CC BY
169
УДК 547.963.3
ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВЫСОКОПОЛИМЕРНОЙ РНК ИЗ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ
Татьяна Витальевна ЯМКОВАЯ1, Виталий Иванович ЯМКОВОЙ2, Лев Евгеньевич ПАНИН3
1 ООО «Виталанг»
630055, г. Новосибирск, ул. Рубиновая, 4-128
2 ФГБОУ ВПО Новосибирский государственный педагогический университет 630126, г. Новосибирск, ул. Вилюйская, 28
3 ФГБУ НИИ биохимии СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
Разработан новый способ получения амфифильной высокополимерной РНК из сухих пекарских дрожжей. Основной эффект удешевления и безотходности производства достигают путем использования в качестве литического агента пищевого детергента - олеиновой кислоты в концентрации 1-2 %. В сравнении с известными аналогами, характеризующимися применением высокотоксичного литического агента - 2-этилгек-сановой кислоты, предложенный способ не требует глубокой очистки конечного продукта. Внесение сухих дрожжей в крутой кипяток раствора литического агента без их предварительного замачивания позволяет подавить активность лизосомальных рибонуклеаз. Безотходность производства заключается в том, что одновременно с высокополимерной РНК получают концентрат кормового белка, низкомолекулярную РНК и природные олигорибонуклеотиды. Экспериментальная проверка противовирусной активности амфифильной высокополимерной РНК проведена на беспородных мышах, зараженных вирусом эктромелии. Показано, что внутримышечное введение препарата мышам в лечебной схеме вызывает выраженную защиту от 10 полулетальных доз (LD50) вируса эктромелии, составляющую в зависимости от дозы от 28,6 до 47,6 %. Введение препарата в профилактической схеме приводит к более значительной защите мышей от инфицирования. Протективное действие препарата носит дозозависимый характер: максимальный эффект наблюдается при дозе 1,0 мг/кг массы тела, в этом случае количество выживших животных в профилактической схеме составляет 61,9 % (в контроле 19,1 %).
Ключевые слова: дрожжи, олеиновая кислота, высокополимерная РНК, вирус эктромелии, противовирусные свойства.
Дрожжевая РНК представляет собой смесь полирибонуклеотидов разных молекулярных масс и включает в себя мРНК, рРНК, тРНК, а также ряд минорных компонентов и, вероятно, фрагменты перечисленных соединений разной длины. Существует препарат высокополимерной дрожжевой РНК с фирменным названием «Полирибонат». Он биологически активен -например, является специфическим стимулятором биосинтеза белка в кроветворных и им-мунокомпетентных органах [1]. Этот препарат обладает противовирусными свойствами, стимулирует гемопоэз, является иммуномодулято-ром и адъювантом; в последнее время широко используется в ветеринарии [2]. Натриевая соль
низкополимерной дрожжевой РНК - «Нукле-инат натрия» - давно применяется в медицине при лечении большого круга заболеваний [3]. Однако этот препарат вводится пациентам в граммовых количествах всегда перорально и механизм его действия включает, скорее всего, поставку мономеров для синтеза эндогенных нуклеиновых кислот [3]. Механизм действия высокополимерной дрожжевой РНК принципиально иной. Она гораздо менее токсична, чем низкополимерная, и вводится животным в миллиграммовых количествах путем внутривенных инъекций, что приводит к избирательной индукции синтеза некоторых белков, например, гемоглобина [4]. В качестве индук-
Ямковая Т.В. - к.б.н., e-mail: yam_tv@mail.ru
Ямковой В.И. - д.б.н., проф. кафедры химии, e-mail: vitalang2@mail.ru Панин Л.Е. - д.м.н., проф., академик РАМН, директор
тора интерферона используется двуспиральная РНК - «Ридостин», получаемая из некоторых штаммов дрожжей [5]. Последние данные по медицинскому применению РНК приведены в работах [6, 7]. Мономеры РНК в виде нуклео-зидов и 5'-мононуклеотидов имеют самостоятельное значение и могут служить исходными соединениями для синтеза олигонуклеотидов, нуклеозид-5"-трифосфатов и некоторых лекарственных препаратов [3]. В бывшем СССР годовое производство дрожжевой РНК измерялось тоннами [8]. В настоящее время в России РНК и препараты из нее вырабатываются в меньшем количестве. Что касается существующей технологии получения наиболее ценной с медицинской точки зрения высокополимерной РНК, то она далека от совершенства. Так, при получении «Полирибоната» используется редкий и высокотоксичный литический агент - 2-этилгексановая кислота, что требует глубокой очистки конечного продукта. Эта технология не экономична, многостадийна и практически не масштабируема.
Целью настоящего исследования является совершенствование способа выделения высокополимерной РНК: сокращение стадийности производства, снижение себестоимости конечного продукта, достижение безотходности и экологической чистоты производства и исследование противовирусных свойств полученной высокополимерной РНК.
Прототипом был выбран метод Дэвиса и Аллена, которые впервые для высаливания РНК из раствора применили NaCl [9]. В качестве объекта противовирусных испытаний был выбран вирус оспы мышей (эктромелии).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В работе были использованы сухие пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae, Новосибирский дрожжевой завод) с содержанием влаги ~7,4 %, олеиновая кислота (ЗАО «Купав-нареактив», марки «ч»), NaCl (ФГУП комбината «СИБСОЛЬ», г. Усолье-Сибирское), 96%-й этанол (ОАО «Спиртовый комбинат», г. Мариинск), додецилсульфат натрия (ДДС-Na) хроматогра-фически чистый (НПФ «ДИА-ФАРМ», г. Белгород), сефароза 4В («Pharmacia», Швеция), контрольный образец высокополимерной дрожжевой РНК с молекулярным распределением 100-500 нуклеотидов, полученный из НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Бердск); NaOH, НС1, трихлоруксусная (ТХУ) и гексановая кислоты марки «ч» отечественного производства. Для
приготовления растворов использовали дистиллированную воду.
Оптическую плотность растворов в ультрафиолетовой области спектра измеряли в 1 см прямоугольных кварцевых кюветах на спектрофотометре СФ-26 (ЛОМО, Россия).
Содержание кислоторастворимой фракции (КРФ) в РНК определяли модифицированным методом [10]. Для этого 2 мл водного раствора РНК с концентрацией ~60 D260, ед./мл вносили в центрифужную пробирку на 10 мл, добавляли туда же 2 мл 10%-го раствора ТХУ, компоненты в пробирке перемешивали и ставили в ледяную баню на 30 мин, затем центрифугировали (3000 g, 5 мин, температура комнатная). Содержание КРФ в супернатанте определяли по его оптической плотности при 260 нм. Гиперхром-ный эффект не учитывали.
Прирост КРФ определяли, измеряя содержание ее в водном растворе РНК с концентрацией ~ 60 D260, ед./мл до и после инкубации в течение 24 ч при температуре 20-25 °С.
Гель-фильтрацию РНК на сефарозе 4В проводили по методу [10].
Выделение РНК и концентрата кормового белка из пекарских дрожжей. Экстракция РНК. 300 г сухих пекарских дрожжей суспендировали порциями (первые порции по щепотке, первые 2-3 щепотки за несколько секунд до закипания) в течение 3-6 мин в 5 л высокой кастрюле в 3 л кипящей дистиллированной воды, содержащей 20 мл 2,5 М №ОН, оттитрованного 50,3 мл олеиновой кислоты. Температура суспензии не опускалась ниже 98 °С. Суспензию кипятили 40 мин при 98-100 °С, периодически перемешивая. Через 10, 20 и 30 мин после суспендирования последней порции дрожжей в кипящую суспензию добавляли 3 раза по 10 мл 2,5 М №ОН. По окончании экстракции кастрюлю ставили в раковину, суспензию охлаждали до 20-30 °С в 3 сменах холодной воды в течение ~20 мин и затем центрифугировали на центрифуге S70D фирмы <^апе12к1», Германия (3000-3200 g, 10 мин, температура комнатная).
Сбор концентрата кормового белка и высаливание высокополимерной РНК хлористым натрием. Супернатант (~1,7 л) сливали в стеклянную емкость на 3 л, а плотный осадок дрожжевого шлама, собирающийся на дне центрифужных стаканов и содержащий до 70 % денатурированного белка, собирали и сушили открытым способом при 58-62 °С. В суперна-тант добавляли 351 г №С1 и свежую дистиллированную воду до 2 л. Суспензию интенсивно перемешивали до полного растворения соли и
оставляли при комнатной температуре на 2024 ч для формирования осадка.
Промывка высоленной высокополимерной РНК 3 М раствором NaCl и 96%-м этанолом. Высоленный осадок-шрот, содержащий высокополимерную РНК, отделяли от супернатан-та центрифугированием (3000-3200 g, 20 мин, температура комнатная). Супернатант (~2 л) осторожно декантировали (осадок скользкий и держится слабо), осадок-шрот промывали
2 порциями по 0,6 л 3 М раствора NaCl и 5 порциями по 150 мл 96%-го этанола; при этом шрот диспергировали стеклянной палочкой в
3 М растворе NaCl минимум 10 мин, а в 96%-м этаноле минимум 5 мин, затем осаждали центрифугированием (3000-3200 g, 20 мин в случае 3 М раствора NaCl и 2 мин в случае этанола, температура комнатная). При промывке шрота
3 М раствором NaCl супернатант удаляли водоструйным насосом или грушей, так как на этой стадии осадок-шрот еще очень скользкий и при простой декантации «плывет». Серый рыхлый надосадочный гель удаляли по возможности тоже. Промытый шрот сушили на воздухе в течение 2-3 сут до отсутствия запаха спирта.
Регенерация этанола и осаждение из отходов 3 М раствора NaCl низкополимерной РНК соляной кислотой. Отработанный спирт регенерировали двойной перегонкой (возврат 80-90 %). Содержащуюся же в супернатанте (~2 л) после выделения высокополимерной РНК низкополимерную РНК осаждали добавлением
4 мл концентрированной HCl. Сформировавшийся в течение 2 сут при комнатной температуре осадок низкополимерной РНК осаждали центрифугированием (3000-3200 g, 10 мин, температура комнатная), промывали 2 порциями по 200 мл 96%-го этанола и сушили на воздухе при комнатной температуре до отсутствия запаха HCl.
Выделение из сухого шрота чистой высокополимерной РНК. Чистую высокополимерную РНК выделяли по мере необходимости из сухого шрота экстракцией дистиллированной водой (время экстракции 1-2 ч при периодическом перемешивании). Экстракт осветляли центрифугированием (3000-3200 g, 10 мин, температура комнатная), разливали в виалы по 1,5 мл (30 мг РНК), замораживали и лиофилизовали. Далее виалы закупоривали резиновыми пробками и завальцовывали алюминиевыми колпачками, после чего прогревали их в суховоздушном сушильном шкафу при 110 °С в течение 1 ч. Получался готовый к биологическим и доклиническим испытаниям стерильный препарат (предполагаемое рыночное название - Виталанг-2).
Животные. Для анализа биологической активности полученного препарата использовали здоровых половозрелых животных - беспородных белых мышей обоего пола массой 14-16 г, полученных из питомника лабораторных животных ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Все эксперименты проводились в соответствии с [11].
В эксперименте было использовано 168 мышей, из них 126 животных - в опыте (18 групп по 7 мышей в группе) и 42 - в контроле (6 групп по 7 мышей в группе).
Животных заражали вирусом эктромелии, штамм К-1, полученным из отдела коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и наработанным на перевиваемой клеточной линии Vero (клетки почки зеленой мартышки) с титром 9,33 х 105 БОЕ/мл.
Препарат Виталанг-2 в день проведения эксперимента растворяли в стерильном физиологическом растворе (ФР), встряхивая 15-30 мин.
Испытание противовирусной активности препарата Виталанг-2 в отношении вируса эктромелии (профилактическая схема). Препарат Виталанг-2 вводили мышам внутримышечно трехкратно в течение дня с интервалом в 4 ч (11.00, 15.00 и 19.00) в суммарной дозе 0,1 мг на 1 кг массы тела животного (3 группы по 7 мышей в каждой), 0,5 мг/кг (3 группы по 7 мышей в каждой) и 1,0 мг/кг (3 группы по 7 мышей в каждой) в объеме 200 мкл за одно введение. В качестве отрицательного контроля использовали 3 группы по 7 мышей, которым внутримышечно вводили ФР в объеме 200 мкл за одно введение три раза в течение дня в те же сроки, что и в опыте. Через 1 ч после третьего введения всех препаратов (20.00) животных заражали интраназально под эфирным наркозом летальной дозой (10 LD50, содержащих 2,57 lg БОЕ) вируса эктромелии в объеме 40 мкл/мышь. Гибель животных учитывали ежедневно в течение последующих 16 дней, оценивали процент гибели, коэффициент защиты и среднюю продолжительность жизни. За максимальную величину продолжительности жизни выживших животных принимали 16 сут, т. е. следующий день после прекращения гибели инфицированных мышей. Коэффициент защиты рассчитывали по формуле: % гибели в контроле - % гибели в опыте (табл. 1).
Испытание противовирусной активности препарата Виталанг-2 в отношении вируса эктромелии (лечебная схема). Мышей опытных и контрольных групп инфицировали интрана-зально под эфирным наркозом летальной дозой (10 LD50, содержащих 2,57 lg БОЕ) вируса эктромелии в объеме 40 мкл на 1 мышь (10.00). Че-
СП §
ь m н m л сг о О
<: х
н
О
0J
м
м о
Таблица 1
Изучение выживаемости в экспериментальных группах белых беспородных мышей, получавших Виталанг-2, при заражении вирусом эктромелии К-1 в дозе 10 ЛД50 (профилактическая схема)
Группа мышей Количество погибших мышей по суткам после заражения вирусом эктромелии (количество; % оставшихся в живых) Число и % выживших Число и % павших СПЖ (сут) КЗ
1 сут 2 сут 3 сут 4 сут 5 сут 6 сут 7 сут 8 сут 9 сут 10 сут 11 сут 12 сут 13 сут 14 сут 15 сут 16 сут
Виталанг-2 0,1 мг/кг, и = 21 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 3(18; 85,7%) 6(12; 57,1%) 0(12; 57,1%) 0(12; 57,1%) 2(10; 47,6%) 0(10; 47,6%) 1(9; 42,9%) 0(9; 42,9%) 0(9; 42,9%) 9; 42,9% 12; 57,1% 12,38 ± 0,16 23,8%
Виталанг-2 0,5 мг/кг, и = 21 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 2(19; 90,5%) 0(19; 90,5%) 2(17; 80,9%) 0(17; 80,9%) 4(13; 61,9%) 0(13; 61,9%) 2(11; 52,4%) 0(11; 52,4%) 0(11; 52,4%) 11; 52,4% 10; 47,6% 13,71 ± 0,58* 33,3%
Виталанг-2 1,0 мг/кг, и = 21 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 3(18; 85,7%) 3(15; 71,4%) 0(15; 71,4%) 0(15; 71,4%) 0(15; 71,4%) 0(15; 71,4%) 2(13; 61,9%) 0(13; 61,9%) 0(13; 61,9%) 13; 61,9%) 8; 38,1% 13,67 ± 0,22* 42,8%
Контроль, и = 21 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 3(18; 85,7%) 2(16; 76,2%) 0(16; 76,2%) 0(16; 76,2%) 2(14; 66,7%) 0(14; 66,7%) 10(4; 19,1%) 0(4; 19,1%) 0(4; 19,1%) 4; 19,1% 17; 80,9% 12,76 ± 0,22
Примечание. Здесь и в гибели (животных) в опыте
табл. 2 СПЖ - средняя продолжительность жизни, М± т\ КЗ (коэффициент защиты) = % гибели животных в контроле (без препарата) - % (с препаратом); * - отличие от величины СПЖ в контроле статистически значимо при р < 0,05.
Таблица 2
Изучение выживаемости в экспериментальных группах белых беспородных мышей, получавших Виталанг-2, при заражении вирусом эктромелии К-1 в дозе 10 ЛД50 (лечебная схема)
Группа мышей Количество погибших мышей по суткам после заражения вирусом эктромелии (количество; % оставшихся в живых) Число и % выживших Число и % павших СПЖ (сут) КЗ
1 сут 2 сут 3 сут 4 сут 5 сут 6 сут 7 сут 8 сут 9 сут 10 сут 11 сут 12 сут 13 сут 14 сут 15 сут 16 сут
Виталанг-2 0,1 мг/кг, и = 21 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 2(19; 90,5%) 0(19; 90,5%) 5(14; 66,7%) 3(11; 52,4%) 0;(11; 52,4%) 2(9; 42,9%) 0(9; 42,9%) 3(6; 28,6%) 0(6; 28,6%) 0(6; 28,6%) 6; 28,6% 15; 71,4% 11,95 ± 1,43 9,5%
Виталанг-2 0,5 мг/кг, и = 21 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 7(14; 66,7%) 3(11; 52,4%) 0(11; 52,4%) 1(10; 47,6%) 0(10; 47,6%) 0(10; 47,6%) 2(8; 38,1%) 0(8; 38,1%) 8; 38,1% 13; 61,9% 12,52 ± 0,58* 19,0%
Виталанг-2 1,0 мг/кг, и = 21 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 6(15; 71,4%) 2(13; 61,9%) 0(13; 61,9%) 0(13; 61,9%) 3(10; 47,6%) 0(10; 47,6%) 0(10; 47,6%) 0(10; 47,6%) 0(10; 47,6%) 10; 47,6% 11; 52,4% 12,47 ± 0,41* 28,5%
Контроль, и = 21 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 0(21; 100%) 5(17; 80,9%) 4(13; 61,9%) 6(7; 33,3%) 0(7; 33,3%) 3(4; 19,1%) 0(4; 19,1%) 0(4; 19,1%) 0(4; 19,1%) 0(4; 19,1%) 4; 19,1% 17; 80,9% 10,86 ± 0,49
CD
со
рез 1 ч (11.00) животным вводили препарат Ви-таланг-2 внутримышечно и затем еще дважды в течение дня с интервалом в 4 ч (15.00 и 19.00) в суммарной дозе 0,1 мг на 1 кг массы тела животного (3 группы по 7 мышей в каждой), 0,5 мг/кг (3 группы по 7 мышей в каждой) и 1,0 мг/кг (3 группы по 7 мышей в каждой) в объеме 200 мкл за одно введение. В качестве отрицательного контроля использовали 3 группы по 7 инфицированных мышей, которым через 1 ч внутримышечно вводили ФР в объеме 200 мкл за одно введение и затем еще дважды в течение дня с интервалом в 4 ч (15.00 и 19.00) в том же объеме. Гибель животных учитывали ежедневно в течение последующих 16 дней, оценивали процент гибели, коэффициент защиты и среднюю продолжительность жизни (табл. 2).
Испытания противовирусной активности препарата Виталанга-2 в отношении вируса гриппа птиц А/сЫскеп/Ки^ап/05/2005 (И5Ы1) (профилактическая схема). Препарат Виталанг-
2 вводили мышам внутримышечно трехкратно в течение дня с интервалом в 4 ч (11.00, 15.00 и 19.00) в суммарной дозе 0,1 мг на 1 кг массы тела животного (3 группы по 7 мышей в каждой), 0,5 мг/кг (3 группы по 7 мышей в каждой), 1,0 мг/кг (3 группы по 7 мышей в каждой) в объеме 200 мкл за одно введение. В качестве положительного контроля использовали
3 группы по 7 мышей, которым один раз в день в течение 5 дней перорально вводили противогриппозный препарат озельтамивир (Тамифлю) в дозе 5 мг на 1 кг массы тела мыши в объеме 200 мкл за одно введение. В качестве отрицательного контроля использовали 3 группы по 7 мышей, которым внутримышечно вводили физиологический раствор в объеме 200 мкл за одно введение три раза в течение дня в те же сроки, что и в опыте. Через 1 ч после третьего введения всех препаратов животных заражали интраназально под эфирным наркозом летальной дозой (10 LD50, содержащих 1,49 ^ ТЦД50) вируса гриппа птиц А/Н5№ в объеме 40 мкл/ мышь. Гибель животных учитывали ежедневно в течение последующих 16 дней, оценивали процент гибели, коэффициент защиты и среднюю продолжительность жизни.
Статистическая обработка. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ «^аЙБЙса 6.0», используя ¿-критерий Стъюдента, а также и-кри-терий Манна-Уитни. Достоверность различий средних величин устанавливали с помощью критерия Стъюдента при р < 0,05.
При проведении статистической обработки результатов исследования для количественных
показателей вычисляли среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего арифметического значения (т) и представляли в виде М± т, различия между группами оценивали с помощью критерия Стъюдента; при анализе качественных показателей использовали точный критерий Фишера; достоверными считались результаты при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Наиболее дешевым и доступным сырьем для промышленного выделения высокополимерной РНК являются дрожжи. Самые продуктивные из них - сухие пекарские (табл. 3). Принципиальным моментом при работе с дрожжами является выбор поверхностно-активного вещества (ПАВ) для лизиса их хитиновых клеточных стенок. Крестфилд и соавт. использовали с этой целью ДДС-№ [12]. Однако выделенная с его помощью высокополимерная РНК содержит примесные высокомолекулярные ассоциаты РНК с белками и полисахаридами [10], которые сильно искажают биологические свойства РНК [4]. Альтернативой ДДС-№ могут служить щелочные соли жирных кислот. При получении высокополимерной РНК - «Полирибоната» - в качестве лизирующего агента была использована 2-этилгексановая кислота. Как ветеринарный противовирусный препарат, «Полирибонат»
Таблица 3
Относительный выход высокополимерной РНК из разных дрожжей
Дрожжи Относительный выход, %
Сухие пекарские дрожжи (Новосибирский дрожжевой завод, ГОСТ 28483-90) 100,0
Прессованные пекарские дрожжи (Новосибирский дрожжевой завод, ТУ 9182-001-00367108-04) 55,6
Прессованные пекарские дрожжи (Новосибирский дрожжевой завод, ГОСТ 171-81) 29,1
Кормовая смесь «СКД-плюс» (Мариинский спиртовой комбинат, ТУ 9296-06100334586-2003) < 0,4
Отработанные пивные дрожжи (ОАО «Родник», г. Новосибирск) 43,0
Отработанные пивные дрожжи (ООО «Тинькофф», г. Новосибирск) 36,9
Отработанные пивные дрожжи (ООО «Петровичъ», г. Ставрополь) 18,7
Отработанные пивные дрожжи (Завод «Балтика», г. Новосибирск) < 3,4
Таблица 4
Относительный выход высокополимерной РНК из пекарских дрожжей при использовании для их лизиса различных детергентов
Детергент Относительный выход, %
Олеиновая кислота 100,0
ДДС-Ж 99,6
Гексановая кислота 21,5
вполне заслуженно занял соответствующий сегмент рынка. Однако для медицинских целей клетки дрожжей желательно лизировать пищевой жирной кислотой. Мы выбрали для этого незаменимый продукт питания - олеиновую кислоту. С ней легче работать, чем с гидрофобными насыщенными жирными кислотами. При ее использовании достигается максимальный выход целевого продукта (табл. 4). Кроме того, олеиновая кислота производится в промышленных масштабах, доступна и стоит недорого.
Для экстракции РНК мы предприняли попытку определить оптимальную концентрацию ПАВ. По экономическим причинам она не должна быть большой. Однако меньше критической точки мицеллообразования добавлять ПАВ тоже нецелесообразно. Принимая во внимание эти требования, в настоящей работе концентрацию олеиновой кислоты при лизисе дрожжей варьировали от 0,75 до 3,8 %. В контрольном эксперименте кипятили дрожжи в дистиллированной воде. Как видно из табл. 5, лизис дрожжей с использованием олеиновой кислоты следует проводить при ее начальной концентрации 1,5 %. Без ПАВ выход высокополимерной РНК ничтожно мал. Оптимальное время экстракции РНК из клеток дрожжей олеиновой кислотой было определено нами в кинетическом эксперименте (рис. 1). Как видно из рисунка, оно равно 40 мин, т. е. совпадает с таковым для ДДС-№ [10].
Следующей процедурой, требующей оптимизации, была очистка перешедшей в раствор РНК от фрагментов разрушенных клеток дрожжей. Одним из способов разделения таких суспензий, широко применяемых на практике, является седиментация. Мы варьировали условия осаждения при седиментации лизата дрожжей от 1000 до 17000 g и нашли, что 3000 g вполне достаточно для образования плотного осадка дрожжевого шлама и количественного отделения от него экстракта РНК. Хороший результат может быть получен также путем простого от-
Таблица 5
Зависимость выхода высокополимерной РНК от концентрации использованной для лизиса дрожжей олеиновой кислоты
Концентрация олеиновой кислоты, % 0 0,75 1,5 2,5 3,8
Относительный выход высокополимерной РНК, % 0,97 79,7 100,0 86,8 83,3
стаивания, но в этом случае время седиментации следует увеличить с 10 мин до 1 сут.
Что касается высаливания высокополимерной РНК из экстракта хлористым натрием и промывки осадка-шрота 3 М раствором №С1 и этанолом, то при выполнении этих процедур мы использовали лучшие методические находки способа [4]. В частности, все операции проводили при комнатной температуре. Заменили только отстаивание на низкоскоростное центрифугирование.
Готовый к биологическим и доклиническим испытаниям препарат Виталанг-2 получали стерилизацией путем прогревания в сухо-воздушном сушильном шкафу в течение 1 ч при 110 °С. При снижении температуры ниже 100 °С и времени прогревания менее 50 мин стерильность не достигалась, а при увеличении температуры выше 120 °С и времени прогревания более 70 мин начиналась деградация РНК. Альтернативный способ стерилизации полученной в настоящей работе высокополимерной РНК был разработан нами потому, что через
Рис. 1. Кинетика экстракции РНК из клеток пекарских дрожжей (температура +100 °С, концентрация олеиновой кислоты 1,5 %). По оси ординат — концентрация РНК, перешедшей из клеток в раствор
п-1-г
7 9 11 13 Номер фракции
1 I I I I I 7 8 10 12 14 16 18 20
Номер фракции
Рис. 2. Гель-хроматография в одинаковых условиях на Сефарозе 4В: а — образца высокополимерной РНК, выделенного из пекарских дрожжей предлагаемым способом, б — контрольного образца высокополимерной дрожжевой РНК с молекулярным распределением 100—500 нуклеотидов
стерилизующие мембраны ее вязкий раствор не проходит. Как видно из рис. 2, это связано с тем, что молекулярная масса нашей высокополимерной РНК значительно превышает таковую контрольного образца высокополимерной дрожжевой РНК с молекулярным распределением 100-500 нуклеотидов.
Основные характеристики 6 образцов препарата Виталанг-2, приготовленных для доклинических испытаний, приведены в табл. 6. Здесь же следует отметить, что препарат Виталанг-2 обладает амфифильными свойствами: растворимость в воде - удовлетворительная (если относительно гидрофильный Полирибонат растворяется в воде в течение нескольких секунд, то наш амфифильный препарат - только через 15-120 мин при периодическом перемешивании), водный раствор мылкий, нерастворенные крупинки скользкие. Для сравнения, согласно ТУ 9291-002-44040845-2004 для Полирибоната сорта А: весовая экстинкция, D260, ед./мг > 16; содержание КРФ, % < 3; спектральные отноше-
ния: D230 / D260 - данных нет; D250 / D260 - 0,860,95; D280 / D260 - 0,44-0,50. Для Полирибоната сорта В весовая экстинкция, D260, ед./мг > 14.
Выход из 300 г сухих дрожжей ценного сопутствующего продукта - концентрата кормового белка с примесью олеиновой кислоты -250-270 г, низкополимерной РНК - до 2,4 г. Последняя в 3 М №С1 при комнатной температуре находится в растворе, из которого мы осаждали ее соляной кислотой (табл. 7).
Полученный в настоящей работе с помощью олеиновой кислоты препарат высокополимерной дрожжевой РНК биологически активен и малотоксичен (LD50 > 2 г/кг). Его противовирусные свойства подтверждены патентом [13] и экспериментами с вирусом эктромелии.
В связи с тем что в настоящее время нет ни одного коммерческого противовирусного препарата в отношении поксвирусов, в данных экспериментах не было использовано положительного контроля, а в качестве отрицательного контроля использовали ФР. Достоверное преиму-
Таблица 6
Результаты 6 стандартных выделений с помощью олеиновой кислоты высокополимерной РНК
из пекарских дрожжей
№ опыта Выход высокополимерной РНК, г Весовая экстинкция, D260, ед./мг Содержание КРФ, % Прирост КРФ, % Спектральные отношения
^30^260 ^50^260 ^80^260
1 8,6 17,7 2,33 0,16 0,39 0,89 0,49
2 8,2 17,6 2,32 0,11 0,41 0,91 0,51
3 8,1 18,2 2,20 0,12 0,40 0,91 0,52
4 8,5 18,3 2,25 0,12 0,41 0,90 0,52
5 9,3 17,9 2,21 0,11 0,40 0,90 0,51
6 8,9 17,0 2,33 0,12 0,41 0,91 0,51
Среднее 8,6 ± 0,7 17,8 ± 0,8 2,27 ± 0,07 0,12 ± 0,04 0,40 ± 0,01 0,90 ± 0,01 0,51 ± 0,02
Примечание. В эксперимент брали по 300 г сухой биомассы дрожжей.
Таблица 7
Зависимость выхода низкополимерной РНК от количества концентрированной соляной кислоты,
добавленной к 2 л ее раствора в 3 М ЫаС1
Количество добавленной HCl, мл 2 4 8 20 40 80
Относительный выход низкополимерной РНК, % 20,2 100 64,3 18,2 13,3 7,3
щество по количеству выживших животных по сравнению с контролем (19,1 % при профилактической и лечебной схемах) наблюдалось как в группах, получавших Виталанг-2 до заражения, так и в группах, получавших этот препарат после заражения мышей летальной дозой (10 LD50) вируса эктромелии. В данных экспериментах защитный эффект зависел от дозы Виталан-га-2 (количество выживших мышей составило 28,6, 38,1 и 47,6 % при использовании лечебной схемы и 42,9, 52,4 и 61,9 % при использовании профилактической схемы при дозах препарата 0,1; 0,5 и 1,0 мг на 1 кг массы тела животного соответственно). Средняя продолжительность жизни при заражении мышей 10 LD50 вирусом эктромелии во всех группах, получавших Ви-таланг-2 до и после заражения, за исключением одной группы (при дозе препарата 0,1 мг/кг в профилактической схеме), была достоверно выше, чем в контроле (см. табл. 1, 2).
При инфицировании мышей вирусом гриппа птиц (10 LD50) было обнаружено достоверное повышение количества выживших мышей в экспериментальной группе (введение Виталанг-2) по сравнению с контролем (введение ФР). При этом наблюдалась четкая зависимость количества выживших животных от дозы препарата. Следует отметить, что использование в этих экспериментах максимальной из исследованных доз - 1 мг на 1 кг массы тела (суммарная доза 20 мкг на 1 мышь) приводило к защите животных от гриппозной инфекции. Аналогичный эффект при использовании у зараженных мышей коммерческого препарата озельтами-вира (Тамифлю) получили при суммарной его дозе на мышь в 25 раз большей (500 мкг на 1 мышь).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Описанный в настоящей работе новый способ получения амфифильной высокополимерной РНК позволяет упростить известные технологии получения высокополимерной РНК, достигнуть масштабируемости производства, его экологической чистоты и безотходности, поскольку предполагает работу при комнатной температуре, использование низкоскоростных центрифуг без охлаждения, а также крупнотон-
нажного и дешевого литического агента - олеиновой кислоты, являющейся к тому же незаменимым продуктом питания. Данный способ защищен патентами на изобретение РФ [14, 15].
Показано, что полученная согласно представленному способу амфифильная высокополимерная РНК (возможное коммерческое название - препарат Виталанг-2) является эффективным средством против вирусов гриппа и оспы и после проведения соответствующих доклинических и клинических испытаний может быть рекомендована для профилактики и лечения заболеваний, вызванных ими. Предварительные экспериментальные исследования показали, что терапевтическая доза - 1 мг/кг массы тела животного или человека.
Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (Государственный контракт № 5669р/8332 от 31.03.2008) и Министерства образования и науки Российской Федерации (Государственный контракт №16.512.11.2018 от 11.02.2011).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Пат. 2045270 РФ. Специфический стимулятор биосинтеза белка в кроветворных и им-мунокомпетентных органах / А.В. Харьковский, Л.Е. Панин; опубл. 10.10.95.
2. Соколов В.Д., Андреева Н.Л., Соколов А.В. Иммуностимуляторы в ветеринарии // Ветеринария. 1992. (7-8). 49-50.
3. Земсков В.М., Лидак М.Ю., Земсков A.M., Микстайс У.Я. Низкомолекулярная РНК: получение, гидролиз и применение в медицине. Рига: Зинатне, 1985. 191 с.
4. Ямковая Т.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Биологическая активность разных препаратов РНК из пекарских дрожжей // Бюл. СО РАМН. 2006. (3). 117-121.
5. Кнорроз М.Ю., Попова О.М., Давыдова А.А. и др. Сравнительное изучение противовирусной активности природных двуспиральных РНК при экспериментальном клещевом энцефалите // Вопр. вирусол. 1985. 30. (6). 697-700.
6. RNA towards medicine. Series: handbook of experimental pharmacology. Vol. 173 / Eds. V.A. Erd-
mann, J. Brosius, J. Barciszewski. N.Y.: SpringerVerlag, 2006. XII. 464 p.
7. Redis R.S., Berindan-Neagoe I., Pop V.I., Calin G.A. Non-coding RNAs as theranostics in human cancers // J. Cell. Biochem. 2012. 113. (5). 1451-1459.
8. Крылов И.А., Маркина Н.С., Красношта-нова А.А. и др. Выбор оптимальной схемы получения дрожжевой РНК в условиях современных биохимзаводов БВК и лизина // Биотехнология. 1992. (2). 81-83.
9. Davis F.F., Allen F.W. Ribonucleic acids from yeast which contain a fifth nucleotide // J. Biol. Chem. 1957. 227. (2). 907-915.
10. Ямковая Т.В., Хомов В.В., Загребель-ный С. Н., Ямковой В.И. Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей // Прикл. биохимия микробиол. 2006. 42. (1). 93-97.
11. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях. Страсбург, 1986.
12. Crestfield A.M., Smith K.S., Allen F.W. The preparation and characterization of ribonucleic acids from yeast // J. Biol. Chem. 1955. 216. (1). 185193.
13. Пат. 2436583 РФ. Противовирусное средство / Т.В. Ямковая, С.Н. Загребельный, Л.Е. Панин, В.И. Ямковой; опубл. 20.12.2011.
14. Пат. 2392329 РФ. Способ получения высокополимерной РНК из дрожжей / Т.В. Ямковая, Е.В. Кузовкова, Ю.П. Железнова и др.; опубл. 20.06.2010.
15. Пат. 2403288 РФ. Способ получения высокополимерной РНК из сухих пекарских дрожжей / Т.В. Ямковая, С.Н. Загребельный, Л.Е. Панин, В.И. Ямковой; опубл. 10.11.2010.
ISOLATION AND ANALYSIS OF HIGH-POLYMER RNA BIOLOGICAL ACTIVITY FROM BAKER'S YEAST
Tat'yana Vital'yevna YAMKOVAYA1, Vitaliy Ivanovich YAMKOVOY2, Lev Evgen'yevich PANIN3
1 LLC «Vitalang»
630055, Novosibirsk, Rubinovaya str., 4-128
2 Novosibirsk State Pedagogical University 630126, Novosibirsk, Viluyskaya str., 28
3 Scientific Research Institute of Biochemistry SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2
A new method for an amphiphilic high-polymer RNA producing from dry baker's yeast is elaborated. The main effect of cheapening and non-waste production is achieved by use of oleic acid (food detergent) as lytic agent at the concentration of 1-2 %o. In comparison with known analogues, characterized by the use of 2-ethylhexanoic acid as highly lytic agent, the proposed method does not require a deep cleaning of the final product. The introduction of dry yeast in a cool boiling solution of the lytic agent, without their preliminary soaking can suppress the activity of lysosomal ribonucleases. Non-waste production is that together with the high-polymer RNA, a concentrate feed protein, low molecular weight RNA and natural oligoribonucleotides can be obtained. Experimental verification of the antiviral activity of amphiphilic high-polymer RNA is performed on outbred mice infected with ectromelia virus. It is shown that intramuscular administration of therapeutic doses of preparation to mice causes marked protection from 10 semi-lethal dose (LD50) of ectromelia virus that ranges from 28.6 to 47.6 %o depending on the dose. Introduction of preventive doses of preparation leads to greater protection of mice against infection. The protective effect of the preparation has dose-dependent character: the most significant effect is observed at the dose of 1,0 mg/kg of body weight: in this case 61.9 % of animals are survives in experiment, 19.1 %o - in control group.
Key words: yeast, oleic acid, high-polymeric RNA, ectromelia virus, antiviral properties.
Yamkovaya T.V. - candidate of biological sciences, e-mail: yam_tv@mail.ru
Yamkovoy V.I. - doctor of biological sciences , professor of the chair for chemistry, e-mail: vitalang2@mail.ru Panin L.E. - doctor of medical sciences, professor, academician of RAMS, director
