CC BY
120
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Известия ТСХА, выпуск 4, 2017 год
УДК 633.72:631.461.5
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА АЗОТФИКСИРУЮЩЕГО ШТАММА СД1 ИЗ ПОЧВЫ ЧАЙНОЙ ПЛАНТАЦИИ ПРОВИНЦИИ ФУ ТХО РЕСПУБЛИКИ ВЬЕТНАМ
НГУЕН ВАН ЖАНГ1, ВУ ТХИ ХЬЕН1, В.В. ПЫЛЬНЕВ2
(1 Вьетнамский национальный сельскохозяйственный университет;
2 РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева)
Целью исследований являлось определение состава штаммов азотфиксирующих бактерий в почве чайной плантации провинции Фу Тхо (Вьетнам) и выделение из них наиболее активного. Из различных образцов почв чайной плантации провинции Фу Тхо на безазотистой питательной среде Берка выделено более 12 штаммов азотфиксирующих бактерий. Исследуемые штаммы бактерий характеризовались различной степенью азотфиксирующей активности (от 0,605 до 5,486 мг/л). Из них штамм СД1 выделен как максимально высокоактивный. Концентрация фиксированного им азота достигла 5,468 мг/л. Исследования зависимости активности штамма СД1 от влияния температуры, рН, длительности культивирования, источников углерода питательной среды показали, что он хорошо развивается при температуре 25-35°С (концентрация ЫН4+ возросла с 4,485 до 5,487 мг/л), рН=6-8 (лучшее развитие при рН=7), на среде, содержащей сахарозу. Оптимальная температура роста штамма СД1 составляет 30-32°С. После 3 дней культивирования штамм СД1 достиг максимальной плотности (7,6106 клеток/мл). Таким образом, выявлено, что максимальная активность нитрогеназы достигается после 4 сут культивирования. Штамм СД1 обладает способностью синтезировать фитогормон ИУК. Максимальное количество ИУК, синтезируемое данным штаммом, достигло 11,25 мкг/мл после 3 сут инкубации. Азотфиксирующая активность штамма СД1 максимальна на 4 день культивирования. По совокупности культурально-морфологических признаков штамм СД1 согласно определителю Берги относится к роду Azotobacter.
Ключевые слова: Azotobacter &рр., фитогормон ИУК, азотфиксирующие микроорганизмы, нитрогеназа, чайная плантация, почва.
Введение
Микроорганизмы играют важную роль в биологических процессах круговорота элементов и веществ экосистем. Эти процессы прямо или косвенно влияют не только на состав и качество почвы, но и на сельскохозяйственные культуры. Поэтому ключевым условием поддержания жизни является обеспечение сбалансированной деятельности природных микробных сообществ.
Интенсификация промышленного и сельскохозяйственного производства, в том числе увеличение использования химических удобрений и пестицидов, оказывает
заметное негативное влияние на здоровье людей, загрязняет окружающую среду и подавляет жизнедеятельность микроорганизмов. Выходом из сложившейся ситуации является изменение стратегии сельскохозяйственного производства от глобальной «химизации» к повсеместной «биологизации». В связи с этим существенно возрастает роль физиологически значимых микроорганизмов.
Чайная плантация провинции Фу Тхо расположена на высоте 100 м над уровнем моря. Почва в основном фералитная, pH ее колеблется от 4,5 до 5,5. На этой почве целесообразно выращивать лесные растения. На участках с крутизной склона меньше 25 град. часто возделывают технические культуры, в том числе и чай [15].
Выращивание чая во многом зависит от почвенно-климатических условий плантации и технологии его возделывания. В отличие от других технических культур, у чая собирают почки и молодые листья. Сезон их сбора длится 9-10 мес. С целью повышения продуктивности растений производители используют большие дозы минеральных удобрений. Злоупотребление ими приводит к истощению питательных веществ почвы и повышению кислотности почвы [14]. К тому же чайные кусты часто выращивают на склонах холмов, где питательные вещества легко выщелачиваются. Поэтому урожайность чайных кустов в данной провинции недостаточно высока.
В почве существуют разнообразные группы значимых азотфиксирующих, фосфатмобилизующих и других микроорганизмов. Современная биотехнология рассматривает почву как банк при поиске культур микроорганизмов с любыми необходимыми свойствами. Некоторые изоляты, выделенные из ризосферы, обладают способностью колонизировать корни определенных видов растений. Причем гомологичные штаммы обладают большей специфичностью и более активно колонизируют корневую зону растений. Проблема поиска эффективных азотфиксирующих и фос-фатмобилизующих микроорганизмов весьма актуальна, поскольку они относятся к числу агрономически значимых групп.
Целью проводимых исследований являлось выделение высокоэффективно азотфиксирующих форм микроорганизмов из почвы чайной плантации провинции Фу Тхо.
Материал и методика
Образцы почвы из разных мест чайной плантации отбирались в стерильные полиэтиленовые мешки по методу Г.С. Посыпанова [1].
Питательная среда для выделения и культивирования азотфиксирующих бактерий: 20 г сахарозы; 0,64 г K2HPO4; 0,16 г KH2PO4; 0,2 г MgSO47H2O; 0,2 г NaCl; 0,05 г CaSO42H2O; 5 мл Na2MoO42H2O (0,05%); 5мл FeSO47H2O (0,3%) 15 г агар; 1000 мл H2O; pH 7,3 [13].
Для выделения азотфиксирующих бактерий использовали образцы почвы, ото-браные из чайных холмов провинции Фу Тхо по методу Eichorst et al. [5] и Г.С. Посыпанова [1]. Образцы почвы собраны с глубины 5-20 см. Из образцов готовили разведения 10-1 (15 г почвы на 90 мл дистиллированной стерильной воды) и перемешивали на качалке в течение 2 ч. В дальнейшем проводили десятикратные разведения, переносили 1 мл 10-1 разведения в пробирку, содержающую 9 мл стерилизованную воду с помощью стерилизованной пипетки, что дало 10-2 разведения. Таким способом была приготовлена серия разведений до 10-8. Разбавление приготовлено в асептических условиях. Посев проводили из разведений 10-5 и 10-6 на чашки Петри, содержащие среду Берка (Burk free Nitrogen). Объем посевного материала - 1 мл суспензии.
Каждое разведение высевали в четырехкратной повторности. Чашки культивировали при температуре 30°С в течение 5-7 сут. В не содержащей азот среде Берка (Burk free Nitrogen medium) могли вырасти только колонии азотфиксирующих бактерий.
Азотфиксирующую активность выделенных штаммов определяли на основе измерения концентрации свободной NH4+ в питательной среде. Штаммы микроорганизмов культивировали в жидкой не содержащей азот среде Берка, при температуре 30°С. После 72 ч культивирования питательную среду центрифугировали со скоростью 10000 об./мин при температуре 4°С в течение 10 мин. Отбирали надосадочную жидкость и определяли концентрацию NH4+ по методу Нэсслера [7].
Для определения влияния длительности культивирования (или инкубации) на развитие и азотфиксирующую активность выделенных штаммов исследуемые штаммы микроорганизмов культивировали в жидкой не содержащей азот среде Берка на качалке при 180 об./мин. Через каждые 24 ч жидкость центрифугировали со скоростью 10000 об./мин при 4°С в течение 10 мин. Для определения концентрации аммиака брали надосадочную жидкость по методу Нэсслера [7]. Одновременно брали каплю культуральной жидкости и в разных концентрациях высевали в чашки Петри с твердой средой Берка. Объем колонии (в колониеобразующих единицах - КОЕ, или Colony Forming Unit - CFU) подсчитывали по методике Pepper и Gerba [11].
Способность синтезировать фитогормон ИУК выделенных штаммов определяли по методике Glickmann и Desaux [6]. Калибровочную кривую для определения ИУК построили на основе содержания данного гормона в тестированном растворе с различными концентрациями: 0; 5; 10; 20; 30 и 40 мг/л. Штаммы микробов культивировали в жидкой не содержащей азот среде Берка на качалке при 180 об./мин с добавлением L-триптофана. После 72 ч инкубации культуральную жидкость центрифугировали со скоростью 10000 об./мин при 4°С в течение 10 мин. Брали 1 мл надосадочную жидкость, добавляли пробный раствор Salkowski (15 мл FeCl3 0,5M, 300 мл H2SO4 98%, 500 мл H2O); раствор хорошо взбалтывали и оставляли в темноте на 30 мин, после чего измеряли при Х=530 нм. Результаты сравнивались с калибровочной кривой.
Результаты и обсуждения
Из образцов почвы, отобранных из разных мест чайной плантации, в не содержащей азот среде Берка было выделено 12 штаммов бактерий. Все штаммы колонии беловатые, полупрозрачные, приподнятые, слизистые. Края и поверхность колонии - гладкие. Клетки в основном имеют форму от палочковидной до сферической, грам-отрицательные (рис. 1).
а) б)
Рис. 1. Колонии (а) и формы клетки (б) штамма СД1
Рис. 2. Азотфиксирующая активность веделенных штаммов
Была показана различная азотфиксирующая активность выделенных штаммов (рис. 2). Концентрация аммиака у них колебалась от 0,605 до 5,486 мг/л. По сообщению Kizilkaya [8], разные штаммы Azotobacter, выделенные из почвы, способны фиксировать азот в количестве 3,5-29,35 мкг/мл. Nguyen Thi Phuong Oanh и др. [10], а также Cao Ngoc Biep и Nguyen Thanh Düng [4] приводят сведения об активности нитрогеназы некоторых азотфиксирующих штаммов бактерий почвы и ризосферы. Количество фиксированного этими штаммами азота колеблется от 3,20 до 4,67 мг/л. Выделенные штаммы характеризуются сходной азотфиксирующей активностью. Особенно сильно на активность почвенных микроорганизмов влияет рН. Из всех исследованных нами штаммов СД1 фиксирует максимальное количество азота. Концентрация аммиака в питательной среде через сутки достигла 5,486 мг/л. Именно из-за этого данный штамм был выбран для проведения последующих экспериментов.
Влияние условий культивирования на азотфиксирующую активность выделенных штаммов
Влияние температуры и рН
Микроорганизмы находятся в непрерывном взаимодействии с внешней средой и подвергаются ее влиянию. В одних случаях внешняя среда может способствовать лучшему развитию микроорганизмов, в других - подавлять их жизнедеятельность. Поэтому, изучая микробиологические процессы, необходимо учитывать два момента: во-первых, какие изменения вызывают микроорганизмы в окружающей среде; во-вторых, какое влияние оказывает внешняя среда на развитие микроорганизмов.
Температура внешней среды является мощным фактором воздействия на организмы, который определяет не только интенсивность их развития, но и саму возможность. Принято различать три основные температурные точки, имеющие значение для развития микробов: оптимум, минимум и максимум.
Температура инкубации существенно повлияла на азотфиксирующую способность штамма СД1. Штамм СД1 хорошо фиксирует азот в температурном диа-
а)
б)
■5. 5,0
и
£
^ 4,0
я 3,0
я -
а
Ё 2,0 щ
я
| 1,0
0,0
30 35 40
Температура, ^
Рис. 3. Влияние температуры (а) и pH (б) на азотфиксирующую активность штамма СД1
пазоне 25-35°С. При этом количество фиксированного азота изменялось от 4,485 до 5,487 мг/л соответственно. Азотфиксирующая активность штамма СД1 уменьшается при повышении температуры. Штамм СД1 относится к группе мезофильных микроорганизмов. Этот результат аналогичен результатам Sharma и др. [12] при изучении штаммов азотобактера.
Количество азота, фиксируемого штаммом СД1, зависит от значения рН. Этот штамм может фиксировать азот в диапазоне рН=5-9 (рис. 3). При рН=7 количество фиксированного азота максимально (5,339 мг/л). Когда 5>рН>9, азотфиксирующая способность штамма СД1 не проявляется. При рН=5 и рН=9 количество фиксированного азота, соответственно, достигает 0,083 и 0,69 мг/л. Штамм СД1 активен в нейтральной или слабо щелочной среде.
Рис. 4. Влияние источников углерода на азотфиксирующую активность штамма СД1
5,0
Влияние углеродных источников
Микроорганизмы могут использовать различные источники углерода для своего роста. Тем не менее, для развития микробов подходят не все источники углерода. Поэтому для их развития необходимо подбирать подходящий источник углерода. При культивировании штамма СД1 в среде Берка с различными источниками углерода отмечено, что он может использовать все четыре источника углерода (рис. 4). Тем не менее, азотфиксирующая активность штамма СД1 сильнее всего проявляется в среде, содержащей сахарозу. Если в качестве углерода использованы маннит и мальтоза, штамм СД1 показывает низкую активность азотфиксации (количество фиксированного азота равно 0,33 и 0,32 мг/л соответственно).
Stella и Suhaimi [13] также отмечают, что источником подходящего для развития и повышения активности нитрогеназы азотфиксирующих бактерий углерода является сахароза. Ahmad и др. [2] подтверждают, что Azotobacter spp. лучше развиваются на среде, содержащей сахарозу, и хуже - на среде с маннитом.
Влияние длительности культивирования
Плотность клеток штамма СД1 достигает максимального уровня (7,6*106 кл./мл) после 3 дней инкубации. После этого постепенно уменьшается и на 5 день культивирования плотность клеток остается только 3*106 кл./мл (рис. 5). Изменение плотности клеток штамма СД1 не совпадает с изменением концентрации NH4+ в куль-туральной среде. Концетрация NH4+ достигает максимума после 4 дней инкубации (7,8 мг/л). Затем она постепенно снижается и через 7 дней культивирования наблюдается ее значительное сокращение до 2,649 мг/л. Это можно объяснить тем, что питательные вещества в среде исчерпываются и микробы достигают стационарной фазы. Возможно также, что в среде накапливаются вторичные метаболиты и активность нитрогеназы может ингибироваться высокой концентрацией NH4+ в среде. В работах Nguyen Thi Phuong Oanh и др. [10], выделенные из почвы азотфиксирующие штаммы дали максимальное количество NH4+ после 4 сут инкубации, затем активность азотфиксации заметно снижается.
Рис. 5. Влияние длительности культивирования на рост и азотфиксирующую активность штамма СД1: 1 - концентрация N^+1 2 - плотность клеток
Синтез фитогормона ИУК (IAA phytohormone)
Результаты экспериментов показывают, что количество ИУК, синтезируемой штаммом СД1, достигло 11,25 мг/мл после 3 сут инкубации. Это значение невысоко, так как по данным Nguyen Thi Phuang Oanh и др. [10], азотфиксирую-щие микроорганизмы, выделенные из почвы, синтезируют ИУК с концентрацией от 24,96 до 39,26 мг/мл, а штамм CTB3 достиг максимального количества ИУК после 8 дней культивирования (41,38 мкг/мл). Nguyen Kim Anh и др. [9] выделили штамм BK-5 из почвы Нгу Хань Шон - Дананг, способствующий синтезу 4,3 мг ИУК/мл.
Выводы
1. Выделенный из почвы чайной плантации провинции Фу Тхо штамм СД1 обладает относительно высокой азотофиксирующей активностью. Клетки штамма СД1 - грамотрицательные, подвижные. Колонии, как правило, гладкие, беловатые, непрозрачные, низко выпуклые и слизистые. Штамм СД1 может использовать разные источники углерода. Температура развития штамма - 25-40°С, оптимальная температура роста - 30-32°С, оптимальные значения pH для азотфиксации находятся в интервале 6-9, что характерно для рода Azotobacter [3].
2. Штамм СД1 хорошо развивается и фиксирует азот при температуре 30°С и pH=7. На жидкой, не содержащей азот среде Берк, штамм СД1 достиг максимальной плотности клеток после 3 сут инкубации. Азотфиксирующая активность штамма СД1 максимальна на 4 день культивирования. Максимальное синтезируемое штаммом СД1 количество ИУК достигло 11,25 мкг/мл после 3 сут инкубации.
Библиографический список
1. Посыпанов Г.С. Методы изучения биологической фиксации азота воздуха. М.: Агропромиздат, 1991. 300 с.
2. Ahmad F., Ahmad I., Khan M.S. Screening of free-living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities. Microbiological research, 2008. 163(2). P.173-181.
3. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. Vol. 2: The Proteobacteria, Part B: The Gammaproteobacteria. Genus III. Azotobacter. P. 384-402.
4. Cao Ngoc Diep va Nguyen Thanh Dung. Bac tinh vi khuan noi sinh phan lap trong cay khom trong tren dat phen Vinh Thuan, tinh Kien Giang // Tap chi Khoa hoc. 2010. Vol. 15a. P. 54-63.
5. Eichorst S.A., Breznak J.A., Schmidt T.M. Isolation and characterization of soil bacteria that define Terriglobus gen. nov., in the phylum Acidobacteria // Applied and environmental microbiology. 2007. Vol. 73(8). P. 2708-2717.
6. Glickmann E., Dessaux Y. A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria // Applied and environmental microbiology. 1995. Vol. 61(2). P. 793-796.
7. Jeffery G.H., Baset, J., Mendham J., Denney R.C. Vogel's textbook of quantitative chemical analysis. 5th ed. Longman Scientific &Technical, 1989. 877 p.
8. Kizilkaya R. Nitrogen fixation capacity of Azotobacter spp. strains isolated from soils in different ecosystems and relationship between them and the microbiological properties of soils // J. Environ Biol. 2009. Vol. 30 (1). P. 73-82.
9. Nguyen Kim Anh, Pham Thi Ngoc Anh, Le Thi Thúy Hoa, Nguyen Thi Quynh Nhw, Däu Thi Tinh. Phan lap va tuyen chon mot so chüng vi khuän Azotobacter có hoat tính nitrogenaza va sinh tong hop IAA (indol axetic axit) tu dät thon Binh Ky- Hoa Quy- Ngü Hánh Son- // Da Näng. Tuyen tap báo cáo «Hoi nghi sinh vien nghien cúu khoa hoc». lan thú 6. Dai hoc Da Näng. 2008. P. 300-304.
10. Nguyén Thi Phwang Oanh, Trän Búu Minh va Nguyén Thi Pha. Phan lap va tuyen chon mot so dong vi khuän dät vúng re lúa có khá näng co dinh nitrogen va tong hop IAA // Tap chí Khoa hoc Truong Dai hoc Can Tho, Phan B: Nong nghiep, Thüy sán va Cong nghe sinh hoc: 26. 2013. P. 82-88.
11. Pepper I.L., Gerba C.P. Environmental Microbiology: A Laboratory Manual. 2th ed. 2004. 226 p.
12. Sharma T., Kumar N., Rai N. Isolation, Screening and Characterization of PGPR Isolates from Rhizosphere of Rice Plants in Kashipur Region (Tarai region) // Biotechnology International. Vol. 5(3). P. 69-84.
13. Stell M., Suhaimi M. Selection of suitable growth medium for free-living diazotrophs isolated from compost // J. Trop. Agric. and Fd. Sc. 2010. Vol. 38(2). P. 211-219.
14. Phan da yeu to cho che VietGAP||Vien Nong hóa - Tho nhuong. URL: http://sfri. org.vn/TinTucChiTiet.aspx?MenuId=3&Id=59 (дата доступа: 10.04.2016).
15. Giói thieu khái quát ve tính Phú Tho// Cong thong tin dien tu Tính doan Phú Tho. URL: http://tinhdoanphutho.vn/gioithieu.aspx?id=1 (дата доступа: 10.04.2016).
CHARACTERISTICS OF NITROGEN FIXATION BACTERIAL STRAIN SD1 FROM TEA PLANTATION SOIL OF THE PHU THO PROVINCE (THE REPUBLIC OF VIETNAM)
NGUEN VAN GIANG1, VU THI HIEN1, V.V. PYLNEV2
(1 Vietnam National University of Agriculture;
2 Russian Timiryazev State Agrarian University)
The research focuses on the determination of nitrogen-fixing bacterial strains composition in tea plantation soil of the Phu Tho province and detection of the most active one. The authors have determined 12 bacterial strains from the various soil samples on Burk nitrogen-free medium obtained from a tea plantation of the Phu Tho province. The tested strains were characterized by varying degrees of nitrogenase activity (nitrogen-fixed concentration from 0,605 to 5,486 mg/l). The SD1 strain singled out of these is characterized a highly active one because the concentration of nitrogen fixed by it reached 5,468 mg/l. The studies of the effect of temperature, pH, cultivation period, and the carbon source of the nutrient medium on the activity of the SD1 strain have shown that the isolated strain grows well at a temperature of25-35°C (NH4+ concentration increasedfrom 4,485 to 5,487 mg/l), pH 6-8 (the best development at pH 7), on a medium containing sucrose. Optimum temperatures for the SD1 strain growth are in the range of 30-32°C. After three days of cultivation the SD1 strain reached maximal density (7,6*10 cells/ml). The study has revealed that the maximum nitrogenase activity of the SD1 strain is obtained after 4 days of culturing. Besides nitrogen fixation, the SD1 strain is also capable of producing phytohormone IAA. The maximum amount of IAA synthesized by this strain reached 11,25 ng/ml after 3 days of incubation.
Nitrogen-fixing activity of SD1 strain reaches its peak on the 4th day of culturing. Basing on culture-morphological characteristics, the SD1 strain can be classified as the Azotobacter genus (according to the Bergey's Manual of Systematic Bacteriology).
Key words: Azotobacter spp; IAA phytohormone; nitrogen-fixing microorganisms; nitrogenase; tea plantation, soil.
References
1. Posypanov G.S. Metody izucheniya biologicheskoy fiksatsii azota vozdukha [Methods for studying the biological fixation of air nitrogen]. M.: Agropromizdat, 1991. 300 p.
2. Ahmad F., Ahmad I., Khan M.S. Screening of free-living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities. Microbiological research, 2008. 163(2). P.173-181.
3. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. Vol. 2: The Proteobacteria, Part B: The Gammaproteobacteria. Genus III. Azotobacter. P. 384-402.
4. Cao Ngoc Diep va Nguyen Thanh Düng. Bäc tính vi khuan noi sinh phan lap trong cäy khóm tröng tren dät phen Vinh Thuan, tinh Kien Giang // Tap chí Khoa hoc. 2010. Vol. 15a. P. 54-63.
5. Eichorst S.A., Breznak J.A., Schmidt T.M. Isolation and characterization of soil bacteria that define Terriglobus gen. nov., in the phylum Acidobacteria // Applied and environmental microbiology. 2007. Vol. 73(8). P. 2708-2717.
6. Glickmann E., Dessaux Y. A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria // Applied and environmental microbiology. 1995. Vol. 61(2). P. 793-796.
7. Jeffery G.H., Baset, J., Mendham J., Denney R.C. Vogel's textbook of quantitative chemical analysis. 5th ed. Longman Scientific &Technical, 1989. 877 p.
8. Kizilkaya R. Nitrogen fixation capacity of Azotobacter spp. strains isolated from soils in different ecosystems and relationship between them and the microbiological properties of soils // J. Environ Biol. 2009. Vol. 30 (1). P. 73-82.
9. Nguyen Kim Anh, Pham Thi Ngoc Anh, Le Thi Thúy Hoa, Nguyen Thi Quynh Nhu, Däu Thi Tinh. Phän lap va tuyen chon mot so chúng vi khuan Azotobacter có hoat tính nitrogenaza va sinh töng hop IAA (indol axetic axit) tu dät thön Binh Ky- Hoa Quy- Ngü Hánh Son- // Ba Näng. Tuyen tap báo cáo «Hoi nghi sinh vien nghien cúu khoa hoc». lan thú 6. Bai hoc Ba Näng. 2008. P. 300-304..
10. Nguyen Thi Phuang^ Oanh, Trán Búu Minh va Nguyen Thi Pha. Phän lap va tuyen chon mot so dong vi khuan dät vúng re lúa có khá näng co dinh nitrogen va töng hop IAA // Tap chí Khoa hoc Truong Bai hoc Can Tho, Phan B: Nöng nghiep, Thúy sán va Cöng nghe sinh hoc: 26. 2013. P. 82-88.
11. Pepper I.L., Gerba C.P. Environmental Microbiology: A Laboratory Manual. 2th ed. 2004. 226 p.
12. Sharma T., Kumar N., Rai N. Isolation, Screening and Characterization of PGPR Isolates from Rhizosphere of Rice Plants in Kashipur Region (Tarai region) // Biotechnology International. Vol. 5(3). P. 69-84.
13. Stell M., SuhaimiM. Selection of suitable growth medium for free-living diazotrophs isolated from compost // J. Trop. Agric. and Fd. Sc. 2010. Vol. 38(2). P. 211-219.
14. Phän da yeu to cho che VietGAP||Vien Nöng hóa - Thö nhuöng. Available at: http://sfri.org.vn/TinTucChiTiet.aspx?MenuId=3&Id=59 (date of access: 10.04.2016.)
15. Giói thieu khái quát ve tính Phú Tho// Cong thong tin dien tu Tính doán Phú Tho. Available at: http://tinhdoanphutho.vn/gioithieu.aspx?id=1 (date of access: 10.04.2016).
Нгуен Ван Жанг - к. с.-х. н., преп. кафедры микробиологической биотехнологии Вьетнамского национального сельскохозяйственного университета (Вьетнам, г. Ханой; e-mail: nvgiang@vnua.edu.vn).
Ву Тхи Хьен - маг. наук, м. н. с. кафедры микробиологической биотехнологии Вьетнамского национального сельскохозяйственного университета (Вьетнам, г. Ханой; e-mail: vuhiencnsha@gmail.com).
Пыльнев Владимир Валентинович - д. б. н., проф. кафедры генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49; тел.: (499) 976-12-72; e-mail: selection@timacad.ru).
Nguyen Van Zhang - PhD (Ag), Lecturer of the Department of Microbiological Biotechnology, Vietnam National Agricultural University (Vietnam, Hanoi, e-mail: nvgiang@vnua.edu.vn).
Wu Thi Hyen - MSc, Junior Researcher of the Department of Microbiological Biotechnology, Vietnam National Agricultural University (Vietnam, Hanoi, e-mail: vuhiencnsha@gmail.com).
Vladimir V. Pylnev - DSc (Bio), Prof. of the Department of Genetics, Biotechnology, Selection and Seed Growing, Russian Timiryazev State Agrarian University (127550, Moscow, Timiryazevskaya str., 49; phone: +7 (499) 976-12-72; e-mail: selection@timacad.ru).
