CC BY
29
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ВАРИАНТОВ ВИЧ-1, РЕЗИСТЕНТНЫХ К АНТИРЕТРОВИРУСНЫМ
ПРЕПАРАТАМ
© Никонорова Ю.В.*, Лаптева Т.А.Ф, Богачев В.В.*, Барышев П.Б.*, Мещерякова Ю.В.*, Черноусова Н.Я.У, Гашникова Н.М.°
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирский областной Центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями, Новосибирская область, п. Кольцово
Проведена изоляция ВИЧ-1 от инфицированных ВИЧ пациентов, получавших курсы специфической химиотерапии. Из 18 образцов периферической крови в 10 случаях удалось выделить инфекционные изоляты ВИЧ-1. Выделенные после сокультивирования с клетками здоровых доноров варианты ВИЧ-1 содержали мутации устойчивости к нуклеозид-ным и ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы и ингибиторам протеазы. Сравнительный анализ спектра мутаций, выявленных в геноме вариантов ВИЧ-1, выделенных из образцов плазмы крови и вариантов ВИЧ после их изоляции показал, что большее число мутаций устойчивости сохранилось после культивирования изолятов ВИЧ на моно-нуклеарных клетках крови без добавления антиретровирусных препаратов. В нескольких случаях в геноме ВИЧ-1 после изоляции вируса зафиксировано появление мутаций лекарственной устойчивости, не наблюдавшихся в соответствующих вариантах ВИЧ-1 до культивирования. Значительная часть изолятов ВИЧ-1 показала уровень репликативной активности, сопоставимый с таковым для ранее выделенных вариантов ВИЧ-1, не имеющих мутаций устойчивости к антиретровирусным препаратам. Репродуктивные свойства представленных в работе изолятов ВИЧ-1 позволяют использовать их для оценки эффективности разрабатываемых анти-ретровирусных средств в отношении устойчивых к АРВП вариантов ВИЧ-1 с использованием модели культур клеток.
Одной из главных причин неэффективности терапии при лечении ВИЧ-инфекции является возникновение резистентных к действию лекарственных
* Младший научный сотрудник ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». ' Аспирант ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
" Младший научный сотрудник ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
* Стажер-исследователь ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
* Врач-инфекционист Новосибирского областного Центра по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями.
у Главный врач Новосибирского областного Центра по профилактике и борьбе со СПИДом и
инфекционными заболеваниями. ° Заведующий отделом ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», доктор биологических наук.
препаратов вариантов ВИЧ. Это вынуждает проводить поиск новых лекарств, обладающих антиретровирусной активностью, в том числе и в отношении вариантов ВИЧ-1, устойчивых к антиретровирусным препаратам (АРВП). Наиболее распространенным и доступным методом оценки эффективности разрабатываемых препаратов является исследование ингибирующего действия веществ на ВИЧ-1 в культуре зараженных клеток. Для проведения такого анализа необходимо наличие набора современных генетически отличающихся вариантов ВИЧ-1, при этом особое значение имеет присутствие в коллекции изолятов ВИЧ-1, обладающих мутациями устойчивости к АРВП. Большинство резистентных ВИЧ, появившихся под давлением лекарственных препаратов, обладают пониженным уровнем репликативной активности. Это чаще всего обусловлено наличием мутаций устойчивости к АРВП, и осложняет их культивирование in vitro. В некоторых случаях резистентные к АРВП варианты ВИЧ могут содержать так называемые компенсаторные мутации, которые позволяют вирусу успешно реплицироваться в клетках с сохранением мутаций устойчивости. Целью данной работы была изоляция вариантов ВИЧ-1 от инфицированных пациентов, получавших курсы антиретровирусной терапии и изучение генетических и репликативных особенностей выделенных вирусов.
Материалы и методы исследования
Образцы для исследования были получены от ВИЧ-инфицированных пациентов Новосибирского областного Центра по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями, получавших курсы АРВП, включающие нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транс-криптазы (НИОТ и ННИОТ) и ингибиторы протеазы ВИЧ-1 (ИП).
Выделение изолятов ВИЧ проводили методом сокультивирования мо-нонуклеаров периферической крови (МПК) ВИЧ-инфицированных пациентов с предварительно стимулированными фитогемагглютинином МПК здоровых доноров [9]. Длительность культивирования варьировала для разных изолятов и составляла от 7 до 30 суток. Репликацию вируса оценивали по уровню накопления вирусспецифического белка p24, определяемого в иммуноферментном анализе. Идентификация субтипа ВИЧ-1, выявление мутаций в геноме вируса, ассоциированных с устойчивостью к антиретровирусным препаратам, проводили путем секвенирования последовательности гена pol и последующего анализа полученных данных с использованием специализированных программных ресурсов [6, 7, 8, 11]. Выделение РНК ВИЧ-1 для построения кДНК и секвенирования проводили как из плазмы крови инфицированных ВИЧ пациентов, так и из проб культуральной жидкости, отобранных в процессе изоляции ВИЧ-1.
Результаты
В работе были предприняты попытки изоляции инфекционных ВИЧ-1 из образцов МПК крови от 18 ВИЧ-инфицированных пациентов центра СПИД,
получавших курсы антиретровирусной терапии. Для 10 из 18 образцов со-культивирование МПК ВИЧ-инфицированных пациентов с мононуклеарами здоровых доноров сопровождалось активной репликацией ВИЧ, определяемой по увеличению концентрации вирусспецифического белка р24 в пробах культуральной жидкости, отбираемых в процессе изоляции ВИЧ с интервалом 3-4 суток.
Исследование геномов выделенных изолятов ВИЧ-1 показало, что 4 изолята относятся к субтипу A, один изолят - к субтипу B и 5 изолятов являются рекомбинантными формами CRF02_AG ВИЧ-1.
Анализ полученных последовательностей области гена pol вариантов ВИЧ-1, выделенных из плазмы инфицированных пациентов, показал наличие мутаций устойчивости к НИОТ (12), ННИОТ (9) и в двух случаях к ингибиторам протеазы. Для двух вариантов ВИЧ-1 из плазмы крови (1А, 1В) данных по нуклеотидным последовательностям получить не удалось.
Таблица 1
Спектр выявленных мутаций в геноме исследованных вариантов ВИЧ-1, определяющих развитие устойчивости к АРВП и данные по накоплению вирусспецифического белка р24 на 7 сутки культивирования исследованных вариантов ВИЧ-1 на мононуклеарных клетках периферической крови
Изолят ВИЧ-1 Суб-тип Мутации в гене pol, выявленные у вариантов ВИЧ-1 в плазме крови Мутации в гене pol, выявленные у изолированных ВИЧ-1 (после культивирования) Концентрация р24 на 7 сутки (пкг/мл)
1А A Нет данных A62V, M184V, T215I, K219Q 8,7х103
2А A N88D, A62V, Q151D, V90I, E138N A62V, M184V 5,3х102
4А A A62V, E138A A62V, K103KN, E138A 9,6х103
5А A A62V, V751V, M184V A62V, L74LV 2,0х103
1AG AG L10FL, K70IKRT, M184V, K103N, Y181CFSY K70IKRT, M184V, K103N, Y181CFSY 9,3х102
2AG AG M184V, K219N, Y181C M184V, K219N, K103N, Y181C 6,6х104
3AG AG K103N K103N 3,6х104
4AG AG L210FL, K103N - 1,8х102
5AG AG T215Y, K103N - 8,6х103
1B B Нет данных K103N, Y188HY 2,3х103
Результаты секвенирования ВИЧ-1 из образцов культуральной жидкости, отобранных при изоляции вирусов, показали некоторые отличия по набору мутаций в сравнении с мутациями, полученными для соответствующих ВИЧ из плазмы крови пациентов (табл. 1). Два изолята рекомбинантной формы 02_Лв ВИЧ-1 (4Лв и 5Лв) полностью утратили мутации устойчивости в ходе культивирования. Мутации Т215У, У751У, К701ККТ, К219М и N880 и в плазме и в культуральной жидкости встречались всего по одному разу, либо вообще утрачивались в ходе культивирования. Наиболее часто встречающи-
мися среди изученных образцов плазмы оказались мутации устойчивости K103N, M184V и Y181C. По одному случаю обнаружены N88D и L10F, определяющие устойчивость к ингибиторам протеазы [2, 7]. Замены M184V, K70IKRT, K219N, T215Y, T215I, L74LV и V75IV связывают со снижением чувствительности ВИЧ-1 к нуклеозидным ингибиторам обратной транскрип-тазы, тогда как замены K103KN, Y181C, Y188HY опосредуют резистентность к ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы [2-5, 7].
Кроме мутаций, ассоциированных с устойчивостью к АРВП, в нуклеотид-ных последовательностях выделенных изолятов выявились сопутствующие замены, которые имеют значение для развития резистентности только при появлении в связке со значимыми мутациями, или роль которых в развитии резистентности полностью не определена (A62V E138A, Q151d, L210FL).
Исследование кинетики роста изолятов ВИЧ-1 в культуре МПК выявило некоторые особенности их репликативной активности. Наиболее высокая концентрация белка р24 на 7 сутки культивирования была показана для изо-лята 2AG ВИЧ-1, несущего мутации M184V, K219N, K103N, Y181C, которая составила 6,6 х 104 пкг/мл. Самым низким уровнем накопления белка р24 на 7 сутки в изученной группе изолятов ВИЧ-1 характеризовался вариант 4AG, утративший в ходе культивирования мутации L210FL и K103N. Концентрация р24 для него составила 1,8х102 пкг/мл.
Обсуждение
К настоящему времени накопилось большое число работ по исследованию влияния мутаций устойчивости на репликативную активность изолятов ВИЧ-1. В большинстве случаев фиксируется снижение уровня репликации резистентного вируса по сравнению с вариантами ВИЧ-1 дикого типа, не обладающими нуклеотидными заменами, связываемыми со снижением чувствительности к антиретровирусным препаратам [2-5, 10, 12]. В нашем случае только сокультивирование десяти из восемнадцати образцов сопровождалось устойчивым детектируемым приростом вирусспеци-фического белка р24. Однако для большинства выделенных нами изолятов репликатитвная активность была вполне сопоставима с таковой для ранее выделенных нами изолятов ВИЧ-1, не несущих в геноме типичных мутаций устойчивости к АРВП. Исключение могут составить два изолята ре-комбинантной формы AG ВИЧ-1 (4AG и 1AG), концентрация р24 для которых на 7 сутки была равна 1,8 х 102 и 9,3 х 102 пкг/мл, что на 1-2 порядка меньше по сравнению с другими исследованными изолятами. Низкий уровень репликативной активности изолята 1AG вполне можно связать с влиянием целого ряда мутаций устойчивости, выявленных в его геноме (K70IKRT, M184V, K103N и Y181CFSY). Что касается изолята 4AG, то по набору выявленных в гене pol мутаций трудно утверждать, что именно они явились причиной снижения его репликативной активности. Так в отношении замены L210FL не удалось найти данных о ее влиянии на репликацию ВИЧ-1.
Тем не менее, при изоляции варианта 4AG, устойчивый к АРВП вариант вируса не смог конкурировать с изолятом дикого типа, о чем свидетельствуют результаты секвенирования ВИЧ-1, выделенного из образца культу-ральной жидкости, полученного после культивирования варианта 4AG. То же самое наблюдалось для изолята 5AG, так же утратившего мутации устойчивости к АРВП в ходе культивирования. В случае с этим изолятом есть основание главную роль в снижении репликативной активности отвести мутации T215Y, так как имеются данные исследований, в которых эта замена ассоциируется с ухудшением репродукции вируса [2-4]. Тем не менее, в ряде случаев снижение репликативной активности может быть обусловлено особенностями других участков генома вируса, не исследованных в данной работе. Так, в случае с изолятом 2AG наблюдается достаточно высокий уровень реплика-тивной активности (концентрация р24 на 7 сутки - 6,6 х 104 пкг/мл), при этом результаты секвенирования демонстрируют присутствие целого ряда мутаций, ассоциированных со снижением чувствительности к АРВП. Подобная ситуация может свидетельствовать о том, что мутации, определяющие резистентность, найденные в данном варианте ВИЧ, возникли после появления, так называемых, компенсаторных изменений генома [2]. Последнее обстоятельство в ряде случаев позволяет вирусу с мутациями устойчивости к АРВП успешно размножаться в культуре клеток без давления препаратов [5]. Более того, при анализе нуклеотидных последовательностей области гена pol вариантов ВИЧ-1 из сыворотки пациента и из проб культуральной жидкости, отобранных после культивирования, в отношении изолятов 4A и 2AG наблюдается не утрата мутаций, а наоборот, появление ранее не зафиксированных замен, ассоциированных с устойчивостью. При исследовании генома изолята 2А из проб культуральной жидкости была зафиксирована мутация M184V, не наблюдавшаяся при изучении вируса, выделенного из плазмы крови пациента. Это может быть связано с чувствительностью метода секвенирования нуклеотидных последовательностей, имеющих различную представленность в составе вирусной популяции, находящейся в организме человека. Известно, что каждый изолят ВИЧ-1 представляет собой популяцию квазивидов вируса, генетические последовательности которых, в зависимости от пропорций различных геномов, могут синтезироваться и, соответственно, терминироваться с меньшей вероятностью, что может изменять картину присутствия мутаций в динамично развивающейся системе [5].
Кроме возникновения в ходе культивирования замен в геноме ВИЧ, не определявшихся при исследовании соответствующих вирусов из плазмы, а также полного исчезновения мутаций устойчивости в геноме ВИЧ, в нашем исследовании имели место случаи их частичной утраты. Например, изолят 2А утратил в ходе культивирования мутацию устойчивости к ингибиторам протеазы ВИЧ-1 N88D. При изучении данных анализа последовательностей изолята 5А в образце вируса из культуральной жидкости были выявлены утраты мутации V75IV и M184V и появление замены L74LV
Возможно, последнее также объясняется отличиями в представленности
разных вариантов вируса в первоначальной смеси квазивидов.
* * *
В результате проведенного исследования выделены 10 изолятов ВИЧ-1 от инфицированных пациентов, получавших разные схемы антиретровирус-ной терапии, включающие НИОТ, ННИОТ и ИП. Изучены спектры мутаций устойчивости выделенных изолятов ВИЧ-1, стабильность поддержания мутаций и репликативные характеристики изолятов. Анализ полученных данных показал, что активность репликации резистентных вариантов ВИЧ-1 не всегда соответствует ожиданиям, основанным на анализе нук-леотидной последовательности области гена pol вируса. Получены активно реплицирующиеся изоляты ВИЧ-1, содержащие наиболее распространённые мутации, определяющие резистентность к применяемым для терапии ВИЧ-инфекции препаратам. Выявлено, что из 10 изолятов 4 относятся к субтипу A, 5 - к CRF02_AG и 1 - к субтипу B ВИЧ-1. Показано, что наиболее распространенными среди изученных изолятов явились мутации устойчивости к ННИОТ и НИОТ: K103N, Y181C и M184V. В большинстве случаев мутации устойчивости к АРВП при изоляции вирусов без добавления соответствующих препаратов на культуре МПК сохранились. Установлено, что уровень репликативной активности на 7 сутки культивирования изолятов ВИЧ-1 в среде, не содержащей АРВП, для большинства изученных изолятов ВИЧ-1 был сопоставим с таковым для ранее охарактеризованных нами ВИЧ-1, не несущих мутаций устойчивости.
Полученные в настоящей работе результаты указывают на возможность использования созданной коллекции выделенных изолятов ВИЧ-1, несущих различные наборы мутаций устойчивости к АРВП, для поиска перспективных антиретровирусных препаратов, обладающих эффективностью в отношении вариантов ВИЧ-1, резистентных к широко применяемым в настоящее время лекарственным средствам.
Список литературы:
1. Унагаева Н.В., Сафронов П.Ф., Никонорова Ю.В., Богачев В.В., Тот-менин А.В., Гуторов В.В., Букин Е.К., Гашникова Н.М. Выделение изоля-тов ВИЧ, имеющих эпидемиологическую значимость на территории Новосибирской области // Материалы научно-практической конференции молодых ученых и специалистов организаций Роспотребнадзора. - Обо-ленск, 2009. - С. 157-158.
2. Clotet B., Menendez-Arias L. at all. Guide to management of HIV drug resistance, antiretrovirals pharmacokinetics and viral hepatitis in HIV infected subjects. - Ninth edition. - 2009. - 408 p.
3. Cong M., Heneine W., and Garci'a-Lerma J. G. The Fitness Cost of Mutations Associated with Human Immunodeficiency Virus Type 1 Drug Resis-
tance Is Modulated by Mutational Interactions // J. Virology. - Vol. 81, No. 6. -2007. - P. 3037-3041.
4. Dykes C., Demeter L. M. Clinical Significance of Human Immunodeficiency Virus Type 1Replication Fitness // Clinical microbiology reviews. - Oct. 2007. - P. 550-578.
5. Gao Y., Paxinos E., Galovich J., at all. Characterization of a Subtype D Human Immunodeficiency Virus Type 1 Isolate That Was Obtained from an Untreated Individual and That Is Highly Resistant to Nonnucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors // J. of Virology. - May 2004. - P. 5390-5401.
6. http ://coreceptor.bioinf. mpi-inf. mpg.de.
7. http://hivdb6.stanford.edu.
8. http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/webpssm.
9. Human Retrovirus Protocols Virology and Molecular Biology / Edited by Tuofu Zhu, MD. - Humana Press. - Totowa, New Jersy, 2005. - 495 p.
10. Martinez-Picado J., Savara A.V., Sutton L., D'Aquila R. T. Replicative Fitness of Protease Inhibitor-Resistant Mutants of Human Immunodeficiency Virus Type // J Virol. - 1999 May. - 73 (5). - P. 3744-3752.
11. Tamura K., Dudley J., Nei M and Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 // Mol Biol Evol. -2007. - Vol. 24. - P. 1596-1599.
12. Zennou V, Mammano F., Paulous S. Loss of Viral Fitness Associated with Multiple Gag and Gag-Pol Processing Defects in Human Immunodeficiency Virus Type 1 Variants Selected for Resistance to Protease Inhibitors In Vivo // J. Virology. - 1998. - Vol. 72, No. 4. - P. 3300-3306.
МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДОКРИННОЙ СОСТАВЛЯЮЩЕЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ АКУЛЫ (CHILLOSYUM PUNCTATUM)
© Савельева Е.С.*, Прощина А.Е.Ф
Научно-исследовательский институт Морфологии человека РАМН, г. Москва
Исследована поджелудочная железа акулы Chilosyllium punctatum (Müller and Henle, 1838). Проведены: макроанатомическое, гистологическое и иммуногистохимическое исследования. Для гистологического исследования применялись методы окраски Гематоксилин-эозином, по Гроссо, по Ван Гизону, по Маллори. Для иммуногистохимического исследования использовались реактивы: мышиные моноклональные антитела к глюкагону, инсулину и нейрон специфической энолазе (NSE) фирмы Lab Vision, а также кроличьи поликлональные антитела к сомато-
* Научный сотрудник лаборатории Развития нервной системы.
* Научный сотрудник лаборатории Развития нервной системы.
