CC BY
275
■ ИМИ!
Оригинальные исследования
ЕЕ^ЕШ
Выделение и культивирование хондроцитов, полученных из различных источников
И.И. Ким
Новосибирск, Кольцова
1.1. Кут
Novosibirsk, Kol'tsovo
Isolation and culturing of chondrocytes from different sources
Целью данного исследования явилась отработка условий получения и культивирования клеток хрящевых тканей, полученных из различных источников.
В работе проводили сравнение способов выделения и культивирования хондроцитов, полученных из хрящевой ткани фетусов человека и из позвоночника больных идиопатическим сколиозом, а также из хрящевой ткани межпозвонковых дисков новорожденной собаки.
Исследования по подбору условий выделения и культивирования хондроцитов показали, что применение растворов коллагеназы в течение 12-16 часов при температуре 37°С и непрерывном перемешивании позволяет получить суспензию клеток с жизнеспособностью более 90%. Максимальное количество жизнеспособных хондроцитов наблюдали при выделении клеток с помощью 0,15% коллагеназы. Хрящевая фетальная ткань человека и межпозвонковых дисков собаки диссоциируется в коллагеназе 5-8 часов, ткань позвоночника больных идиопатическим сколиозом - 18-20 часов. При культивировании наилучшей пролиферативной способностью обладали хондроциты фетуса человека. Культура хондроцитов, полученных из позвоночника больных идиопатическим сколиозом, обладала низким показателем индекса пролиферации и коротким сроком культивирования по сравнению с фетальной культурой.
Ключевые слова: хондроциты, культура клеток, культивирование, коллагеназа, трипсин, гиалуронидаза.
The investigation was aimed to establish conditions for isolation and culturing cells of cartilaginous tissue procured from different sources.
Methods of chondrocytes obtaining and cultureing were compared. The chondrocytes were procured from human fetal cartilaginous tissue and the spinal column of patients with idiopathic scoliosis, as well as intervertebral disks of a new-born dog backbone.
The investigations of obtaining and culturing of chondrocytes from different sources showed that using collagenase solutions during 1216 h at 37°C with continuous interfusion allowed to receive cells suspension with more than 90% viability. The maximal amount of viable chondrocytes was derived while segregating cells using 0.15% collagenase. Human fetal cartilaginous tissue and that of dog intervertebral disks is being dissociated in collagenase for 5-8 h, tissue from the spinal column of patients with idiopathic scoliosis -for 18-20 h.
While culturing human fetal chondrocytes had the best proliferating capability. The culture of chondrocytes from the spinal column of idiopathic scoliosis patients had low proliferation index and a short culturing time as compared with fetal culture.
Key words: chondrocytes, cell culture, culturing, collagenase, tripsin, hyaluronidase.
Введение
Лечение заболеваний и травм опорно двигательного аппарата остается актуальной проблемой современной ме дицины. Несмотря на способность к репарации, костная и хрящевая ткани иногда не в состоянии полностью устранить дефицит, возникший в результате действия повреждающе го фактора. Попытки восстановить утраченную часть кости или хряща предпринимались с давних пор и сводились, прежде всего, к аллотрансплантации кусочков ткани или ис пользованию синтетических материалов [1]. Однако у этих широко применяемых и ставших уже рутинными технологий есть множество недостатков - от наличия иммунологическо го барьера и дефицита пластического материала до остаточ ного ограничения качества жизни, даже после проведенного лечения (синтетические протезы). Развитие клеточной био логии и, в частности, исследований в области тканевой ин женерии открывают новые перспективы в реконструктивной ортопедии (2, 3]. Как известно, клеточная технология позво ляет, не меняя поврежденный орган, «обновлять» его кле точный состав [4]. Поэтому подбор оптимальных условий получения и культивирования хондроцитов представляется актуальной задачей.
Целью данного исследования явилась отработка уело вий получения и культивирования клеток хрящевых тканей, полученных из различных источников.
Материал и методы
В работе использовали хрящевую ткань фетусов челове ка, хрящевую ткань позвоночника больных идиопатическим
сколиозом, а также хрящевую ткань межпозвонковых дисков новорожденной собаки. Хрящевую ткань позвоночника боль ных идиопатическим сколиозом после проведения плановых операций, а также хрящевую ткань межпозвонковых дисков новорожденной собаки, получали из научно исследовательс кого института травматологии и ортопедии г. Новосибирска.
Выделение хондроцитов из хрящевой ткани проводили механо ферментативным методом, используя в качестве диспергента коллагеназу IV типа (МР Biomedicals) в кон центрациях 0,05%, 0,1%, 0,15%, трипсин (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) в концентрации 0,025%, ги алуронидазу I S типа (Sigma Aldrich) в концентрации 0,05% и сочетание ферментов коллагеназы и гиалурони дазы в концентрации по 0,05% каждого. Хрящевую ткань, очищенную от окружающих мягких тканей, измельчали до кусочков размером 1 3 мма, затем обрабатывали фермен том фетальную ткань в течение 5 8 часов и 18 20 часов хрящевую ткань позвоночника больных идиопатическим сколиозом при постоянном помешивании при температу ре 37°С. После ферментации полученную взвесь клеток пропускали через нейлоновый фильтр и отмывали 2 раза от раствора диспергента питательной средой, затем цент рифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин. Процент жизнеспособных хондроцитов подсчитывали с помощью трипанового синего (5).
Индекс пролиферации культуры определяли при каждом пассаже [6, 7\.
Клетки культивировали с использованием среды DMEM/F12 (Биолот, Санкт Петербург) с добавлением 20%
А
I I I I I I
Оригинальные исследования
сыворотки крови плодов коровы (Биолот, Санкт Петербург). Клетки с поверхности культурального флакона снимали с помощью смеси растворов 0,02% Версена (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) и 0,025% трипсина (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) в соотношении 5:1. Пассирование проводили 2 раза в неделю [6, 7].
Морфологию культур клеток оценивали с помощью ин вертированного микроскопа «Carl Zeiss Jena».
Криоконсервацию проводили ступенчатым методом погружения в жидкий азот с помощью внутриклеточного криопротектора DMSO (МР Biomedicals) в концентрации 10% [6, 7].
Для статистической обработки данных использовали метод достоверности различий между группами по крите рию Стьюдента (t) с определением показателя статистичес кой достоверности (при р<0,05 различия рассматривались как статистически достоверные).
Результаты исследования и обсуждение
При получении первичных культур клеток одним из важных моментов является подбор протеолитических ферментов. Хрящевые ткани в зависимости от возраста и вида источника требуют разного способа выделения клеток.
Для получения первичных культур клеток используется целый ряд дезагрегирующих ферментов и реагентов: трип син, химотрипсин, коллагеназа, тринатрий цитрат, смесь версена и трипсина и др. Следует отметить, что, несмотря на многообразие предлагаемых ферментов, наиболее распро страненными на сегодняшний день является использование трипсина и коллагеназы [8].
Для получения суспензии хондроцитов использовали кусоч ки хрящей из межпозвонковых дисков новорожденной соба ки, которые диссоциировали с помощью растворов 0,025% трипсина или 0,1% коллагеназы (п = 4). Результаты показа ли, что при использовании растворов трипсина остается боль шое количество кусочков недиссоциированной ткани, а увеличение времени воздействия трипсина приводило к ги бели клеток. Применение же растворов коллагеназы позво ляло получить суспензию клеток с жизнеспособностью более 90%.
Анализ литературных данных показал, что не существует универсальной методики выделения хондроцитов. В рабо тах использовали различные диспергенты: коллагеназу, гиалуронидазу, проназу и др. [9 13). В нашей работе мы сравнили способы выделения хондроцитов с помощью ра створов коллагеназы и гиалуронидазы (п = 6). Данные по выделению жизнеспособных клеток в зависимости от вида и концентрации ферментов представлены на рис. 1.
Как видно из рисунка, при использовании 0,05 % гиалу ронидазы количество жизнеспособных хондроцитов соста вило 10 млн/г ткани. В то же время использование 0,05% коллагеназы приводило к увеличению количества выделен ных клеток приблизительно в 2 раза. Количество жизнеспо собных хондроцитов при использовании 0,1% коллагеназы или смеси гиалуронидазы и коллагеназы в концентрации по 0,05% каждой было сравнимо с таковым при использовании 0,05% коллагеназы. Наибольшее количество выделенных клеток в данном исследовании наблюдали при использова нии 0,15% коллагеназы. Количество жизнеспособных клеток составило более 30 млн/г ткани.
Сравнительное исследование особенностей диссоциации хрящевой ткани фетуса и хрящевой ткани позвоночника больных идиопатическим сколиозом показало, что эти тка ни требуют разного времени ферментативной диссоциации (п = 6). Хрящевая фетальная ткань человека и межпозвон ковых дисков собаки диссоциировала в коллагеназе 5 8 ча сов, а хрящевая ткань позвоночника больных идиопатическим сколиозом - 18 20 часов. Увеличение времени воздей ствия фермента приводило к гибели жизнеспособных хонд роцитов, а уменьшение к снижению выхода клеток.
При культивировании хондроцитов из разных источни ков получения было отмечено различие морфологических и культуральных свойств клеток каждого источника.
Хондроциты фетальной хрящевой ткани прикреплялись и распластывались на поверхности культурального флако на на 2 час культивирования. В первые сутки можно было различить очаги роста, содержащие эпителиоподобные клетки. На 3 сутки культивирования хондроциты фетуса че ловека 1 пассажа формировали плотный монослой. При этом клетки имели специфическую эпителиоподобную морфологию (рис. 2А). К 3 пассажу культура хондроцитов приобретала фибробластоподобную форму (рис. 2В, С), что соответствует литературным данным [14]. Важно отме тить, что культура хондроцитов суставов фетуса человека к 4 пассажу содержала больше фибробластоподобных кле ток по сравнению с культурой хондроцитов позвоночника фетуса человека. На всем протяжении культивирования
Рис. 1. Количество выделенных жизнеспособных клеток в зависимости от вида и концентрации фермента
Рис. 2. Культура хондроцитов человека:
А - культура хондроцитов позвоночника, 1 пассаж,
3 сутки культивирования;
В - культура хондроцитов позвоночника, 4 пассаж,
3 сутки культивирования;
С - кльтура хондроцитов суставов, 4 пассаж,
3 сутки культивирования;
О - культура хондроцитов из межпозвонковых дисков пациентов, страдающих сколиозом, 1 пассаж,
21 сутки культивирования. Ув.: х200
А
■ ИМИ!
Оригинальные исследования
фетальные хондроциты показывали высокий уровень про лиферации, индексы пролиферации составили 4 и 5 на втором и третьем пассажах соответственно. При длитель ном культивировании индекс пролиферации снижался, в культуре наблюдали гибель клеток.
Хондроциты позвоночника больных идиопатическим сколиозом в отличие от хондроцитов фетальной ткани при культивировании только на 14 сутки прикреплялись ко дну культурального флакона и начинали делиться и к 21 суткам формировали неплотный, сетчатый монослой. Клетки име ли многочисленные вакуоли, более крупные размеры, по сравнению с хондробластами здоровой ткани (рис. 20). При пассировании хондроциты позвоночника больных идиопа тическим сколиозом показывали низкий уровень пролифе рации, индекс пролиферации не больше 2, к 6 пассажу культура полностью деградировала. Таким образом, хонд роциты позвоночника больных идиопатическим сколиозом по сравнению с хондроцитами фетальной ткани обладали худшей культуральной активностью. Это может быть связа но как с возрастом донора, так и с нарушением обменных процессов в хрящевой ткани больных идиопатическим сколиозом (15].
Клетки межпозвонковых дисков новорожденной собаки показывали ту же динамику культивирования, что и хондро циты фетальной ткани человека (рис. 3): ко 2 часу культи вирования клетки прикреплялись и распластывались по поверхности культурального флакона, к 3 суткам формиро вали плотный монослой. Хондроциты межпозвонковых дис ков новорожденной собаки, по сравнению с фетальными хондроцитами человека, обладали меньшими размерами, имели округлую или полигональную форму. На протяжении периода культивирования хондроциты межпозвонковых дисков новорожденной собаки так же, как и хондроциты фетуса человека, показывали высокий уровень пролифера ции (рис. 4).
Рис. 3. Культура хондроцитов пластинки роста позвоночника новорожденной собаки, 2 пассаж, 3 сутки культивирования.
Ув.: х 200
Заключение
Таким образом, в результате исследования показано, что для получения максимального количества жизнеспособных хондроцитов наилучшим методом диссоциации хрящевой ткани из разных источников выделения является обработка 0,15% раствором коллагеназы для фетальной ткани в те чение 5 часов, а для ткани позвоночника больных идиопа тическим сколиозом в течение 18 20 часов.
Культуры хондроцитов, полученные из разных источни ков, отличаются друг от друга по культуральным и морфологи ческим свойствам. Наибольшей культуральной активностью обладают клетки, выделенные из хрящевой ткани фетуса человека.
Обнаруженные нами различия в морфологии и культу ральной активности хондроцитов, выделенных из различных источников, в перспективе могут быть использованы при раз работке способов воздействия на регенерацию суставного хряща или межпозвонковых дисков; наиболее перспектив ным материалом в этом плане следует признать фетальные хондроциты.
ЛИТЕРАТУРА
1. Oakes B.W. Orthopaedic tissue engineering: from laboratory to the clinic. Bone and join disorders: prevention and control. The Medical Journal of Australia. Bone and Joint Disorders: Prevention and Control. 2004; 180: 35 8.
2. Vacanti J. et al. Tissue engineering in orthopedic surgery. Orthopedic Clinics of North America 2000; 31 (3): 351 6.
3. Волков A.B. Тканевая инженерия в ортопедии: из лаборатории в клинику [мини обзор), http://celltranspl.ru/journal/publications/ ?MESSAGES[1]=SH0W_PUBLICATI0N&PUBLICATI0NJD=596.
4. Применение клеточных технологий в медицине. Центр Иммунотерапии и Клеточных Технологий, http://www.transplantation.ru/ru/ stem cell therapy.php.
5. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск: Издво Томского унта; 1992.
6. Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы. М.: Мир; 1989: 117 33.
7. Пинаев Г.П. Методы культивирования клеток: Сборник научных трудов. П.: Наука; 1988.
8. Богрянцева М.П., Трошкова Г.П., Мартынец Л.Д. и др. Некоторые аспекты производства и применения трипсина сухого стерильного для культур клеток. Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 1418 октября, 2002 г. М.: ЗАО «ПИК «Максима»», РХТУ им. ДИ. Менделеева 2002: 98.
9. Jakob М., Demarteau О., Schafer D. et al. Enzymatic digestion of adult human articular cartilage yields a small fraction of the total available cells. Connect. Tissue Res. 2003; 44(3 4): 1 73 80.
10. Barbero A., Grogan S., Schafer D. et al. Age related changes in human articular chondrocyte yield, proliferation and post expansion chondrogenic capacity. OsteoArthritis and Cartilage 2004; 12:476 84.
11. Hftraud F., Hftraud A., Harmand M. F. Apoptosis in normal and osteoarthritic human articular cartilage. Ann. Rheum. Dis. 2000; 59: 959 65.
12. Cornelissen М., Verbruggen G., Malfait A.M. et al. The study of representative populations of native aggrecan aggregates synthesized by human chondrocytes in vitro. J. Tiss. Cult. Meth. 1993; 15:139 46.
13. Dharmavaram R.M., Liu G., Mowers S.D., Jimenez S.A. Detection and Characterization of Sp1 Binding Activity in Human Chondrocytes and Its Alterations during Chondrocyte Dedifferentiation. J. boil. chem. 1997; 272(43): 26918 25.
14. Зубов Д.А., Попандопуло А.Г., Слипченко И.О. и др. Морфологические особенности постнатальных хондроцитов человека in vitro. Цитология 2004; 46(10): 917.
15. Зайдман А.М. Идиопатический сколиоз: морфология, биохимия, генетика. Новосибирск: Новосиб. унта; 1993.
Рис. 4. Зависимость индекса пролиферации культур хондробластов человека и хондробластов пластинки роста собаки от номера пассажа
I I I I I
■ I I I
Оригинальные исследования
А.В. Волков
ГУ «НИИ морфологии человека» РАМН, научный сотрудник ЗАО «Реабилитационные медицинские технологии», старший научный сотрудник, руководитель отдела регенерации костной и хрящевой тканей Член Международной ассоциации по тканевой инженерии и регенеративной медицине (ТЕКМ15)
Одной из актуальных проблем современного здра воохранения остаются дегенеративные заболевания суставных хрящей. Современные подходы к лечению не обеспечивают стабильного терапевтического эффекта и часто приводят к необходимости оперативного лечения.
Стремление исследователей к поиску эффективных и малоинвазивных методов, позволяющих добиться реге нерации хрящевой ткани, близкой к органотипической, привели к тому, что все чаще в зарубежной и отечествен ной литературе стали появляться работы, посвященные применению хрящевых клеток для восстановления хряще вой ткани. Трансплантация клеточной культуры в составе тканеинженерных конструкций перешла из эксперимен тальных исследований в клиническую практику.
Выполнение принципа аутогенное™ сопряжено с вы бором адекватной донорской зоны - источника клеточ ного материала, отвечающего следующим требованиям: малоинвазивность, техническая простота биопсии, мини мальный риск осложнений, минимальный объем препарата должен содержать максимальное количество хондроблас тов, что требует создания четких протоколов получения и культивирования клеточного материала.
Основу протоколов выделения хондробластов из образ цов ткани составляет применение ферментов, позволяю щих произвести дезагрегацию внеклеточного матрикса с минимальным повреждением клеток. В литературе опи саны методики выделения клеток с применением колла геназ, проназ и трипсина. Однако абсолютного стандарта не существует. Каждый исследователь, принимая во вни мание этот принцип, подбирает оптимальные условия. Поэтому, согласно зарубежным клиническим стандартам, от момента биопсии до выдачи трансплантата проходит не больше 4 недель.
Статья И.И. Ким, безусловно, актуальна. При отсут ствии разработанных клеточных продуктов, в нашей стра не имеется большое число потенциальных потребителей услуги восстановления костной или хрящевой тканей. Хо телось бы отметить, что, согласно международным тре бованиям, исследования такого рода следует проводить в общепринятом порядке: экспериментальный этап, вклю чающий разработку преклинических in vitro протоколов,
подтверждение безопасности и эффективности метода, а затем после анализа полученных данных и получения обнадеживающих результатов следует приступать к кли ническим исследованиям.
Экспериментальная часть работы, представленная в статье не отвечает требованиям разработки единого преклинического протокола выделения и культивирова ния клеток, поскольку автор сравнивает пролиферацию клеток собаки и человека. Остаётся не совсем понятно, с какими клетками работал автор, поскольку в статье не указан иммунофенотип клеточной культуры. Авто рами сделан вывод о перспективности клинического применения фетальных хондроцитов, основываясь на более высокой «культуральной активности» этого вида материала. Однако, высокая скорость пролиферации клеток в культуре не является преимуществом, связан ным с перспективами их клинического применения. Особенно это касается фетального материала. Кроме этических проблем, связанных с его получением, кото рые не следует недооценивать, он остается аллогенным, генетически небезопасным и имеющуюся высокую ве роятность инфицирования реципиента вирусными забо леваниями, даже после проверки в условиях специализи рованной лаборатории. В работе также не представлены данные о количестве и качестве исходного материала, величине выборки на точку наблюдения, плотности по сева на культуральные чашки, как один из ключевых моментов в определении скорости пролиферации. В дан ном контексте представленная работа не может считать ся преклинической и не выявляет преимущественного источника хондроцитов для будущего применения в кли нике. Кроме того, преклиническая работа требует систе матизации и более глубокого изучения мирового опыта исследований в данном вопросе. Тем не менее, несом ненен вклад автора статьи в разработку оптимальных методов (в частности, режимов ферментирования тка ней) выделения хондроцитов из различных источников. Вероятно, данное исследование является предвари тельным и будет дополнено последующими работами, которые в совокупности смогут ответить на поставлен ные вопросы.
