CC BY
22Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 25 (64). 2012. № 3. С. 89-94.
УДК 579.64:632.937.3
ВЫДЕЛЕНИЕ И БИОТЕСТИРОВАНИЕ АКТИВНЫХ ШТАММОВ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS BERLINER ИЗ НАСЕКОМЫХ ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ КРЫМА
Кузнецова Л.Н.
Институт сельского хозяйства Крыма НААН, пгт Гвардейское, Украина
E-mail: solanum@ukr.net
Из насекомых крымских популяций выделен ряд штаммов B. thuringiensis, среди которых наибольшую энтомоцидную активность проявил штамм B. thuringiensis var. thuringiensis 0371, изолированный из гусениц американской белой бабочки. При обработке листьев картофеля бактериальной культурой в течение 5 суток наступает 100% гибель личинок колорадского жука. Штамм является технологичным и может быть основой для биопрепаратов, используемых для защиты сельскохозяйственных растений от листогрызущих вредителей.
Ключевые слова: Bacillus thuringiensis, штамм, энтомопатоген, эффективность.
ВВЕДЕНИЕ
Стремление к сохранению биосферы от загрязнения обусловливает интерес к поиску нехимических средств защиты растений от вредных насекомых. Большинство биопрепаратов, выпускаемых сегодня в мире, изготавливаются на основе энтомопатогенных штаммов B. thuringiensis. Вирулентность этого возбудителя — одно из решающих условий эффективности, а значит и перспективности использования данных бактерий в защите растений [1]. B. thuringiensis является естественным обитателем биоценозов. Однако большая численность насекомых, их естественная устойчивость к инфекции, сложные биоценотические связи, влияние абиотических факторов способствуют образованию новых активных форм микроорганизмов [2]. Поэтому поиск высокоактивных и технологичных для производства биопрепаратов штаммов B. thuringiensis всегда является актуальным.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили в отделе микробиологии Института сельского хозяйства Крыма НААН. Энтомопатогенные бактерии выделяли из насекомых, собранных в природных популяциях по методике Л.И. Бурцевой [3]. Способность выделенных бактерий к образованию спор и белковых кристаллов эндотоксина определяли микроскопированием [4].
Идентификацию выделенных штаммов проводили согласно схемы идентификации А. Barjac, А. Bonnefoi и А. Lysenko [5, 6]. В качестве эталонных
были взяты штаммы следующих серотипов: B. thuringiensis var. thuringiensis 994, B. thuringiensis var. kurstaki 0293, B. thuringiensis var. dendrolimus 942, B. thuringiensis var. morrisoni 109-С и B. thuringiensis var. darmstadiens 820.
Энтомоцидное действие новых штаммов изучали в лабораторных условиях по методике А.Я. Лесковой [4]. Биотест — личинки колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata, Coleoptera) младшего возраста. Опыты проводили в 3-х повторностях в стеклянных сосудах, куда помещали насекомых и, обработанные жидкими культурами штаммов, листья картофеля. Обработанным кормом личинки питались 3 суток, после чего корм меняли на необработанный. В качестве эталона использовали жидкую споровую культуру производственного штамма B. thuringiensis var. thuringiensis 994.
Жидкие споровые культуры получали при культивировании бактерий в питательной среде на технологических качалках (220 об. / мин.) в течение 48 часов при температуре 28-300 С [7].
Технологичность штаммов определяли по методике С. Д. Перта [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенных исследований в природных популяциях Крыма собрано 68 погибших и больных насекомых - представителей отрядов Coleoptera, Lepidoptera, Diptera. Микробиологическим анализом собранного материала выделено 28 штаммов микроорганизмов, 4 из которых по первоначальным признакам споро- и кристаллообразования отнесены к бактериям группы B. thuringiensis (табл.1).
Таблица 1
Характеристика штаммов B. thuringiensis, выделенных из насекомых
Штамм Стация сбора Объект сбора Состояние насекомого
0363 приусадебный участок, капуста капустная совка (Mamestra brassicae L.) труп имаго
0371 лесополоса, клен американская белая бабочка (Hyphantria cunea Drury) трупы гусениц младших возрастов
0379 поле, картофель колорадський жук (Leptinotarsa decemlineata Say) трупы и инфецированные гусеницы старших возрастов
0411 лесополоса, абрикос кольчатый шелкопряд (Malacosoma neustria L.) трупы личинок старших возрастов
Для идентификации новых выделенных штаммов изучали их морфологические и физиолого-биохимические свойства, а также способность к продуцированию термостабильного экзотоксина.
Морфологию колоний и клеток наблюдали при выращивании бактерий на мясопептонном агаре (МПА). Культуры определены как быстрорастущие. Колонии на поверхности среды появлялись на вторые-третьи сутки, имели круглую или неправильную форму с зубчатой границей, вязкие по консистенции, диаметром в среднем 5-12 мм. Рельеф колоний плоский, поверхность матовая, серовато-кофейного цвета с более светлой ареолой.
Бактериальные клетки - грамположительные палочки размером 0,3-1,2 мкм, подвижные, благодаря наличию жгутиков (перитрихи). На стадии вегетативного роста образуют цепочки (от 6 - 8 до 10 -12 клеток в цепочке в зависимости от штамма). Споры и кристаллы в клетках расположены субтерминально.
На твердых и жидких средах штаммы выделенных В. thuringiensis растут в пределах 20-45 °С, температурный оптимум 26-30 °С. Рост бактерий наблюдали в диапазоне рН 6,0-8,6, а оптимальной является реакция среды 6,9-7,2.
При культивировании исследуемых штаммов на диагностических средах показано, что в процессе роста бактерии способны образовывать ацетил-метил-карбинол (АМК) на средах, с пептоном и глюкозой и лецитиназу, на средах, содержащих лецитин (табл. 2).
Таблица 2
Физиолого-биохимические свойства штаммов Bacillus thuringiensis, _выделенных из насекомых природных популяций Крыма_
Штамм B. thuringiensis Образование Гидролиз Усвоение
АМК Лецитиназы Уреазы Вуали Пигмента Крахмала Желатины Сахарозы Маннозы Глюкозы Лактозы
994 (var. thuringiensis) + + - +++ - ++ ++ + + + -
0293 (var. kurstaki) + + ++ - - ++ ++ - - + -
942 (var. dendrolimus) + + - - - + +++ - - + -
109-C (var. morrisoni) + - - + - + + + - + -
820 (var. darmstadiens) + - - - - ++ +++ - - + -
0363 + + - +++ - ++ +++ + + + -
0371 + + - ++ - ++ +++ + + + -
0379 + + - +++ - + ++ + + + -
0411 + + - +++ - ++ + + + + -
Примечание. Условные обозначения: Образование АМК, лецитиназы; образование уреазы, вуали, пигмента; усвоение сахаров: + реакция положительная, - реакция отрицательная. Гидролиз крахмала: -гидролиз отсутствует, + зона гидролиза 2-3 мм, + + зона гидролиза 5-6 мм. Протеолиз желатина: + растворения 1/3 колонки, + + растворения 2/3 столбика и + + + полное растворение, - реакция отрицательная.
Бактерии проявляют способность к гидролитическому расщеплению крахмала. Зона гидролиза составляет от 2,2 до 3,8 мм. В качестве источника углерода усваивают сахарозу, глюкозу и маннозу, обладают протеолитической активностью, которая проявляется в разрежении желатины. Бактерии не образуют уреазы и пигментов. На мясопептонном бульоне образуют вуаль.
Биотест Musca domestica L. выявил способность новых штаммов к продуцированию экзотоксина.
По исследованным морфологическим и физиолого-биохимическим характеристикам выделенные штаммы 0361, 0371, 0379 и 0411, согласно схемы идентификации А. Barjac, А. Bonnefoi и А. Lysenko, отнесены к бактериям группы B. thuringiensis var. thuringiensis.
Биотестирование идентифицированных штаммов B. thuringiensis на личинках колорадского жука показало, что наиболее высокими энтомопатогенными свойствами характеризуются штаммы 0371 и 0411. Гибель насекомых в опытах с кормом, обработанным жидкими споровыми культурами таких штаммов, превышала гибель насекомых в опытах с кормом, обработанным культурой эталонного штамма 994, как по количеству погибших насекомых, так и по времени (табл. 3).
Таблица 3
Энтомоцидная активность штаммов В. thuringiensis, выделенных из природных популяций Крыма, против личинок колорадского жука ( Ь1-2 )
Штамм B. thuringiensis Гибель личинок на сутки, %
3 5 7 10
Контроль(вода) 1,7±0,01 6,7±0,2 8,3±1,6 8,3±1,6
994 (эталон) 5,0±0,2 81,7±1,6 91,7±4,4 98,3±1,6
0363 41,7±1,4 70,0±1,6 95,0±3,2 95,0±3,2
0371 31,7±0,6 100
0379 8,0±0,3 48,0±0,7 65,3±0,3 76,0±0,1
0411 44,0±0,2 96,7±3,2 100
Под влиянием штамма 0371 полную гибель личинок наблюдали на 5-тые суток, под влиянием штамма 0411 - на 7-е сутки. В варианте же с эталонным штаммом 994 за аналогичный период погибало соответственно 81,7% и 91,7% насекомых, причем, 100%-ная гибель личинок под действием штамма 994 не была отмечена и на 10-е сутки опыта.
Как менее активные энтомопатогены определены штаммы 0363 и 0379, под действием которых процент погибших насекомых не превышал соответственно 95,0% и 76,0% на 10-е сутки.
Выделенный новый штамм B. thuringiensis var. thuringiensis 0371, обладающий высоким энтомопатогенным действием против личинок колорадского жука, был исследован на технологичность. Культивирование бактерий проводили в дрожжеполисахаридной питательной среде в качалочных колбах с объёмом среды 50 мл.
Показано, что для бактерий на стадии вегетативных клеток характерна динамика роста и развития, которая состоит из 4-х классических фаз: Lag-фазы, фазы ускорения роста, экспоненциальной и стационарной фаз. Lag-фаза проходила в течение 0,5-1,5 часов, а последующие фазы развития вегетативных клеток - до 1014 часов. Титр жидких культур за этот период достигал 0,5-0,8 млрд. колониеобразующих единиц в 1 мл. Через 12-16 часов культивирования в вегетативных клетках отмечали начало активного формирования белковых кристаллов и спорогенных зон. Массовую споруляцию наблюдали через 20-24 часа. Весь период культивирования составлял 45-48 часов и заканчивался полным освобождением спор из спорангиев (табл. 4).
Таблица 4
Технологические показатели развития бактерий штамма В. thuringiensis 0371 _при культивировании в дрожжеполисахаридной среде_
Этап развития бактерий Период наблюдения (часов)
Начало образования спорогенных зон 14-16
Массовая споруляция 20-24
10% свободных спор 28-30
Споры и кристаллы в свободном состоянии 45-48
Технологические показатели развития бактерий, представленные в таблице 4, характеризуют штамм 0371 как технологичный [9].
ВЫВОД
Таким образом, полученные в ходе исследований данные свидетельствуют, что штамм B. thuringiensis var. thuringiensis 0371, выделенный из гусениц американской белой бабочки крымской популяции, обладает высоким энтомопатогенным действием против личинок колорадского жука, является технологичным, и, следовательно, может быть основой для разработки нового биопрепарата для защиты сельскохозяйственных растений от листогрызущих вредителей.
Список литературы
1. Лескова А.Я. Энтомопатогенные бактерии и их роль в защите растений / А.Я. Лескова, Л.М. Рыбина - Новосибирск, 1987. - С.31-42.
2. Kalmakoff J. Ecologicol approaches to the use of microbial pathogens in Bect. control. / J. Kalmakoff, J. Miles // Bio. Bciehce - 1980. - V.30. - №5.- p.334-347.
3. Бурцева Л. И. Методы выделения и биотестирования энтомопатогенных бактерий. // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты. [под ред. В.В. Глупова. ] / Л. И. Бурцева М. : Круглый год, 2001. - 736 с.
4. Лескова А.Я. Идентификация культур Bacillus thuringiensis и оценка их патогенных свойств (Методические указания) / Лескова А. Я. - Л. : - 1984. - С. 17-19.
5. Lysenko О. The taxonomy of entomogenons bacteria / О. Lysenko - Insect. Pathology. - New York, acad. Pres.- 1963. - V. 2. ( Ed. Steinhause ) - P. 638-661.
6. Barjac de H. Classification of strains of Bacillus thuringiensis a Kuj to their differention / H. de Barjac, A. Bonnefoi // J. Insect. Pathol. - 1963. - №. 11. - P. 333.
7. Евлахова А.А. Болезни вредных насекомых. Методы учета, сбора, хранения насекомых, пораженных болезнями. // Евлахова А. А., Швецова О.И. - М., 1965. - С. 51.
8. Перт С. Д. Основи культивирования микроорганизмов и клеток/ Перт С.Д. - М: Мир, 1978. - 332 с.
9. Яворська Г.В. Промислова Мжробюлопя / Яворська Г.В., Гудзь С.П., Гнатуш С.О. - Львiв, 2008. -256 с.
Кузнецова Л.М. Видшення та бютестування активних шта]шв ентомопатогених бактерш Bacillus thuringiensis Berliner з комах природних популяцш Криму/ Л.М. Кузнецова // Вчеш записки Тавршського национального ушверситету iiw. В.1. Вернадського. Серiя „Бюлопя, xii^". - 2012. -Т. 25 (64), № 3. - С. 89-94.
З комах кримських популяцш видшено ряд штамiв B. thuringiensis, серед яких найбшьшу ентомоцидну актившсть виявив штам B. thuringiensis var. thuringiensis 0371, iзольований з гусениць американського бшого метелика. За обробки листя картоплi бактерiальною культурою протягом 5 дiб настае 100% загибель личинок колорадського жука. Штам е технолопчним i може бути основою для бюпрепараив, що використовуються для захисту сшьськогосподарських рослин вщ листогризучих шюдниюв. Ключовi слова: Bacillus thuringiensis, штам, ентамопатоген, ефектившсть.
Kusnezova L.N. The influence of Bacillus thuringiensis on the quantity of the phylloplana epiphytic microflorae and its fungustatic action against the activators of illnesses in the potato agrocenosis / L.N. Kusnezova // Scientific Notes of Taurida V.I. Vernadsky National University. - Series: Biology, chemistry. - 2012. - Vol. 25 (64), No 3. - Р. 89-94.
The several strains of B. thuringiensis were selected from the Crimean insect populations. The strain B. thuringiensis var. thuringiensis 0371, isolated from Hyphantria cunea Drury caterpillars showed the most insecticidal activity. While processing the potato leaves with bacterial culture we observed the 100% mortality of potato beetle larvae for 5 days. The strain is a technological one and it can be the base for biopreparation for plant protection against leaf-cutting depredators. Keywords: Bacillus thuringiensis, strain, entomopathogens, efficiency.
Поступила в редакцию 19.09.2012 г.
