CC BY
86
УДК 579.64
Благова Д.К., Сарварова Е.Р., Хайруллин Р.М.
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа
E-mail: blagova_darya@mail.ru
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОФИТОВ МОРКОВИ (DAUCUS CAROTA L. VAR. SATIVUS)
Эндофитные бактерии были выделены из 44 поверхностно стерилизованных корнеплодов моркови. Двадцать пять изолятов из 63 различались по RAPD-профилю. Из них семь обладали антагонистической активностью в отношении грибов рода Fusarium, девять растворяли неорганические фосфаты и девять синтезировали ауксины от 1,59 до 15,38 мкг/мл. Восемь изолятов принадлежали к семейству Enterobacteriaceae (род Enterobacter и Pantoea), четыре - к роду Pseudomonas и один - к роду Bacillus.
Ключевые слова/ бактериальные эндофиты, PGPB, антагонистическая активность, ауксины, растворение фосфатов, сидерофоры.
Введение
В последнее десятилетие особое внимание микробиологов привлекают эндофитные бактерии, изолируемые из поверхностно стерилизованных (внутренних) растительных тканей. Растущий интерес к этим микроорганизмам связан не только с возможностью их использования в растениеводстве, но и в связи с распространением среди них возбудителей инфекционных болезней человека. Согласно определению Bai с соавторами [1] к эндофитам относятся микроорганизмы, колонизирующие внутренние растительные ткани, поддерживающие рост и развитие растений и не вызывающие у них болезней.
Среди эндофитов обнаружено большое количество штаммов, способных защищать растения от фитопатогенов, а так же положительно влиять на рост растений за счет синтеза ИУК, АЦК-деаминазы и растворения фосфатов [2], [3]. Инокуляция растений такими бактериями вызывает эффекты, сопоставимые с обработкой синтетическими стимуляторами роста, применением минеральных удобрений, а также средств химической защиты от патогенов [4], [5]. Поскольку свойства микроорганизмов, заселяющих ткани различных растений, могут сильно отличаться, представляет большой интерес изучение эндофитов, присутствующих в культурных растениях с целью их возможного последующего использования в биологических удобрениях и средствах защиты растений.
Целью работы являлось выделение бактериальных эндофитов из корнеплодов моркови, изучение их разнообразия и выявление таких хозяйственно-полезных признаков, как антагонистическая активность по отношению к фито-
патогенам, синтез ауксинов и сидерофоров и способность растворять неорганические фосфаты.
Материалы и методы
Технически зрелые (100 дней после посева) корнеплоды моркови сорта «Московская зимняя» отмывали от почвы, стерилизовали в 3% растворе гипохлорита натрия в течение получаса, затем промывали стерильной водой. После этого из центра верхней, средней и нижней частей корнеплода вырезали диски толщиной 2 см, выкладывали в чашки Петри с картофельно-глюкозным агаром и инкубировали трое суток при температуре 27оС. Всего было проанализировано 132 диска из 44 корнеплодов. Выросшие колонии изолятов суспендировали в стерильном растворе 0,15М NaCl и титровали до единичных колоний, из которых затем при помощи Chelix выделяли ДНК и проводили RAPD-PCR со случайно подобранным праймером Lmbd (GGG CGC TG).
Фунгистатическая активность изолятов бактерий в отношении фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum, F.avenaceum и Fsporotrichioides оценивалась методом двойной культуры [6]. Для проверки способности микроорганизмов синтезировать сидерофоры (низкомолекулярные органические вещества, способные образовывать стабильный комплекс с железом), использовали среду с хромазуролом [7]. Фосфат-мобилизирующая активность проверялась на среде Муромцева [8].
Для изучения способности микроорганизмов синтезировать ауксины их выращивали на среде DYGS с добавлением 1 мг/мл D,L-трипто-фана в течение 5 суток, после чего культуру центрифугировали 5 мин при 1300 об/мин, затем к супернатанту добавляли реактив Сальковско-го. Определение уровня ауксинов в супернатан-
Благова Д.К. и др.
Выделение и характеристика бактериальных эндофитов моркови..
те проводили колориметрическим методом по калибровочной кривой, построенной с использованием растворов ИУК с концентрацией 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 мкг/мл [9].
Для отдельных изолятов бактерий была проведена идентификация путем секвенирова-ния фрагментов гена 16S рРНК, амплифици-рованных при помощи праймеров DlongF (состав: CCC GGG ATC CAA GCT TAA GGA GGT GAT CCA GCC) и DlongR (состав: CCG AAT TCG ACA ACA GAG TTT GAT CCT GGC TCA G) и сравнения полученных последовательностей нуклеотидов с гомологичными из базы данных NCBI (blast.ncbi.nlm.nih.gov).
Результаты и обсуждение
Бактерии были обнаружены в тридцати семи корнеплодах из сорока четырех (84%). После инкубирования тканей растений на питательной среде было выделено 63 изолята бактерий, 20 из нижних, 23 из средних и 20 из верхних частей корнеплодов. Грибных эндофитов обнаружено не было. 25 изолятов различались по RAPD-профилю (рис 1). Они были использованы для дальнейших экспериментов.
Таблица 1. Ингибирование роста грибов различными бактериальными изолятами (%)
№ изолята Грибы
F.avenaceum F. oxysporum F. sporotrichioides
5 66 - 33
8 41 - 50
11 71 - 41
14 72 14 53
20 56 23 33
21 - 28 25
23 - 23 -
Одним из ключевых хозяйственно-полезных свойств эндофитов по отношению к растениям является их способность подавлять рост фитопа-тогенов. Семь из исследованных нами изолятов обладали антагонистической активностью по отношению к грибам рода Fusarium (табл. 1). Ингибирование роста F. avenaceum в двойной культуре составило 41-72%, F. oxysporum - 14-28%, F. sporotrichioides - 25-53%.
Синтез ауксинов, а также улучшение минерального питания растений повышением доступности неорганических фосфатов путем их солюбилизации в почве являются одними из свойств, обуславливающих ростостимулирую-щую способность эндофитов. Среди исследованных нами изолятов девять были способны растворять фосфаты, причем три из них так же синтезировали от 15,04 до 15,38 мкг/мл ауксинов (таб.2). В дальнейшем планируется изучить способность этих микроорганизмов непосредственно влиять на рост растений.
Нами были идентифицированы отдельные изоляты, обладающие хозяйственно-полезными признаками. Среди них восемь принадлежали к семейству Enterobacteriaceae (род Enterobacter и Pantoea), четыре - к роду Pseudomonas (табл. 2). Ранее энтеробактерии, способные стимулировать рост растений были обнаружены в кукурузе [10] и тополе [11]. Среди эндофитов с анагонистической активностью один изолят, выделяющий сидерофоры, был идентифицирован нами как Bacillus subtilis.
Заключение
Таким образом, среди исследованных эндо-фитов моркови нами было выявлено несколько изолятов, обладающих хозяйственно-полезными признаками. Большинство из них относилось к семейству энтеробактерий. В дальней-
Рисунок 1. Электрофоретические спектры RAPD-фрагментов эндофитов моркови
Естественные науки_
Таблица 2. Видовая принадлежность и характеристики отдельных эндофитов моркови
№ изолята Бактерии Антагонистическая активность Синтез сидерофоров Фосфатмобилизирующая активность Синтез ауксинов (мкг/мл)
2 Enterobacter sp. - - + -
5 Enterobacter aerogenes + - - 3,24
6 Не определен - - + 15,38
8 Bacillus subtilis + + - -
11 Не определен + - - -
12 Enterobacter sp. - - + 15,04
14 Enterobacter sp. + - + 1,59
15 Pseudomonas sp. - - + 6,44
17 Pseudomonas sp. - - - 2,10
18 Enterobacter cloacae - - + -
19 Enterobacter aerogenes - - + 15,17
20 Pseudomonas oryzihabitans + - + -
21 Enterobacter sp. + - - -
23 Pantoea sp. + - + 7,16
26 Pseudomonas sp. - - - 1,94
шем планируется изучение непосредственного устойчивость растений к болезням. влияния данных микроорганизмов на рост и 17.09.2014
Работа выполнена на основе ФЦП №14.604.21.0016
Список литературы:
1. Bai Y., Zhou X., Smith D.L. Enhanced soybean plant growth resulting from co inoculation of Bacillus strains with Bradyrhizobium japonicum. Crop science. 2003. 43 (5): 1774-1781.
2. Mitter B, Brader G., Afzal M. et al. Advances in elucidating beneficial interactions between plants, soil and bacteria. Adv Agron. 2013. 121: 381-445.
3. Dudeja S. S., Giri R. Beneficial properties, colonization, establishment and molecular diversity of endophytic bacteria in legumes and non legumes. African Journal of Microbiology Research. 2014. 8(15): 1562-1572.
4. Adesemoye A.O., Torbert H.A., Kloepper J.W. Plant growth-promoting rhizobacteria allow reduced application rates of chemical fertilizers. Microbial Ecology. 2009. 58 (4):921-929.
5. Sundaramoorthy S., Balabaskar P. Consortial effect of endophytic and plant growth promoting rhizobacteria for the management of early blight of tomato incited by Alternaria Solani. J Plant Pathol Microb. 2012. 3 (145): 1-4.
6. Whipps J.M. Effect of media on growth and interactions between a range of soil-borne glasshouse pathogens and antagonistic fungi. New Phytologyst. 1987. 107: 127-142.
7. Schwyn B., Neilands J.B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical biochemistry. 1987. 160 (1): 47-56.
8. Сэги Й. Методы почвенной микробиологии. М.: Колос, 1983. 162 с.
9. Yasmin F., Othman, R., Sijam K., Saad M. S. Characterization of beneficial properties of plant growth-promoting rhizobacteria isolated from sweet potato rhizosphere. African Journal of Microbiology Research. 2010. 3 (11): 815-821.
10. Ogbo F., Okonkwo J. Some Characteristics of a Plant Growth Promoting Enterobacter sp. Isolated from the Roots of Maize. Advances in Microbiology. 2012. 2 (3): 368-374
11. Taghavi S. et al. Genome sequence of the plant growth promoting endophytic bacterium Enterobacter sp. 638. PLoS genetics. 2010. 6 (5): e1000943.
Сведения об авторах:
Благова Дарья Константиновна, научный сотрудник лаборатории биохимии иммунитета растений Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, кандидат биологических наук, е-mail: blagova_darya@mail.ru Сарварова Елена Рафисовна, аспирант лаборатории биохимии иммунитета растений Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук,
е-mail: sarvarova_lena@mail.ru Хайруллин Рамиль Магзинурович, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии иммунитета растений Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, доктор биологических наук, профессор, е-mail: krm62@mail.ru 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71
