензиму у вихідному розчині (од.), А2 — активність ензиму в перміаті (фільтраті), од.
Ступінь концентрування препарату оцінювали за ступенем відбору, що його розраховували за формулою:
а = ^100%,
V
де V1 — об’єм фільтрату, мл; V,) — початковий об’єм рідини, що фільтрується, мл [12].
За одиницю інуліназної активності приймали таку кількість ензиму, що каталізує утворення 1 мкМ фруктози з інуліну за 1 хв у стандартних умовах ^ = 50 °С, рН 4,6).
Ar =■
K
18GTV
R, од/мл,
де K — кількість моноцукрів, які утворилися при ензиматичному гідролізі (за калібрувальною кривою), мкг; T — час реакції, хв;
V — об’єм проби ензиму, взятого для проведення реакції (у даній роботі V = const = 0,02 мл); R — розведення проби ензиму; 180 — маса 1 мкМ фруктози, мкг; К/180 — кількість мкМ фруктози, яка утворилася в результаті ензиматичного гідролізу інуліну.
Протеїн визначали за методом Лоурі [14].
Для встановлення деяких фізико-хіміч-них властивостей (рН- та температурного оптимуму, рН- та термостабільності) інулінази використовували концентрат препарату, отриманий ультрафільтрацією.
Дослідження впливу рН проводили в діапазоні значень рН 3,0 — 9,0 з інтервалом
1,0. Температурний оптимум інулінази Pénicillium sp. 225 визначали в діапазоні температур 20 — 80 °С з інтервалом 5-10 °С, рН- та термостабільність інулінази — інкубуванням ензимного розчину протягом 10, 30, 60, 120, 180, 240 хв з наступним оцінюванням активності в стандартних умовах.
Усі експерименти повторювали тричі. У таблицях наведено середні арифметичні величини, відхилення від середнього значення не перевищувало 5%.
Результати та обговорення
Ензимні препарати можуть бути отримані у вигляді порошків або рідких концентратів. Найпоширенішим і загальноприйнятим методом одержання ензимних препаратів у вигляді порошків є осадження ензимів з водних розчинів органічними розчинниками [2]. Виходячи з цього як осаджу-вачі використовували етанол, ізопропанол та ацетон. Характерно, що всі досліджені розчинники осаджували інуліназу Penicil-lium sp. 225 Вибір осаджувача здійснювали не тільки за максимальною інуліназною активністю одержаного препарату, а й за такими показниками, як питома активність, ступінь очищення та вихід ензиму (табл. 1).
Максимальний вихід ензиму (86,9%) спостерігали в разі використання ацетону в об’ємному співвідношенні культуральна ріди-на-ацетон 1:3. Якщо застосовували етанол та ізопропанол в об’ємному співвідношенні куль-туральна рідина-розчинник 1:3,5, вихід був менший — 79,3% та 73,7% відповідно.
Таблиця 1. Виділення препарату інулінази Pénicillium sp. 225 з культуральної рідини з використанням органічних розчинників
Об’єм розчинника на 1 об’єм культуральної рідини Інуліназна активність, од/мл Концентрація протеїну, мг/мл Питома активність, од/мг протеїну Вихід, % Ступінь очищення
Вихідний розчин (культуральна рідина)
2G,9 ± G,G2 7,5G ± G,11 2,79 1GG 1
Етанол Розчинники
1 6,69 ± G,G2 2,28 ± G,G6 2,93 32,G 1,G5
2 9,39 ± G,G7 2,8G ± G,G8 3,35 44,9 1,2G
2,5 11,58 ± G,G3 3,G3 ± G,G5 3,83 55,4 1,37
3 14,34± G,G5 3,G5 ± G,G2 4,7G 68,6 1,69
3,5 16,58± G,G4 3,84 ± G,G6 4,32 79,3 1,55
4 12,36± G,G2 3,38 ± G,G9 3,66 59,1 1,31
Ізопропанол
1 5,73± G,G2 1,95 ± G,G6 2,94 27,4 1,G5
2 7,35± G,G3 2,48 ± G,G4 2,97 35,2 1,G7
2,5 1G,56± G,G5 3,3G ± G,G7 3,2G 5G,5 1,15
3 14,G9 ± G,G2 4,G5 ± G,G6 3,48 67,4 1,25
3,5 15,41± G,G7 4,G5 ± G,G9 3,8G 73,7 1,37
4 12,5G± G,G2 3,G3 ± G,G6 4,13 59,8 1,48
Ацетон
1 6,G3 ± G,G3 2,11 ± G,G3 2,86 28,9 1,G3
2 12,42 ± G,G4 4,15 ± G,G6 2,99 59,4 1,G7
2,5 15,34 ± G,G2 5,1G ± G,G7 3,G1 73,4 1,G8
3 18,17 ± G,G9 5,88 ± G,G6 3,G9 86,9 1,11
3,5 15,62 ± G,G7 4,97 ± G,G9 3,14 74,7 1,13
4 1G,38 ± G,G5 3,53 ± G,G4 2,94 49,7 1,G6
Щодо максимального ступеня очищення інулінази, то з використанням ацетону він був найменшим — 1,12. Найвище значення ступеня очищення ензиму спостерігалось у разі застосування етанолу — 1,69.
Оптимальним варіантом для виділення та очищення інулінази було використання етанолу як органічного розчинника в об’ємному співвідношенні культуральна ріди-на-розчинник 1:3,5. За таких умов досягали досить високого виходу препарату — 79,3% та високого ступеня очищення 1,55.
Таким чином, для отримання технічного препарату інулінази можна використовувати будь-який із зазначених розчинників у оптимальних концентраціях.
Рентабельність технології одержання ен-зимного препарату значною мірою зумовлюють застосовувані методи виділення та очищення ензиму. У виробництві рідких форм ензимних препаратів дедалі більшого значення набуває ультрафільтраційний метод виділення. Ультрафільтрація дає змогу одночасно концентрувати та фракціонувати ензим-ні розчини. Ефективність методу залежить
від фізико-хімічних властивостей мембран, властивостей розчину, що концентрується, а також умов проведення процесу.
У результаті здійснення ультрафільтрації культуральної рідини гриба Pénicillium sp. 225 через усі досліджені мембрани отримано дані щодо продуктивності кожної з мембран, за якими побудовано залежність проникної здатності мембран від ступеня відбору (рис. 1).
| -Ф-С-030-РМ -»-иС-010-Т А ЦН-050-Р -Х-ІІН-ОЗО-Р -■» Р-010-Р І
Рис. 1. Залежність продуктивності мембран від ступеня відбору
Найвищою середньою продуктивністю —
24.01 л/м2-год — характеризується полісуль-фонова мембрана з cut off 50 кДа, однак селективність її за інуліназою найнижча і становить 80,9%. Зі зменшенням cut off до 30 кДа як для целюлозної, так і для полісульфоно-вої мембран селективність за ензимом підвищується до 87,3% та 82% відповідно. Найкращими селективними властивостями (понад 92% ) характеризуються мембрани з cut off 10 кДа, але значення їхньої продуктивності набагато нижчі й продовжують знижуватись у процесі ультрафільтрації, що спричинено утворенням гелевого шару на їхній поверхні (вторинна мембрана) (табл. 2).
Таким чином, експериментально доведено можливість використання ультрафільтрації для концентрування та часткового очищення культуральної рідини гриба Penicillium sp. 225. Для цього процесу можна рекомендувати полісульфонові мембрани. Оптимальним варіантом виявилась полі-сульфонова мембрана UH-030P з високою середньою продуктивністю 23,16 л/м2-год та коефіцієнтом затримки 82,0%, унаслідок чого вдалося досягнути концентрування в 3,5-4 рази. Показник інуліназної активності препарату з концентрату становив
72.2 од/мл (питома активність 6,07 од/мг); ступінь очищення — 2,2. Втрати активності ензиму при ультрафільтрації становлять 12%.
Найважливішими характеристиками у разі застосування ензимного препарату є рН- та температурний оптимум дії. Відомо, що оптимальним за дії інуліназ є значення
рН 4-5,5 [7]. Ця величина рН є більш сприятливою для виробничого процесу отримання фруктози з інулінвмісної сировини. Оптимальною температурою дії для більшості інуліназ є 45-55 °С. Також відомі й термостабільні форми ензиму з температурним оптимумом дії 60-65 °С [6, 7, 15, 16].
Встановлення рН-оптимуму ензиму проводили в діапазоні рН 3,0-9,0 (рис. 2). Як і для більшості інуліназ, рН-оптимум ек-зоінулінази Pénicillium sp. 225 становить
5,0. За значень рН 5,0-6,0 ензим є досить стабільним: упродовж 3 год зберігається до 80% його активності (рис. 3).
Вивчення впливу температури на дію ензиму показало, що її оптимальне значення становить 65 °С (рис. 4). При температурі 60 та 70 °С активність інулінази склала, відповідно, 80 та 94% від максимальної. Ензим зберігав близько 80% активності під час інкубації його при температурах 50 та 60 °С
Рис. 2. рН-оптимум дії інулінази Pénicillium sp. 225
Таблиця 2. Порівняльна характеристика ультрафільтраційних мембран при концентруванні інулінази
Досліджуваний розчин Тип мембрани Продуктивність за водою, л/м2тод Н “и * і 9 І* S2 ®sSs щ hoS роз еро л S S ю О Інуліназна активність, од/мл Загальна кількість інулінази, од Концентрація протеїну, мг/мл Питома активність, од/мг протеїну Селективність за інуліназою, % Інактивація ензиму під час ультрафільтрації, % Ступінь очищення
Вихідний розчин (КР) - - - 50 20,90 1045,0 7,5 2,79 100,0 - 1,0
Концентрат UC-010T 40 15,7 10 49,44 494,4 15,3 3,23 91,5 44,2 1,2
Фільтрат 40 2,22 88,8 2,5
Концентрат C-030FM 150 17,85 10 53,32 533,2 14,6 3,65 87,3 36,2 1,3
Фільтрат 40 3,33 133,2 3,5
Концентрат P-010F 50 19,84 10 50,52 505,2 13,1 3,86 96,3 47,9 1,4
Фільтрат 40 0,97 38,8 3,1
Концентрат UH-030P 100 23,16 10 72,20 722,0 11,9 6,07 82,0 12,8 2,2
Фільтрат 40 4,72 188,8 4,3
Концентрат UH-050P 250 24,01 10 51,64 516,4 11,7 4,41 80,9 31,4 1,6
Фільтрат 40 5,00 200,0 3,6
Рис. З. рН-стабільність інулінази Pénicillium sp. 225
Час, хв
-30 с
40 С
-50 С
-60С -*-65С
-70 С
Рис. Б. Температурна стабільність інулінази Pénicillium sp. 225
Рис. 4. Температурний оптимум дії інулінази Pénicillium sp. 225
протягом 2 год; за температур 65 і 70 °С активність зберігалась упродовж 1,5 та 1 год відповідно (рис. 5).
Таким чином, оптимальними умовами дії інулінази Pénicillium sp. 225 слід вважати такі: рH 5,0, температура 65 °С. Отримані нами дані
щодо фізико-хімічних властивостей ензимного препарату узгоджуються з даними інших дослідників [6, 7, 15, 16]. Характерною особливістю інулінази, виділеної з культуральної рідини Penicillium sp. 225, є її термостабільність.
Отже, для виділення та очищення інулі-нази Penicillium sp. 225, залежно від потреб застосування цього ензиму, можна рекомендувати як осадження органічними розчинниками (ступінь очищення ензиму 1,55), так і ультрафільтрацію. Однак у разі використання полісульфонової мембрани UH-030P у процесі ультрафільтрації культу-ральної рідини гриба Pénicillium sp. 225 препарат з концентрату характеризувався вищим ступенем очищення — 2,2.
Виділена термостабільна інуліназа має широкі перспективи застосування в біотех-нологічній промисловості завдяки значній інтенсифікації виробничого процесу.
ЛІТЕРАТУРА
1. Вагабов М. З., Керимова З. М., Мальцева Т. В., Корнеева О. С. Применение ферментных препаратов с целью ускоренного гидролиза инулина при производстве этилового спирта // Биотехнология. — 2005. — № 1. — C. 34-36.
2. Грачова И. М., Кривова А. Ю. Технология ферментных препаратов. — М.: Элевар, 2000. — 512 с.
3. Грушецкий Р. И. Разработка получения инулина из топинамбура. — К.: Вища школа, 1993. — 150 с.
4. Szambelan K, Nowak J. Acid and enzymatic hydrolysis of Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L.) tubers for further ethanol production // EJPAU. — 2006. — V. 9, N 4. — http://www.ejpau.media.pl/volume9/issue4/ art-38.html.
5. Zittan L. Enzymatic hydrolysis of inulin — an alternative way to fructose production // Starch. — 1981. — V. 33, N 11. — P. 373-377.
6. Cantor J. M. Progress in food engineering research and development. — New York: Nova Science Publishers, 2008. — 283 p.
7. Жеребцов Н. А., Абрамова И. Н,, Шеламова С. А Выделение экстрацеллюлярной бактериальной инулиназы и изучение ее физикохимических свойств // Биотехнология. —
2002. — № 3. — С. 13-20.
8. Pessoa A., Vitolo M. Inulinase from Kluyvero-myces marxianus: culture medium composition and enzyme extraction // Braz. J. Chem. Eng. — 1999. — V. 16, N 3. — P. 291-297.
9. Kulminskaya A. A., Arand M., Eneyskaya E. V. et al. Biochemical characterization of Aspergillus awamori exoinulinase: substrate binding characteristics and regioselectivity of hydrolysis // Biochim. Biophys. Acta. —
2003. — V. 1650, N 1 — 2. — Р. 22-29.
10. Gill P. K., Manhas R. K., Singh J., Singh P. Purification and characterization of an exoinulinase from Aspergillus fumigatus //
Appl. Biochem. Biotechnol. — 2004. — V. 117, N 1. — P. 19-32.
11. Стойко В. І., Жданова H. М., Айзенберг В. Л., Капічон Г. П. Скринінг мікроміцетів — продуцентів інулінази // Біотехнологія. — 2010. — Т. 3, № 2. — 2010. — С. 48-55.
12. Сова В. В., Кусайкин М. И. Методическое пособие к практическим занятиям по очистке белков. — Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та, 2006. — 42 с.
13. Айзенберг В. Л., Стойко В. И., Демиденок Е. А. и др. Методика количественного определения активности грибной инулиназы с ис-
ВЫДЕЛЕНИЕ ИНУЛИНАЗЫ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ Penicillium sp. 225 И ХАРАКТЕРИСТИКА ЕЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
В. И. Стойко1, Н. Н. Жданова1,
В. Л. Айзенберг1, А. П. Капичон1,
В. В. Коновалова2, А. Ф. Бурбан2
1Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев 2Национальный университет «Киево-Могиля-нская академия»,
Центр мембранных исследований, Киев
E-mail: v_stoiko@mail.ru
Инулиназа катализирует реакцию гидролиза инулина с преимущественным образованием фруктозы. Этот энзим имеет значительные перспективы для использования: предварительная обработка доступного сельскохозяйственного сырья, в частности топинамбура и цикория; получение фруктозных сиропов. Интерес к процессам энзиматического гидролиза инулина растительного происхождения связан также с перспективой получения сахаристых веществ, этанола и молочной кислоты.
Изучены два разных способа выделения ину-линазы из культуральной жидкости Penicillium sp. 225. В случае осаждения органическими растворителями (этанол, изопропанол, ацетон) лучшим осадителем был этанол. Для концентрирования инулиназы использовали метод ультрафильтрации. С помощью подобранной полисуль-фоновой мембраны UH-030P степень очистки полученного препарата из концентрата составила 2,2 раза. При осаждении инулиназы достигнута степень очистки препарата 1,55 раза.
Установлены оптимальные условия действия энзима: рН 5,0, температура 65 °С. Полученный препарат инулиназы характеризуется рН-ста-бильностью и термостабильностью.
Ключевые слова: микроскопические грибы, инулиназная активность, выделение, ультрафильтрация, оптимальные условия действия.
пользованием реактива Самнера // Биотехнология. — 2007. — № 5. — С. 95-96.
14. Lowry O. H., Rosebrough H. J., Faar A. L., Randal R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. — 1963. — V. 193, N 1. — P. 675-677.
15. Ettalibi M., Baratti J. C. Molecular and kinetic properties ofAspergillus ficuum inulinases // Agr. Biol. Chem. — 1990. — V. 54, N 1. — P. 61-68.
16. Claessens G., Van-Laere A., Proft M. D. Purification and properties of an inulinase from chicory roots (Cichorium intybus L.) // J. Plant Physiol. — 1990. — V. 136, N 1. — P. 35-39.
INULINASE ISOLATION FROM Penicillium sp. 225 AND ITS PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES
V. I. Stoiko1, N. M. Zhdanova1,
V. L. Aisenberg1, G. P. Kapichon1,
V. V. Konovalova2, A. Ph. Burban2
institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv 2National University of Kyiv Mohyla-Academy, Membrane Research Center, Kyiv
E-mail: v_stoiko@mail.ru
Inulinase catalyzes the reaction of hydrolysis of inulin with the predominant formation of fructose. This enzyme has following great prospects for use: pretreatment of available agricultural raw materials, such as artichoke and chicory, for example, receiving fructose syrups. Interest in the processes of enzymatic hydrolysis of vegetable inulin is also accociated with the prospect of obtaining of a sugary substance, ethanol and lactic acid.
Two different methods of inulinase purification from Penicillium sp. 225 culture liquid were studied. It was shown that in the case of organic solvent precipitation (ethanol, isopropanol, acetone), the best precipitant was ethanol. Method ultrafiltration was used for inulinase concentration. Polysulfone membrane UH-030P was selected for inulinase concentration. The degree of purification of inulinase preparation obtained with the enzyme concentrate was 2.2. Degree of purification of the drug reached 1,55 times as a result of inulinase precipitation.
Determined optimal conditions of the enzyme was as follous: pH 5.0, temperature 65 °C. The partially purified inulunase preparation is characterized by pH- and thermal stability.
Key words: microscopic fungi, inulinase activity, isolation, ultrafiltration, optimal conditions of activity.
