CC BY
276
УДК 547.992.2
Е. В. Бурова (асп.), И. А. Потапова (к.х.н., доц.), П. П. Пурыгин (д.х.н., проф.)
Выделение и исследование токсических свойств солей гуминовых кислот и возможности их применения как пищевой добавки
Самарский государственный университет, кафедра органической, биоорганической и медицинской химии 443011, ул. Акад. Павлова, д. 1, г. Самара; тел. (846)3345459, e-mail: potap59.59@mail.ru
E. V. Burova, I. A. Potapova, P. P. Purygin
The selection and study of the humic acids salts toxic properties and their possible use as a food additive
Samara State University
1, Асас1. Pavlova Str, 443011, Samara, Russia; ph. (846)3345459, e-mail: potap59.59@mail.ru
Были выделены гуминовые кислоты из бурых углей, исследована токсичность гуминовых кислот на биологических тест-объектах дафниях по стандартной методике Н. С. Строганова, а также исследована острая токсичность гуминовых препаратов на белых беспородных крысах в соответствии с правилами лабораторной практики и показано, что гуминовые кислоты относятся к группе малотоксичных веществ, вызывают отсроченную гибель животных и нарушения жизненно важных функций организма и могут использоваться как пищевая и кормовая добавка.
Ключевые слова: белые беспородные крысы; биологические тест-объекты дафнии; гуминовые кислоты; пищевая и кормовая добавка; токсичность гуминовых кислот.
Humic acids were distinguished from brown coals, the toxicity of humic acids is investigational on biological test-object daphnes on standard methodology of N. S. Stroganov, and the sharp toxicity of humic preparations is similarly investigational on white outbred rats it is shown in accordance with the rules of laboratory practice, that humic acids behave to the group of low-toxic substances, cause the deferred death of animals and violations of vitally important functions of organism and can be used as food and feed addition.
Key words: humic acids; the toxicity of humic acids; on biological test-object daphnes; white outbred rats; food and feed addition.
За последнее столетие произошли серьезные изменения условий жизни и условий производства. Стало естественным приобретать полуфабрикаты или уже готовую продукцию с целью экономии личного времени. Для этого сотни, тысячи тонн мяса, молока, зерна, круп, овощей, фруктов ежедневно перерабатываются на предприятиях пищевой промышленности. И на каждом этапе производство ставит свои, вполне определенные условия, для улучшения качества сырья и конечного продукта, сроков и условий хранения, упрощения различных производственных процессов, тем самым удешевляя продукты питания. Используя пищевые добавки, удается добиться улучшения этих показателей. Несомненным становится вопрос о качестве и безопасности такой продукции.
Дата поступления 19.11.12
Гуминовые вещества образуют огромный класс природных органических соединений, о котором химики надолго и совершенно незаслуженно забыли. Между тем, с точки зрения химии будущего, их возможности безграничны, а область их практического применения очень велика. Научное применение препаратов гуминовой кислоты (ГК) начато в медицине и ветеринарии с 1967 г. Их преимущества перед обычными лекарствами проявились очень быстро. Препараты ГК благодаря своему вяжущему, антирезорбтивному, противовоспалительному, антибактериальному и противовирусному действию особенно хорошо подходят для терапии заболеваний органов пищеварения и нарушений обмена веществ, контролируемых кишечным иммунитетом. Гуминовые препараты безвредны для животных и человека, не обладают аллергирующим, анафилактоген-
ным, тератогенным, эмбриотоксическим и канцерогенным свойствами при использовании в рекомендуемых дозах. Это позволяет создавать на их основе экологически чистые натуральные кормовые добавки и ветеринарные препараты для птиц, сельскохозяйственных животных, рыб, домашних питомцев, косметические и лечебные препараты для человека.
На сегодняшний день наиболее изучено в РФ действие БАД к пище «Гумивит». Ее основу составляет гумат натрия, полученный из гу-миновых кислот окисленного бурого угля.
Целью настоящей работы является исследование ГК на токсичность. Для реализации поставленной цели необходимо было решение следующих задач: выделить гуминовые кислоты из образцов бурого угля и определить токсичность ГК.
Экспериметальная часть
Выделение гуматов калия и натрия и гу-миновых кислот из бурых углей. Гуминовые кислоты выделяли из образцов бурого угля традиционным способом водно-щелочной экстракции с последующим их осаждением в кислой среде. Реакции извлечения ГК сводятся к следующим уравнениям:
БУ + NaOH ^ ^ГК-СОО^+ГМК-СОО^+ФКСООШ, 2ГК—COONa + 2ГМК-СООШ +
+2ФК—COONa + 3Н25О4 ^ ^ 2ГК-СООН + 2ГМК-СООН + +2ФК-СООН + 3^25О4.
где БУ — бурые угли;
ГК — остаток гуминовой кислоты;
ФК — фульвокислоты;
ГМК — гиматомелановая кислота.
Перед нами стояла задача модифицировать имеющиеся методики с целью более полного извлечения ГК из бурых углей.
Мы подбирали концентрации, температуру и время прохождения реакции и определили, что наиболее полное выделение гуматов натрия и калия происходит при экстракции 4% раствором щелочи при температуре 80 oC. Оптимальное время реакции составляет 4 ч. Более высокая концентрация щелочи не сказывается на полноте извлечения гуминовых кислот. Использование при получении гуматов натрия и калия различных минеральных кислот (HCl или Н2БО4) не оказывает влияния на состав и структуру гуматов натрия и калия.
Использование более высоких температур для обработки исходного сырья приводит к фатальному уменьшению выхода гуматов натрия и калия (от 4 до 2%) и резкому изменению состава получаемых продуктов: происходит гидролиз и вымывание карбоксильных и, особенно, полисахаридных фрагментов, за счет этого увеличивается относительное содержание ароматических фрагментов (до 44—45 %). Нагревание более 4 ч также не сказывается на более полном извлечении гуминовых кислот.
При водно-щелочной экстракции 2% раствором КОН в раствор переходят, отделившись от молекулы ГВ, преимущественно низкомолекулярные фракции гуминовых соединений, аминосахара и моносахариды. Аминокислот бывает от 17 до 22, все они а-аминокислоты, те же, что присутствуют в растениях, бактериальной плазме, причем примерно в тех же со-1
отношениях .
Наиболее полное выделение гумата натрия и калия происходит при экстракции 4% раствором щелочи, при температуре 80 °С и времени реакции 4 ч 2.
Состав выделенных веществ подтверждали методом ИК спектроскопии. Преимуществами метода являются информативность по функциональному составу, экспрессность и возможность анализа веществ без дополнительного фракционирования. Это позволяет получать более достоверную информацию о строении макромолекул ГК, чем при химическом анализе, так как химическое воздействие на ГК обычно приводит к необратимым структурным изменениям 3. Инфракрасные спектры снимались на приборе Spectrometer фирмы Perkin Elmer Spectrum 100 FT-IR. Условия записи спектров: интервал длин волн 4000— 400 см-1, подавление сигналов H2O и CO2, спектры записаны относительно воздуха. Использовали приставку двойного отражения.
Полученные ИК спектры (рис. 1) сравнили с литературными (рис. 2).
В спектрах ГК обнаружены интенсивные полосы поглощения:
при 3500-3400 см-1, отнесенные к гидро-ксильным группам (фенольные, спиртовые и ОН-группы в карбоксильных группах);
2920, 1370 см-1 — относится к длинным метиленовым цепочкам;
2860 см-1 - к метильным концевым группам.
Полосы поглощения при длинах волн 1720 см-1 соответствуют карбоксильным группам (С=О в карбоксильных группах), 1600 см-1 -
98 96 9492-;
90-; 88 86 84 82-; 80 78-; 76-; 74-^ 72-; 70-; 68 66 ^ 4000
3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Wavenumbers (ап-1)
Рис. 1. ИК спектр гуминовых кислот по литературным данным
свидетельствуют о наличии бензоидных структур (С=С в ароматических системах),
1225 см-1 — ОН-группы в карбоксильных группах,
1025 см-1 — ОН-группы фрагментов углеводов,
1650 см-1 — Ы=С в имино-группах.
Из рис. 1 и 2 видно, что экспериментальные данные согласуются с литературными, таким образом, можно сделать вывод, что полученные ГК могут использоваться в последующих экспериментах.
Рис. 2. Экспериментальный ИК спектр гуминовых кислот
Определение токсичности гуминовых кислот на биологических тест-объектах дафниях по стандартной методике Строганова Н. С.
Сосуд объемом 0.75 л, наполненный отстоявшейся не менее трех суток водопроводной водой, добавляли водный экстракт гуминовых кислот в концентрациях 0.01—5.0 мг/л и корм — 1% суспензию пекарских дрожжей.
Затем помещали 10 рачков в возрасте до 24 ч из одного поколения. Использовали дафнии из имеющейся лабораторной культуры кафедры зоологии СамГУ, содержавшейся по общепринятой методике. Эксперимент проводили в термостате со стеклянной дверкой при температуре 21—22 0С и естественном освещении. Дафний кормили суспензией пекарских дрожжей через 1 сут. Через каждые 4 сут проводили замену среды на вновь приготовленную. Эксперимент проводили на протяжении 21 сут.
В растворах экстракта, начиная с концентрации 2.5 мг/л, размножение дафний происходило с задержкой выхода молоди относительно контроля на 1—2 сут. При этом в растворе экстракта 5.0 мг/л появилось всего 2 дафнии, плодовитость также оказалась меньше, чем в контроле и в растворах 0.1—2.5 мг/л.
В ходе эксперимента учитывали следующие показатели: количество погибших и оставшихся в живых рачков, время появления яиц в выводковых камерах, время выхода молоди из выводковых камер и ее количество.
Эксперимент проводили в трех повторнос-тях. Достоверность различий оценивали по критерию Вилкоксона—Манна—Уитни 4'5.
Гибель дафний в растворах экстракта гу-миновых кислот наблюдалась с концентрации 2.5 мг/л (табл. 1) и к 21 сут достигла 13%. При 5.0 мг/л в растворе экстракта дафнии погибали на 16-е сут. Следует отметить, что в растворе экстракта до 10—16 сут все дафнии оставались живыми, далее начиналась быстрая гибель.
Таблица 1
Выживаемость дафний (%) в растворах экстракта гуминовых кислот
Концентрация сутки
3 5 7 9 11 13 15 17 19 21
контроль 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
экстракт 1.25 мг/л 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
экстракт 2.5 мг/л 100 100 100 100 100 100 100 95 90 87
экстракт 5.00 мг/л 100 100 100 100 100 100 100 80 50 30
Таблица 2
Оценка летальности животных
Объем, мл Доза, мг/кг Концентрация %, мас. Гуминовые препараты на основе гуматов натрия
погибло выжило
5 227.3 1 0 5
5 454.5 2 0 5
5 681.8 3 0 5
5 909.1 4 2 3
В растворах экстракта, начиная с концентрации 2.5 мг/л, размножение дафний происходило с задержкой выхода молоди относительно контроля на 1—2 сут. При этом в растворе экстракта 5.0 мг/л появилось всего 2 дафнии. Плодовитость также оказалась достоверно меньше, чем в контроле и в растворах 0.1-2.5 мг/л (табл. 1)
В растворах экстракта 0.25-2.5 мг/л плодовитость оказалась меньше, чем в контроле. В концентрациях 0.1 мг/л негативного влияния экстракта на размножение дафний не выявлено.
Таким образом, исходя из результатов проведенных экспериментов, можно сделать вывод, что водный экстракт гуминовых кислот является объектом средней степени токсичности для дафний (четвертый класс токсичности). Определена токсическая концентрация для дафний, она составила 5 мг/л.
Исследование острой токсичности гумата натрия. Поиск новых путей оздоровления и повышения продуктивности сельскохозяйственных животных с помощью кормовых добавок при высоких требованиях к экологии мясных и молочных продуктов питания закономерно привел к увеличению объема исследований по применению в животноводстве щелочных солей природных гуминовых кислот -гуматов, у которых также обнаружены имму-номодуляторные свойства. Их высокая экологическая безопасность и уникальная способность улучшать обменные процессы и повышать энергетику клеток весьма положительно проявляется на живых организмах.
Гуминовые препараты безвредны для животных и человека, не обладают аллергирую-щим, анафилактогенным, тератогенным, эмб-риотоксическим и канцерогенным свойствами при использовании в рекомендуемых дозах. Это позволяет создавать на их основе экологически чистые натуральные кормовые добавки и ветеринарные препараты для птиц, сельскохозяйственных животных, рыб, домашних питомцев, косметические и лечебные препараты для человека 6.
Изучение острой токсичности гуминовых препаратов проводилось в соответствии с правилами лабораторной практики (ОЬР), Приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики», Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2005 г).
Белым беспородным крысам обоего пола массой 200-220 г ежедневно вводили внутри-желудочно в дозах 2, 3, 4, 5 мл гумата натрия. За животными вели наблюдения в течение 14 дней, отмечая клиническую картину отравления и гибель животных.
Животные содержались на стандартном лабораторном рационе в условиях свободного доступа к пище и воде. Все манипуляции с животными осуществлялись в зимний период, в первой половине дня.
Изучение острой токсичности гуминовых препаратов на основе гуматов натрия показало, что пероральное введение не приводит к каким-либо изменениям в поведении животных.
Результаты изучения острой токсичности представлены в табл. 1.
Таблица 3
Изменение массы животных при оценке острой токсичности экстракта гуминовых кислот
Препарат и способ введения Доза, мг/кг Изменение массы, % к исходной
1 сут 7 сут 14 сут
Контрольная группа 227.3 170.2±3.1 171.3±3.7 175.5±3.3
454.5 168.7±2.9 171.9±2.7 172.5±3.7
681.8 169.4±3.7 172.4±3.4 173.9±2.9
909.1 169.9±2.7 173.4±2.9 173.9±3.2
Суспензия гуминовых кислот внутрижелудочно 227.3 169.7±4.2 175.8±4.4 185.3±3.9
454.5 162.1±3.5 164.7±3.3 160.5±3.6
681.8 155.2±3.3 151.5±3.4 145.3±3.3
909.1 149.9±3.3 143.5±2.8 139.1 ±3.6
Как видно из табл. 2, введение гумата натрия крысам перорально в объеме 5 мл и дозе 909.1 мг/кг приводит к гибели 40% исследуемых животных.
В ходе эксперимента отмечалось уменьшение массы экспериментальных животных в опытных группах относительно контрольной группы (табл. 3).
Таким образом, результаты указанных экспериментов показали, что гуминовые кислоты относятся к группе малотоксичных веществ, вызывают отсроченную гибель животных и нарушения жизненно важных функций организма и могут использоваться как пищевая и кормовая добавка.
Литературы
1. Тейт Р., III. Органическое вещество почвы.-М.: Мир, 1991.- С.84.
2. Потапова И. А., Вишняков В. В., Пурыгин П. П., Симакова С. А., Воробьев Д. В., Ушакова В. Н. // Изв. Самарск. науч. центра РАН. Спец. выпуск «XIII конгресс «Экология и здоровье человека».- 2008.- Т.1.- С.215.
3. Лиштван И. И., Бамбалов Н. Н., Тишкович А. В. // Химия твердого топлива.- 1990.- №6.-С.14.
4. Строганов Н. С. Ведение лабораторной культуры и определение плодовитости дафний в ряду поколений.- М.: Наука, 1971.- С.210.
5. Строганов Н. С. Методика определения токсичности водной среды.- М.: Наука, 1971.- С.14.
6. Анисимов М. М., Лихацкая Г. Н. // Труды растениеводства и животноводства.- Хабаровск, 2001.- Т.2.- С.34.
