Выделение и анализ биодеградационного потенциала нового природного штамма-деструктора хлорфеноксикислот рода Rhodococcus Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

УДК 579.222:547.36

ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ БИОДЕГРАДАЦИОННОГО ПОТЕНЦИАЛА НОВОГО ПРИРОДНОГО ШТАММА-ДЕСТРУКТОРА ХЛОРФЕНОКСИКИСЛОТ

РОДА ННОБОСОССШ

©2011 Н.В. Жарикова1, Е.Ю. Журенко1, В.В. Коробов1, Т.Р. Ясаков1, Л.Г. Анисимова1,

Т.В. Маркушева1, С.Н. Абрамов2

Институт биологии Уфимского научного центра РАН, г. Уфа 2ГОУ ВПО «Башкирский государственный педагогический университет им. М. Акмуллы», г. Уфа

Поступила 19.08.2011

Из образца смешанных популяций почвенных микроорганизмов, подвергавшихся длительному воздействию техногенного характера, выделен новый штамм-деструктор хлорфеноксикислот ЮгоЛососсия гиЬгорегИпсШ 5Б. Штамм способен использовать молекулы 4-хлорфеноксиуксусной и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты в качестве единственного источника углерода и энергии.

Ключевые слова: бактерии-деструкторы, хлорфеноксиуксусные кислоты.

Известно, что к числу устойчивых к разложению субстратов относятся ароматические галогениды и, в частности, хлорфеноксиуксусные кислоты [2, 3]. Существенные количества загрязнителей этого ряда были накоплены в зоне производства пестицидов на территории Уфимского промузла.

В ряде работ было показано, что в техногенных экосистемах загрязнители промышленного ряда могут подвергаться микробной атаке. Микробные культуры, способные вовлекать в обмен веществ молекулы пол-лютантов, в настоящее время привлекают значительное внимание [1].

Интерес к деструкторам инициируется преимущественно тем, что они могут быть применены в качестве действующих элементов технологий ремедиации окружающей среды нового поколения.

Целью настоящей работы являлось выделение и идентификация нового природного штамма-деструктора хлорфеноксикислот.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследований был использован изолят 5D, выделенный из пробы почвенной биоты зоны производства гербицидов г. Уфы. Классификацию штамма проводили, руководствуясь принципами Определителя бактерий Берджи [5]. Визуализацию клеток штамма осуществляли с помощью атомно-силовой микроскопии на сканирующем зондовом микроскопе Solver PRO-M фирмы NT-MDT (Россия). Содержание хлорфеноксикислот в культуральной жидкости проводили согласно методическим рекомендациям определения микроколичеств пестицидов

[4].

Жарикова Наталья Владимировна, канд. биол. наук, e-mail: tvmark@anrb.ru; Журенко Евгения Юрьевна, канд. биол. наук, e-mail: tvmark@anrb.ru; Коробов Владислав Викторович, канд. биол. наук, e-mail: tvmark@anrb.ru; Ясаков Тимур Рамилевич, канд. биол. наук, e-mail: yasakovt@gmail.com: Анисимова Лилия Георгиевна, e-mail: anisimovalilya@gmail.com; Маркушева Татьяна Вячеславовна, канд. биол. наук, e-mail: tvmark@anrb.ru; Абрамов Сергей Николаевич, канд. биол. наук, e-mail: abramov-67@mail.ru

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ морфологических признаков изолята 5Э показал, что на агаризированной питательной среде он формировал пигментированные колонии правильной округлой формы, пастообразной консистенции, имевшие оранжево-красную окраску (рис. 1).

На момент анализа микробная популяция культуры 5Э состояла из клеток овальной формы и коротких палочек размерами 0,5/0,65-1,05 мкм, которые образовывали капсулу толщиной 0,05-0,08 мкм (рис. 1).

Частично кислотоустойчивые клетки культуры 5Э были чувствительны к лизоциму и характеризовались положительной окраской по Граму.

Аэробный рост бактерий наблюдался при оптимальном значение рН среды около 6,8 и в диапазоне температур, варьирующим от +22 °С до +41 °С.

Изучение физиолого-биохимических признаков показало, что для штамма 5Э характерно присутствие в гидролизатах целых клеток галактозы, арабиозы, липида ЬСЫ-А. мезо-ДАМК. Культура использовала в качестве источника углерода сорбит (с образованием кислоты и газа), галактозу и арабинозу и не метаболи-зировала инозит и рамнозу.

Клетки штамма обнаружили чувствительность к антибиотикам, а именно: к ампициллину, стрептомицину, канамицину, тетрациклину и хлорамфениколу.

На основании выявленных культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков штамм был идентифицирован как Ккойососсш гиЬгорегИпсШ 5Э.

В условиях периодической культуры К!г. гиЬгорегИпсШ 5Э была проведена оценка динамики роста и использования 4-хлорфеноксиуксусной кислоты (4-ХФУК) и 2,4,5-трихлорфено-ксиуксусной кислоты (2,4,5-Т) в качестве единственного источника углерода и энергии.

На рисунках 2 и 3 представлены графики, отражающие зависимость значений оптической плотности клеточной суспензии от времени инкубации, а также динамика изменения концентраций ксенобиотиков в среде культивирования.

Показатель оптической плотности периодической культуры Е1г. гиЬгорегИпсШ' 5Э достигал значения 0,65 ОЕ в условиях использования 4-ХФУК (рис. 2). Концентрация субстрата в среде культивирования к 6-м суткам снизилась примерно на 50% от контроля..

Проблемы прикладной экологии

Рис. 1. Колонии бактериального штамма Rh. mbropertinctus 5D на поверхности агаризированной среды МПА и изображения клеток.

Прим.: а - общий вид колоний; б, в - группа колоний в отраженном свете на черном фоне, вид сверху и снизу, г - отдельная колония в проходящем свете, вид сверху; д - группа колоний в проходящем свете; ж - электронно-микроскопическая фотография микробных клеток при разрешении 18000Х; з - АСМ - изображения клеток.

Максимальное значение оптической плотности периодической культуры КИ. гиЬгорегипсшх 5Э на среде с 2,4,5-Т наблюдалось на 7-е сутки инкубации. Существенное снижение количества субстрата в среде культивирования (около 40% ) обнаружено к 8-м суткам опыта (рис. 3).

Сравнительный анализ процессов деградации хлорфеноксикислот в модельных системах выявил то, что штамм КИ. гиЬгорегипсшх 5Э обладает примерно равной активностью в отношении 4-ХФУК и 2,4,5-Т.

Таким образом, из смешанных популяций почвенных микроорганизмов, подвергавшихся длительному воздействию факторов производства хлорфенокси-

А

гербицидов, был выделен штамм-деструктор 4-ХФУК и 2,4,5-Т КИ. гиЬгорегИпсШв 5Э.

Ранее Плотниковой и др. [6] была установлена активность штаммов Шюс/ососсий ер. В13, КИос/ососсий ер. В14, КЪодососсия ер. В1-4 и Н1ю(1ососси.\ ер. В2-1 по отношению к бензолу, толуолу, фенолу, бифенилу, нафталину, бензоату, гентизату, салицилату, орто-фталату, иорт-оксибензойной, протокатеховой и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотам.

Принимая во внимание приведенное выше, становиться понятным, что на примере вновь выделенного штамма КИ. гиЬгорегипс[и.\ 5Э было впервые обнаружено, что бактерии рода КЪойососсиз способны ассимилировать 4-ХФУК и 2,4,5-Т.

В

Рис. 2. Зависимость значений оптической плотности клеточной суспензии ОВ590 от времени инкубации штамма КЬ. тЬгор-еШпсШ 5Б в условиях использования 4-ХФУК в качестве источника углерода и энергии (А). Динамика содержания 4-ХФУК в среде культивирования (В).

Рис. 3. Зависимость значения оптической плотности клеточных суспензий ОВ590 от времени инкубации штамма КЬ. гиЪгор-егПпсШ 5Б в условиях использования 2,4,5-Т в качестве источника углерода и энергии (А). Динамика содержания 2,4,5-Т в среде культивирования (В).

Обобщая полученные данные и их обсуждение, можно заключить, что в результате настоящего исследования был выделен новый штамм Rh. riibrop-ertinctus 5D - деструктор 4-хлорфеноксиуксусной и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислот.

Работа выполнена при поддержке гранта Президиума РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов».

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Dejonghe W., Goris J., Fantroussi S. et al. Effect of Dissemination of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D) Degradation Plasmids on 2,4-D Degradation and on Bacterial Community Structure in Two Different Soil Horizons // Appl. Environ. Microbiol. 2011. V. 66. № 8. P. 3297-3304.

2. van der Meer J. R. Evolution of novel metabolic pathways for the degradation of chloroaromatic compounds // Antonie van Leeuwenhoek. 1997. V. 71. № 1-2. P. 159-178.

3. Don R. H., Weightman A. J., Knackmuss H.-J., Timmis K. N. Transposon Mutagenesis and Cloning Analysis of the Pathways for Degradation of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid and 3-Chlorobenzoate in Alcaligenes eutrophus JMP134(pJP4)//J. Bacterid. 1985. V. 161. № 1. P. 85-90.

4. Методы определения микроколичеств пестицидов // под ред. М.А. Клисенко. М.: Медицина, 1984. 256с.

5. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. М.: Мир, 1997. 799 с.

6. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О., Ананьина Л.Н. и др. Характеристика микроорганизмов, выделенных из техногенных почв Прикамья // Экология. 2006. № 4. С. 261268.

ISOLATION AND BIODEGRADATION POTENTIAL ANALYSIS OF THE NEW NATURAL BACTERIA-DESTRUCTOR OF CHLOROPHENOXYACETIC ACIDS OF RHODOCOCCUS GENUS

©2011 N.V. Zharikova1, E.Y. Zhurenko1, V.V. Korobov1, T.R Yasakov1, L.G. Anisimova1,

T.V. Markusheva1, S.N. Abramov2

1 Institute of Biology, Ufa Sci. Centre of RAS, Ufa 2Bashkir State Pedagogical University named by M. Akinullah, Ufa

Strain Rhodococcus rubropertinctus 5D has been isolated from soil microorganisms populations subjected to the factors of chemical and petrochemical production. 4- chlorophenoxyacetic and 2,4,5- trichlorophenoxyacetic acids are metabolized by Rh. rubropertinctus 5D. The conversion of chlorinated phenoxyacetic acid is investigated in model systems.

Key words: bacteria-destruction, chlorophenoxyacetic acids, Rhodococcus.

Zharikova Natalia Vladimirovna, Candidate of Biology, e-mail: tvmark(S)anrb.ru; Zhurenko Eugene Yur'evna, Candidate of Biology, e-mail: tvmark(S)anrb.ru; Korobov Vladislav Vik-torovich, Candidate of Biology, e-mail: tvmark(S)anrb.ru; Yasakov Timur Ramilevich, Candidate of Biology, e-mail: yasakovt(S)gmail.com; Anisimova Lilya Geotgievna, e-mail: anisimovalilya(S)gmail.com; Markusheva Tatiana Vyacheslavovna, Candidate of Biology, e-mail: tvmark(S)anrb.ru; Abramov Sergey Nikolaevich, Candidate of Biology, e-mail: abramov-67(S)mail.ru