Научная статья на тему 'Выделение, фракционирование и анализ экзополисахаридов Bacillus mucilaginosus'

Выделение, фракционирование и анализ экзополисахаридов Bacillus mucilaginosus Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

CC BY
743
165
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
БАКТЕРИИ BACILLUS MUCILAGINOSUS / ЭКЗОПОЛИСАХАРИД / ВЫДЕЛЕНИЕ / ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ / ХРОМАТОГРАФИЯ / ИК-СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ / BACTERIA BACILLUS MUCILAGINOSUS / EXOPOLYSACCHARIDE / ISOLATION / FRACTIONATION / CHROMATOGRAPHY / IR-SPECTROPHOTOMETRY

Аннотация научной статьи по промышленным биотехнологиям, автор научной работы — Куис Людмила Васильевна, Маркевич Раиса Михайловна

Цель данного этапа исследований заключалась в выделении, очистке, фракционировании и изучении экзополисахаридов Bacillus mucilaginosus. Культивирование проводили на синтетической питательной среде. Для анализа применяли гель-хроматографию, ионообменную хроматографию, метод определения карбоксильных групп по Вильсон и ИКспекрофотометрию. Исследуемый полисахарид имеет сложный состав и большую молекулярную массу, он содержит две фракции: F1 и F2. Результаты определения карбоксильных групп по Вильсон и ИКспекрофотометрии подтвержда-ют присутствие карбоксильных групп во фракции F2.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по промышленным биотехнологиям , автор научной работы — Куис Людмила Васильевна, Маркевич Раиса Михайловна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

ISOLATION, FRACTIONATION AND ANALYSIS OF BACILLUS MUCILAGINOSUS EXOPOLYSACCHARIDES

The purpose of the given stage of researches consists in allocation, clearing, fractionation and studying exopolysaccharides of Bacillus mucilaginosus. Cultivation carried out on a synthetic nutrient medium. Methods of gel-chromatography, ion-exchange chromatography, definition carboxylic groups on Wilson and IR-spectrophotometry were used for analysis. Researched polysaccharide has complex composition and the big molecular weight, it contains two fractions: F1 and F2. Results of defi-nition carboxylic groups on Wilson and IR-spectrophotometry confirm presence carboxylic groups in fraction F2

Текст научной работы на тему «Выделение, фракционирование и анализ экзополисахаридов Bacillus mucilaginosus»

УДК 579.852.11:577.121:666.03

Л. В. Куис, аспирант; Р. М. Маркевич, доцент

ВЫДЕЛЕНИЕ, ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ BACILLUS MUCILAGINOSUS

The purpose of the given stage of researches consists in allocation, clearing, fractionation and studying exopolysaccharides of Bacillus mucilaginosus. Cultivation carried out on a synthetic nutrient medium. Methods of gel-chromatography, ion-exchange chromatography, definition carboxylic groups on Wilson and IR-spectrophotometry were used for analysis. Researched polysaccharide has complex composition and the big molecular weight, it contains two fractions: F1 and F2. Results of definition carboxylic groups on Wilson and IR-spectrophotometry confirm presence carboxylic groups in fraction F2.

Введение. К настоящему времени способность к деструкции силикатных минералов обнаружена у многих микроорганизмов [1]. Особый интерес с точки зрения практического использования представляют бактерии Bacillus mucilaginosus. Культуральную жидкость этих бактерий используют для обработки глин и технологических смесей на их основе с целью улучшения качественных показателей при производстве керамических изделий [2, 3]. Влияние культуральной жидкости на свойства сырья большинство исследователей связывает с деструктирующим воздействием на минералы метаболитов этих бактерий (экзополисахаридов и органических кислот).

Об участии низкомолекулярных органических кислот в разрушении силикатных материалов накоплен достаточно большой экспериментальный материал. По способности выносить кремний и алюминий из полевых шпатов эти кислоты расположены в следующем ряду: лимонная - щавелевая > салициловая > пирока-техиновая > галловая > и-оксибензойная > ванилиновая > кофейная [4].

С другой стороны, авторами [5] показано, что интенсивность выноса кремния из кварца под действием культуральной жидкости Bacillus mucilaginosus коррелирует с количеством продуцируемого бактериями экзополисахарида.

Вместе с тем выделенный из культуральной жидкости экзополисахарид сам по себе проявил незначительную самостоятельную выщелачивающую способность серицито-хлоритового сланца, причем у диализованного полисахарида эта способность была ниже, чем у образца, не подвергнутого диализу. Кроме того, на интенсивность выноса кремния в присутствии полисахарида оказывает влияние структура последнего, в частности присутствие уроновых кислот [6]. Авторы этой работы полагают, что происходит комплексное воздействие метаболитов культуральной жидкости на минералы: органические кислоты извлекают кремний и другие элементы из состава минералов и переводят их в растворимое состояние. Роль полисахаридов заключается в способности сорбировать органические кислоты и выщелоченные ионы и тем самым выводить их из реакционной смеси, сдвигая

равновесие и способствуя дальнейшему разрушению минералов.

Имеющиеся сведения о моносахаридном составе экзополисахаридов Bacillus mucilagino-sus, молекулярной массе и степени окисленно-сти (соотношении гидроксильных и карбоксильных групп) разрозненны, они зависят от состава среды, в том числе источников углерода и азота, соотношения углерода и азота, значения рН, уровня аэрации и других факторов.

Основная часть. Цель данного этапа наших исследований заключалась в выделении, очистке, фракционировании и изучении экзополисахаридов Bacillus mucilaginosus.

Бактерии Bacillus mucilaginosus в виде спорового материала получены из лаборатории МолдНИИстромпроект (г. Кишинев, Молдова).

Для глубинного культивирования бактерий применяли синтетическую питательную среду следующего состава, г/л: сахароза - 5;

(NH4)2SO4 - 0,5; K2HPO4 - 0,2; MgSO4 - 0,2; NaCl - 0,1; K2SO4 - 0,1.

Культивирование бактерий проводили, как описано в [7].

К концу процесса культивирования наблюдалось сильное подкисление культуральной жидкости (значение рН снижалось до 3,9-4,0) и накапливались экзополисахариды. При использовании данной культуральной жидкости для биообработки глинистого сырья отмечалось существенное изменение технологических свойств шликерных масс [7].

Схема выделения, очистки и анализа экзополисахаридов представлена на рис. 1.

Определение молекулярной массы полисахаридов осуществляли гель-хроматографией [8]. Предварительно проводили диализ пробы против 0,01 М раствора NaCl, затем исследуемую фракцию наносили на колонку (35^2 см) с сефа-дексом G 200. Элюирование выполняли 0,01 М раствором NaCl со скоростью растворителя 20 мл/ч. Отбирали фракции объемом по 4 мл. Выход полисахаридов из колонки контролировали спектрофотометрически (спектрофотометр СФ-26 при X = 230 нм).

В результате проведения хроматографии исследуемая фракция полисахаридов вышла в объеме исключения. Ее объединяли и диализовали против 1 • 10-3 М раствора трис-HCl (pH 7,5).

Центрифугирование 25 мин при 5000 об/мин

I

(СпернатантТ)

3 объема этилового спирта

с Осадок

Охлаждение до 4°С І ~

Центрифугирование 25 мин при 5000 об/мин

I =

^Супернатант2)

^Фракция 1 ПСХ^>

г дистиллированная вода

Растворение

3 объема г этилового спирта

Охлаждение до 4°С

Центрифугирование 25 мин при 5000 об/мин

I =

(^СупернатантЗ)

(^фракция 2 ПСХ^)

г дистиллированная вода

Растворение

Диализ

Гель-хроматография І

Диализ

Ионообменная хроматография на ББАБ-целлюлозе

I

С^__фракция І

Диализ

С^__фракция Р2_^> І

Ионообменная хроматография ______на КМ-сефадексе________

Диализ

Ионообменная хроматография ______на КМ-сефадексе________

С^_фракция Р1-Г^

С^_фракция Р2-_Т>

* * ИК-спектро- фотометрия

Диализ Диализ *

Определение карбоксильных Определение карбоксильных

групп групп

Рис. 1. Схема выделения, очистки, фракционирования и анализа экзополисахаридов

Для определения степени гомогенности проводили фракционирование экзополисахарида методом ионообменной хроматографии [9] с применением ионнообменных смол на полисахаридной основе: анионите (БЕАЕ-целлю-лоза) и катионите (КМ-сефадекс), в которых функциональные ионообменные группы связаны с гидроксильными группами моносахарид-ных остатков.

В первом случае хроматографию осуществляли на колонке (35^2 см), заполненной БЕАЕ-целлюлозой и уравновешенной 1 • 10-3 М буферным раствором трис-НС1 (pH 7,5).

Полисахарид в уравновешивающем буферном растворе вносили в колонку сверху. Элюирование проводили 1 • 10-3 М раствором трис-НС1 со скоростью растворителя 30 мл/ч. Отбирали фракции объемом по 4 мл. Детектирование осуществляли спектрофотометром СФ-26 при X = 230 нм. После выхода первого хроматографического пика элюирование проводили 0,6 М раствором КС1 (pH 7,5) в элюирующем буферном растворе.

На рис. 2 показана хроматограмма разделения полисахаридов.

В результате выделены две фракции полисахарида: Б1 и Б2. Пробы каждой из них объединяли, диализовали против 1 • 10-3 М раствора трис-НС1 (pH 6,5). Затем фракции разделяли на КМ-сефадексе при тех же условиях, используя растворы с рН 6,5.

Данный эксперимент подтвердил однородность полученных ранее фракций Б1, Б2, после поочередного их разделения были выделены недиссоциирующие при pH 6,5 фракции Б1-1 и Б2-1.

Далее пробы этих фракций объединяли, диа-лизовали против дистиллированной воды и определяли наличие карбоксильных групп по Вильсон [10]. Метод основан на обратном титровании карбоксильных групп гидрокарбонатом натрия.

Результаты анализа подтвердили наличие карбоксильных групп во фракции Б2-1 и их отсутствие во фракции Б1-1.

Полученный ИК-спектр полисахарида представлен на рис. 3.

4

3.5 3

2.5 2

1.5 1

0,5

0

25 50 75 100 125

Объем элюента, мл

150

175

Рис. 2. Хроматограмма разделения полисахаридов

0

Спектр имеет следующие полосы поглощения: в области 3000-2800 см-1 проявляются полосы поглощения валентных колебаний С-С-связей; в области 3600-3200 см-1 имеется широкая полоса гидроксильных групп; ассиметричные валентные колебания С-О-С-связей проявляются в области 1150-1000 см-1; валентные колебания карбонильных групп карбоксила имеют интенсивную полосу 1600-1720 см-1. Исследуемый экзополисахарид является а-сахаром, так как имеет полосу в области 850-860 см-1 [11].

Заключение. Результаты гель-хроматографии указывают на большую молекулярную массу (больше 200 000 Да) анализируемого полисахарида. Основываясь на результатах ионообменной хроматографии, можно говорить о сложном составе исследуемого полисахарида, состоящего из двух фракций: фракция Б1 не содержит функциональных групп, диссоциирующих при pH 7,5; фракция Б2 имеет в своем составе функциональные группы, диссоциирующие при pH 7,5, что свидетельствует об ее анионном характере (полисахарид может содержать карбоксильные группы). Это предположение подтверждают результаты определения карбоксильных групп по Вильсон и ИК-спектрофотометрии.

Литература

1. Каравайко, Г. И. Микробная деструкция силикатных минералов / Г. И. Каравайко // Сб. науч. тр. / Ин-т микробиологии им. Виноградского. - Москва, 2004. - Вып. 12: Юбилейный сборник к 30-летию института. - С. 172-196.

2. Власов, А. С. Биологические методы обогащения минерального сырья и технологических смесей при производстве керамики / А. С. Власов // Химия и технология силикатных и тугоплавких неметаллических материалов. -

1989. - № 3. - С. 155-165.

3. Влияние условий микробиологической обработки глинистого сырья Беларуси на его качественные характеристики / Р. М. Маркевич [и др.] // Материалы. Технологии. Инструменты. - 2005. - № 4. - С. 86-89.

4. Малиновская, И. М. Влияние экзополисахарида Bacillus mucilaginosus на деструкцию хлорита и кварца в растворе органических кислот / И. М. Малиновская, В. С. Подгорский // Микробиологический журнал. - 1988. - Т. 50, № 5. - С. 21-25.

5. Белканова, Н. П. Разрушение силок-санной связи кварца Bacillus mucilaginosus / Н. П. Белканова, Г. И. Каравайко, З. А. Авакян // Микробиология. - 1985. - № 1. -

С.27-30.

6. Роль полисахарида Bacillus mucilaginosus в процессе деструкции силикатных минералов / И. М. Малиновская [и др.] // Микробиология. -

1990. - Т. 59, вып. 1. - С. 70-78.

7. Новый штамм бактерий рода Bacillus и его воздействие на качественные характеристики глины I Л. В. Куис [и др.] // Труды БГТУ Сер. IV, Химия и технология орган. в-в. -2007. - Вып. ХУ - С. 205-207.

8. Остерман, Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л. А. Остерман. - М.: Наука, 1985. - С. 126-137.

9. Методы химии углеводов / пер. с англ.; под ред. Н. К. Кочеткова. - М.: Мир, 1967. -512 с.

10. Оболенская, А. В. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы / А. В. Оболенская, З. П. Ельницкая, А. А. Леонович. - М.: Экология, 1991. - 320 с.

11. Беллами, Л. Инфракрасные спектры мо-

лекул / Л. Беллами; под ред. Д. Н. Шигорина. -М.: Издательство иностранной литературы,

1957. - 444 с.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.