CC BY
62
■■■ ■ I I I I I 11 4- I ■ ■ ■~m
Новости клеточных технологий
Выделение и характеристика стволовых клеток меланомы
Согласно теории канцерогенеза неопластические клетки, дающие начало опухолям, образуются из «взрослых» стволовых клеток или незрелых предшественников в результате нарушения в них генетических программ, обеспечивающих нормальное обновление тканей [7]. Предполагается, что в долгоживущих стволовых клетках первичные онкоген-ные события резко увеличивают вероятность инициации новых раундов репликации ДНК и деления клеток, тогда как трансформация интенсивно пролиферирующих, но корот-коживущих [«амплифицирующих») и других незрелых клеток обеспечивается, главным образом, приобретением ими способности неограниченно долго давать подобных себе потомки. При обоих этих сценариях возникает пул постоянно пролиферирующих бессмертных клеток - так называемых «стволовых клеток опухоли» [опухоль -инициирующих клеток), в которых накапливаются дополнительные генетические изменения, детерминирующие дальнейшую опухолевую прогрессию [1].
В данный момент общепризнанным является тот факт, что именно эпидермальные меланоциты [клетки эктодермального происхождения), являются источником как доброкачественных, так и злокачественных новообразований [2]. В таком случае, в процессе развития меланомы, зрелые, но мутировавшие меланоциты претерпевают несколько стадий де-дифференцировки [от доброкачественного невуса - к стадии метастазирующей меланомы) [3]. Альтернативная теория было предложена в Cramer S.F. 1984 году. Она учитывала возможную роль незрелых предшественников меланоцитов в этом процессе [4]. Впоследствии стало известно о присутствии незрелых меланоцитов в человеческой коже [5] и о существовании стволовых клеток в волосяных фолликулах млекопитающих [6]. Принимая во внимание растущий интерес к работам, учитывающим роль стволовых клеток к канцерогенезе [7, 8], исследователи решили более детально изучить различные клеточные популяции, выделенные из человеческой меланомы.
Целью работы James M.Grichnik было выявление таких кле-ток-предшественников в меланоме, а также изучение в них свойств, характерных для «нормальных» стволовых клеток. В процессе исследования было изучено 3 метастазирующих меланомных линии. Для выделения клеток-предшественников было использовано их свойство исключать ядерный краситель Hoechst 33342.
Существует мнение, что если мутация произошла в терминально дифференцированном меланоците, мутантная форма приобретет способность к более агрессивному клональному росту, а популяция будет гомогенна. Авторы выдвигают гипотезу о том, что мутация происходит именно в клетке-предшественнике, а не в терминально дифференцированном меланоците. При этом мутантная клетка-предшественник «будет пытаться» продолжить свой путь дифференцировки до тех пор, пока в ней не накопится достаточное количество генетических поломок для включения механизмов гибели.
Гипотеза находит свое подтверждение в результатах экспериментов, описанных в работе. Выбранные в качестве объектов 3 меланомные линии были способны стабильно поддерживать морфологическую гетерогенность в культуре - они
представляли собой мелкие овальные, веретеновидные, плоские полигональные, и крупные дендритные [отростча-тые) формы. Такая морфологическая гетерогенность сохранялась и после получения клонов от одной клетки. Это поддерживает идею о том, что в культуре меланомы присутствуют несколько форм мутировавших клеток, находящихся на разных стадиях «меланоцитарного дифферона». Мелкие клетки, исключающие ядерный краситель, давали начало большим клеточные формам с отростками и имели преимущество при экспансии в культуре. Именно такие крупные, отростчатые клеточные формы авторы называют терминально дифференцированными. Такие клетки выживали в культуре длительное время, но не пролиферировали, а пролиферативная активность сохранялась лишь у мелких клеток.
Гипотеза о существовании субпопуляции стволовых клеток в меланоме нашла подтверждение в работе другой группы, опубликованной в журнале Cancer Research. Авторы характеризуют такие клетки, как неприкрепляющи-еся к пластику и образующие сферы в процессе культивирования. После клонирования такие клетки из меланомы поддерживали свойства «стволовости». Они были способны к самообновлению и множественной дифференцировке в адипоциты, хондроциты, остеобласты, меланоциты. Адгезивная фракция, полученная из меланомы, представляет собой, как считают авторы, стадию прогрессии опухоли, демонстрирует веретеновидный и/или эпителиоидный мор-фо-фенотип и является более дифференцированной. На принадлежность этих СК к опухоли может также указывать экспрессия MCAM [молекулы адгезии) и Р3-интегрина, которые участвуют в инвазии и метастазировании. При трансплантации клетки сфероидов были более тумороген-ны, чем клетки адгезивной фракции.
Популяция, выделенная из меланомы и способная к формированию сфер охарактеризована впервые. Однако известно, что способность формировать сфероидные колонии в культуре характеризует стволовые клетки из различных нормальных и опухолевых тканей [10,11 ]. Клетки сфер, имеющие характеристики СК, были способны дифференцироваться в ткани мезенхимальной линии и в меланоциты возможно потому, что они имеют общий источник происхождения в эмбриогенезе - нервный гребень [12]. На это могут указывать и работы по нейрональной дифференцировке клеток меланомы, однако в них не упоминалось о формировании сфероидных колоний [13,14].
CD20 - антиген, характеризующий агрессивную меланому. Стволовые клетки меланомы были обнаружены как в CD20+, так и в CD20- субпопуляциях всех линий. Однако клетки CD20- фракции проявляли меньшую способность к мезенхимальным линиям дифференцировки. Авторы предлагают рассматривать моноклональные антитела к CD20 как потенциальный способ лечения меланом различных стадий.
Таким образом, двумя независимыми исследовательскими группами были выделены и охарактеризованы стволовые клетки меланомы. Эти данные поддерживают гипотезу развития меланомы из мутировавших опухоль-инициирующих клеток, обладающих свойствами стволовых. Поскольку такие клетки-предшественники опухоли способны давать
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 2(4), 2006
■■■ lililí
ш
Новости клеточных технологий
начало нескольким линиям дифференцировки, значит культура такой злокачественной линии должна быть гетерогенна. Предложенная теория также предполагает, что доброкачественный невус и злокачественная меланома происходят от одной мутировавшей СК. В подтверждение гипотезы присутствия в меланоме инициирующих клеток стоит упомянуть работу группы НосЬ^Ппдег по репрограммированию ядер меланомных клеток после их переноса в овоцит. Клетки эмбрионов давали начало линиям человеческих эмбриональных
стволовых клеток и дифференцировались в меланоциты, лимфоциты и фибробласты [9].
Стоит отметить, что в двух рассматриваемых работах исследовались различные меланомные линии. Более детальная характеристика и выявление особенностей СК меланомы с помошью более точных методов остается будущей задачей. При изучении генотипа или/и фенотипа таких клеток возможна разработка более селективных методов терапии этого заболевания.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Bennett D.C. Human melanocyte senescence and melanoma susceptibility genes. Oncogene 2003; 22: 3063-9.
2. Herlyn M., Thurin J., Balaban G. et al. Characteristics of cultured human melanocytes isolated from different stages of tumor progression. Cancer Res. 1985; 45: 5670-6.
3. Cramer S.F. The neoplastic development of malignant melanoma. A biological rationale. Am. J. Dermatopathol. 1984; 6: 299-308.
4. Grichnik J.M., Ali W.N., Burch J.A. et al. Kit expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J. Invest. Dermatol. 1996; 106: 967-71.
5. Nishimura E.K., Jordan S.A., Oshima H. et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature 2002; 416: 854-60.
6. Reya T., Morrison S.J., Clarke M.F., Weissman I.L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature 2001; 414:105-11.
7. Al-Hajj M., Wicha M.S., Benito-Hernandez A. et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003;
100: 3983-8.
8. Hochedlinger K., Blelloch R., Brennan C. et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes Dev. 2004; 18: 1875-85.
9. Singh S.K., Hawkins C., Clarke I.D. et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 2004; 432: 396-401.
10. Dontu G., Abdallah W.M., Foley J.M. et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 2003; 17: 1253-70.
11. Le Douarin N.M., Kalcheim C. (ed.). The neural crest. "Cambridge University Press” 1999, Cambridge (UK).
12. Fang D., Hallman J., Sangha N. et al. Expression of microtubule-associated protein 2 in benign and malignant melanocytes: implications for differentiation and progression of cutaneous melanoma. Am. J. Pathol. 2001; 158: 2107-15.
13. Brocker E.B., Magiera H., Herlyn M. Nerve growth and expression of receptors for nerve growth factor in tumors of melanocyte origin. J. Invest. Dermatol. 1991; 96: 662-5.
Подготовила B.C. Мелихова по материалам J. Invest. Dermatol. 2006; 126: 142, Cancer Res 2005; 65: 9328
Трансформация мезенхимальных (стромальных) прогениторных клеток костного мозга приводит к формированию саркомы Юинга
Одним из самых актуальных вопросов регенеративной клеточной медицины является изучение возможности канцерогенеза из «взрослых» стволовых клеток [СК]. Гипотеза образования злокачественных клеток подразумевает 2 возможных механизма: 1] прямой - из нормальных стволовых клеток ткани и прогениторов; 2] из опухолевых клеток имеющих свойства стволовых - так называемых опухоль инициирующих клеток [стволовых клеток опухоли] [1, 2]. Большинство исследователей, однако, считает что стволовые клетки опухоли имеют своё происхождение из нормальных взрослых СК различных тканей [1-4]. Механизмы образования раковых СК и участие нормальных стволовых и прогениторных клеток в канцерогенезе активно изучаются и до настоящего времени остаются загадкой [1-4].
Образование сарком семейства Ewing’s [саркомы Юинга -СЮ] связывают с рядом хромосомных аномалий, основным сигналом к возникновению которых являются нарушения, вызванные образованием белка слияния EWS-FLI-1 - продукта мутантного гена FLI-1 [5]. В исследовании группы Nicolo Riggi была поставлена цель выявить, трансформация каких именно СК может приводить к возникновению СЮ.
Для этого костномозговые мезенхимальные прогенитор-ные клетки [MPC: CD44+/Sca-1+/Thy-1+/CD117low/ CD13low/CD45-/CD11b-/Flk-1-), эмбриональные стволовые клетки [ESC) и спонтанно иммортализованные эмбриональные (STO) фибробласты мыши трансфецировались генетической конструкцией, содержащей мутантный ген FLI-1. Экспрессия белка EWS-FLI-1 проверялась в динамике через сутки после трансфекции и обнаруживалась во всех исследуемых клетках. На 14-й день экспрессия белка обнаруживалась лишь в мезенхимальных стромальных клетках (MPC) и сохранялась еще в течение нескольких недель.
Чтобы исследовать возможность образования опухоли, трансформированные MPC, ESC и клетки STO после 5 дней культивирования трансплантировали в иммунодефицитных (SCID) мышей. В результате было обнаружено, что только MPC(+EWS-FLI-1) могли давать начало СЮ. По мере развития опухоли фенотип клеток оставался постоянным [CD99 и NSE), а уровень экспрессии EWS-FLI-1 не менялся. Чтобы показать специфичность MPC к образованию СЮ, клетки были исследованы на способность образовывать другие виды опухолей. Для этого трансфецировали MPC рядом
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 2(4), 200G
