CC BY
19УДК 632.953(569.1)
ВЫДЕЛЕНИЕ ЭНТОМОПАТОГЕНОВ BACILLUS THURINGIENSIS (ВТ) ИЗ РЕГИОНА DEIR EZZOR СИРИИ И ИХ БИОТЕСТИРОВАНИЕ
Ал-Хамада Абдалла Джамаль
Университет Аль-Фурат, кафедра защиты растений, Сирия
В статье изложены результаты поиска, выделения, идентификации и биотестирования образцов Bac. thuringiensis (Bt Hj, Вt Нза зЬ, Вt H14), обнаруженных в регионе Deir Ezzor, Сирии в почвах, трупах и живых насекомых. Из 2000 изолятов по морфологическим и культураль-ным признакам отобрано 56 изолятов, из которых идентифицировано и биотестировано как Bac. thuringiensis 9 единиц. Представлены подробные сведения о морфологических, культу-ральных, физиолого-биохимических, генетических и энтомоцидных свойствах всех 9 изолятов. Показана их идентичность соответствующим типовым штаммам ВТ.
Бактерии рода Bacillus благодаря высоким адаптивным возможностям широко распространены в природе. Наибольшее количество этих бацилл-аэробов выделяют из различных типов почвы, характеризующихся отдельным ценозом, влияющим на их количественный и качественный состав (Naresh et al., 2007). На численность этих бактерий в почве кроме абиотических факторов (температура, влажность, инсоляция) также оказывают влияние растительный покров, наличие минеральных и, особенно, органических удобрений и другие факторы (Евдокимова и др., 1984).
Отдельные штаммы бацилл могут расти в экстремальных условиях при температурах ниже 5°С, а споры выдерживают температуру -40°С и нагревание до 102°С (Chatterjee et al., 2007).
Что касается энтомопатогенных кри-сталлообразующих бацилл, то первоначально утверждали, что основным источником для скрининга являются больные или погибшие насекомые естественных популяций. Дальнейшие исследования показали, что эти бактерии встречаются повсюду: в почве, воде, растениях, в живых насекомых и их трупах, местах их проживания и т.д.. При этом вопрос относительно происхождения ВТ и их роли в окружающей среде остается открытым (Патыка и др., 2007).
За последние годы число разновидностей Bacillus thuringiensis, выделенных многими исследователями, многократно увеличилось. В настоящее время их выделено и идентифицировано более 70.
Некоторая часть из них широко используется в практике контроля численности насекомых (Raimondo et al., 2003). Достоинство этих бактерий по сравнению с другими энтомопатогенами заключено в споровом статусе, в образовании не только спор, но и энтомоцидных токсинов, в технологичности, широком и селективном спектре действия, безопасности для нецелевых насекомых, теплокровных животных и человека (Imre et al., 2005; Rosenquist et al., 2005; Levin, 2007). Эти качества явились стимулом широкого их использования в защите растений от вредных насекомых и клещей (Bradley et al., 1995; Donovan et al., 2009).
Из всего многообразия разновидностей Bt наметилось три группы, отличающиеся между собой по спектру энтомоцидно-го действия. Одна группа предназначена для контроля численности многих чешуекрылых вредителей, другая - для жесткокрылых, третья - для двукрылых (Estruch et al., 1996; Moellenbek et al., 2001; Sayyed et al., 2001).
Перечисленные качества и достоинства этих бацилл придали им высокую практическую значимость. Сейчас из всех существующих и применяемых в мире микробных препаратов энтомоцид-ного действия Bt занимает ведущее положение. 90% препаратов производится и реализуется на основе этих бактерий (Lambert et al., 1992; Кандыбин и др., 2006).
Поисковые исследования ученых разных стран и континентов в последнее время показали, что одни и те же разно-
Вестник защиты растений, 4, 2009 видности ВТ были выделены в самых разных условиях, независимо от наличия и распространения насекомого-хозяина этого энтомопатогена. Например, ВТЩ (thuringiensis) была обнаружена в США, СССР, Чехословакии и др. ВТЩ4 (israelensis) выделена в Израиле, Пакистане, Ленинградской области (Россия), Нигерии, Чехословакии и др. ВТ Ню выделена на Кавказе и Германии - Дармш-тат (Кандыбин и др., 2009).
Такое положение в мире побудило сирийское руководство, в первую очередь автора данной статьи, принять меры для решения вопроса об организации производства и применения этих бактерий в защите
растений Сирии.
С этой целью автор был командирован в один из ведущих институтов России по этой проблеме (ВНИИСХМ). Перед командированным была поставлена конкретная задача: собрать образцы различных почв Сирии, трупов и живых насекомых и выделить из них бактерии группы тюрингиензис. Одновременно командированному стажеру поручалось освоить методы выделения, идентификации и биотестирования В!
Стажировка проходила под руководством проф. Н.В.Кандыбина при непосредственном участии и консультации ведущего научного сотрудника В.П.Ермоловой.
Методика
По 14 образцов почвы по 1 г помещали в стерильные флаконы емкостью 10 мл с 5 мл стерильной воды, в течение минуты встряхивали. Каплю полученной суспензии переносили пипеткой в чашку Петри с рыбным агаром (РА) и методом истощающегося мазка переносили во 2-ю и 3-ю чашки. Трупы насекомых предварительно фломбировали над пламенем спиртовки, стерильным пестиком тщательно растирали в ступке и переносили в пробирку с 3-я мл стерильной воды. После 2-минутного встряхивания 2 капли полученной взвеси переносили в чашки Петри с РА методом истощающегося мазка.
Посевы инкубировали при 28-30°С. На 5-е сутки просматривали морфологию выросших колоний. Отобранные колонии по морфологическим признакам, характерным для ВТ, штрихами пересевали в чашки Петри с РА, разделенные на 8 секторов (рис 1). Параллельно готовили окрашенные мазки по В.А.Смирнову (Smirnoff, 1965) с использованием черного анилинового красителя. Внутривидовую идентификацию выделенных и отобранных бактерий проводили по схеме идентификации бацилл ВТ, предложенной де Баржак и Бонфуа, а также О.Лысенко (De Baarjac et al, 1968; Lysenko, 1985) и методу генотипирования RAPD (Adelaida et al, 2003) .
Биохимические свойства изолятов изучали, используя системы индикаторных бумажных СИБ-дисков хроматографической бумаги, содержащие определенные количества субстрата в сочетании с соответствующим индикатором, стабилизированные пленкообразующим покрытием - поливиниловым спиртом. СИБ использовали взамен жидких дифференциально-диагностических сред при изучении биохимических свойств микроорганизмов. Исследования проводили с чистой культурой. Для ускорения получения четких результатов соблюдали режим температуры 37±1°С.
Для определения использования углеводов в
исследовании
пробирку с 0.3 мл стерильного 0.85% раствора натрия хлорида (рН 7.3±0.1) суспендировали полную петлю суточной агаровой культуры, выращенной при температуре 29±1°С. В эту пробирку со взвесью погружали диск с соответствующим углеводом. Взвесь (суспензия) в пробирках в результате диффузии в нее индикатора становится красной. В качестве контроля служили диски, погруженные в стерильный 0.85% раствор натрия хлорида. Учет проводили в пробирках через 5-18 часов.
Аналогично с использованием СИБ определяли индолообразование, уреазную активность, образование сероводорода, ацетилметилкарбинола (АМК) реакции Фогес-Проскауэра (табл. 1).
Оценка продуктивности изолятов проведена на жидких дрожжеполисахаридных средах разной рецептуры. Число жизнеспособных спор оценивали общепринятым методом серийных разведений культуральной жидкости (КЖ) с последующим подсчетом колоний бактерий, выросших на питательной агаризованной среде (генотипирование изолятов проводили путем выделения ДНК с использованием СТАВ буфера (Zhang et al., 1998).
В эппендорф с 500 ц1 2х СТАВ буфера и следовыми количествами AI2O3 (на кончике шпателя) вносили 2 петли биомассы суточной клеточной культуры, выращенной на агаризованной питательной среде. Образец тщательно гомогенизировали на вортексе в течение трех минут. Инкубировали 1 час на водяной бане при температуре 60-65°С. Через каждые 10 мин инкубирования образец встряхивали на вортексе в течение 10 минут. Затем в эппендорф добавляли 500 ц1 хлороформа, встряхивали на вортексе и центрифугировали 15 мин при 14000 об/мин. Осторожно отбирали верхнюю фазу и переносили в новый эппендорф, добавляли 500 ц1 96% этанола и 25 ц1 5М NaCl. Осторожно перемешивали переворачиванием и центрифугировали 5 мин при 14000 об/мин. После сливания спирта отбирали остатки носиком, подсушивали 10 мин на воздухе и растворяли в 50 ц1 ТЕ (рН-8.0).
56 Вестник защиты растений, 4, 2009 _Таблица 1. Визуальные учеты_
Тесты Цвет субстрата Срок Результат
в растворенном виде учета Положительный Отрицательный
Использование красный 5-18 ч Желтый или оранжевый цвет Красный цвет
углеводов
Образование ин- бесцветный от 4G мин Окрашивание короткого конца Окрашивание от-
дола до 2 ч в розово-малиновыи цвет сутствует
Определение бесцветный от 4G мин Розово-красный цвет То же
уреазы до 2 ч
Определение се- кремовый 5-18 ч Черный цвет То же
роводорода
Реакция Фогес- бесцветный 18-24 ч Через 15-20 мин после закапывания по 1-2 капле 6%
Проскауэра раствора а-нафтола и 40% р-ра калия гидроокиси
(АМК) Малиново-красный цвет То же
RAPD анализ. Для амплификации ДНК были использованы праймеры со случайной нуклеотид-ной последовательностью (длиной 10 нуклеотидов) фирмы Oreon Technologies, Inc. (Alameda, CA). Последовательности случайных праймеров, использованных в работе, таковы: OPA-10 (51 -GTGATCGCAG - 31), OPA-09 (51 - GGGTAACGCC - 31), OPI-09 (51 - TGGAGAGCAG - 31).
Амплификацию проводили в пластиковых пробирках типа эппендорф на 0.5 мл в 20 мкл реакционной смеси: 67 мМ Tris-HCl (pH=8.3), 17мМ (NH4)2SO4, MgCl2 2.5 мМ, Tween20 0.1%, BSA 0.12 mg/ml, глицерин 8.0%, 0.1мМ каждого дезоксирибо-нуклеозидтрифосфата (дНТФ), 10 пикомолей праймеров, 0.5 единиц ДНК полимеразы Taq, 10-50 нг геномной ДНК.
Для RAPD-PCR использовали термоциклер типа MyCycler (BioRad) с платой для пробирок на 0.5 мл.
Условия проведения ПЦР (45 циклов) были следующие (включая время рэмпинга): первая денатурация ДНК при температуре 95°С в течение 5 мин; последующая денатурация ДНК - 45 с при температуре 93°С; отжиг праймеров - 45 с при температуре 37.5°С и синтез ДНК - 1.5 мин при температуре 72°С. Последний цикл амплификации включал дополнительные 10 мин при 72°С для достройки продуктов амплификации.
Статистическая обработка результатов. Для построения дендрограммы, иллюстрирующей степень родства изолятов ВТ, ДНК-маркеры изоля-тов были представлены бинарной матрицей; наличие маркера соответствовало «1», отсутствие - «0». Для генотипирования были использованы только
полиморфные воспроизводимые в 2-3-х повторно-стях ПЦР-продукты амплификации анализируемых изолятов. По полученной матрице методом UPGMA была построена дендрограмма сходства (невзвешен-ный парногрупповой метод с арифметическим усреднением). Для установления уровня генетического родства использовали метод объединения соседей (NJ). Построение древа было выполнено с помощью программы TREECON (van de Peer et al., 1994). Для статистической оценки узлов использовали метод бутстрепа.
Определение биологической активности.
Метод основан на определении концентрации энто-мопатогена, вызывающей 50% гибель тест-объекта при свободном поглощении зараженного корма. Готовили КЖ ВТ в нескольких концентрациях, обеспечивающих от 10 до 96% гибели тест-объекта. Каждый вариант испытывали в трех повторностях. Одновременно с опытом ставили контроль в трех повторностях, используя вместо суспензии ВТ стерильную воду.
Энтомоцидная активность изолятов ВТ определена на личинках колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say) природной популяции, на гусеницах мельничной огневки (Ephestia kuehniella) и амбарной зерновой моли (Sitotroga cerealella).
Определение изолятов ВТ на содержание экзотоксина проведено на личинках комнатной мухи (Muska domestica).
Оценка ларвицидной активности ВТН14 проведена на личинках IV возраста Aedes aegypti - международный тест, предложенный Всемирной организацией здравоохранения.
В результате проведенных исследований просмотрено свыше 2000 колоний разных микроорганизмов (рис. 2). Из них отобрано 56 колоний (матовые, серовато-белого цвета с мелкошероховатой поверхностью). Методом микроскопического анализа мазков установлено: 9 изолятов из 56 отобранных вариантов на 6-е сутки образуют кристаллический эндотоксин разной формы (табл. 2).
исследований
Чистые культуры отобранных изолятов ВТ растут аэробно на плотных питательных средах: мясопептонном агаре (МПА), рыбном агаре (РА), картофельном агаре (КА). Оптимальная температура роста 28-30°С. Через 48 часов образуют серо-белые или серовато-белые матовые плоские колонии с неправильными контурами, по консистенции мягкие, мелкозернистые. Грамположительные палочки с
Вестник защиты растений, 4, 2009 перетрихиальным типом жгутикования образуют субтерминальные споры эллиптической формы размером 1.1-1.3 х 0.8-0.9 мкм. Параспоральные включения у изолятов 1, 2, 9, 31 правильной ромбовидной формы с тупыми концами и четкими гранями, размером 1.2-3.5 х 0.5-2.3 мкм; а у изолятов 5, 19 правильной ромбовидно-вытянутой формы, размером 1.0-2.9 х 0.5-2.2 мкм; у изолятов 27, 28, 34 - неправильной формы, размером 0.4-0.5 х 1.2-1.4 мкм (табл. 2).
А* Ш. » • ЧС\
Ш*. »* t * ■■•ШЩЩ
' •. # * * * •• ш
х с •
Рис. 2. Колонии разных микроорганизмов
Физиолого-биохимические особенности выделенных ВТ определяли по дифференциально-диагностическим схемам де Баржак и Бонфуа, Лысенко и де Бар-жак и Фрачон фе Вааг|ас е! а1., 1968,1990; Lysenko, 1985).
Таблица 2. Форма кристаллического эндотоксина изолятов
№ изо- Объект выде-лята ления
Форма кристалла
1 Почва, занятая Ромбовидная с ту-
баклажанами пыми концами
2 Почва, занятая То же
баклажанами
5 Pieris brassicae Ромбовидная с вытя-
(Lepidoptera) нутыми концами
Scarabaeidae Ромбовидная с тупы-
ми концами
19 Oispa orientale Ромбовидная с вытя-
(Hymenoptera) нутыми концами
27 Почва, занятая Кристаллы непра-
лугами вильной формы
28 Почва, занятая То же
лугами
31 Почва, занятая Ромбовидная с тупы-
пшеницей ми концами
34 Почва, занятая Кристаллы непра-
лугами вильной формы
Значительная дифференциация ВТ приходится на следующие физиолого-биохимические признаки: реакция Фогес-Проскауэра по синтезу ацетилметилкар-бинола (АМК), синтезу лецитиназы С, гидролитическому расщеплению крахмала, образованию пигмента, пленки на мя-сопептонном бульоне (МПБ), протеализ на мясопептонной желатине (МПЖ), усвоению салицина, эскулина, сахарозы, маннозы, уреазная активность, способность к продуцированию термостабильного экзотоксина (табл. 3).
Таблица 3. Физиолого-биохимические свойства изолятов ВТ
Использование
№ изоля-тов АМК* леци-ти-нозы пигмента в-экзо-токсина Пленка на МПБ саха розы ман нозы целло биозы сали цина ление крахмала Протео-лиз МПЖ
1 + + - + + + + + + + +
2 + + - + + + + + + + +
9 + + - + + + + + + + +
31 + + - + + + + + + + +
ВТН 800 + + - + + + + + + + +
эталон
5 + + - - - - - + + + +
19 + + - - - - - + + + +
ВТН3а3в + + - - - - - + + + +
эталон
27 + + - - + - - - - + +
28 + + - - + - - - - + +
34 + + - - + - - - - + +
ВТН14 + + - - + - - - - + +
По физиолого-биохимическим свойствам изоляты 1, 2, 9.31 можно отнести к ВТН1; изоляты 5, 19 - к ВТН3а 3в; изоляты 27, 28.34 - к ВТН14.
Для выяснения генетического родства изолятов бактерий был использован метод генотипирования RAPD (rapid amplification polymorphic DNA) - поли-меразная цепная реакция со случайными праймерами, который успешно применялся ранее для идентификации разных серотипов ВТ (Yoon et al., 2001; Adelaida et al., 2003). Были использованы три случайных праймера 0PA-10, 0PA-09, 0PI-09.
Спектры амплифицированной ДНК изолятов бактерий полученны с прайме-ром OPI-09 (рис. 3).
М 1 2 5 9 19 27 28 31 34 Н1 H14 a3b М
Рис. 3. Продукты амплификации изолятов бактерий со случайным праймером OPA-09 Боковые дорожки - маркеры молекулярных весов (1 kb, Fermentas). Под каждой дорожкой дан оригинальный номер изолята
По полиморфным ДНК-маркерам, полученным с 3-я праймерами, составлена бинарная матрица различий. С помощью филогенетической программы TREECON построена дендрограмма генетических отношений между изолятами (рис. 4).
На рисунке четко различаются три кластера, включающие типовые серотипы и близкородственные изоляты. Полученные данные подтверждают, что анализируемые изоляты относятся к трем серо-
типам: к ВТН (изоляты 1, 2, 9, 31); к ВТН3а3в (изоляты 5, 19); к ВТН14 (изоляты 27, 28, 34).
Определена технологичность изолятов на дрожжеполисахаридных средах разной рецептуры (табл. 4). Продуктивность изолятов ВТН1 и ВТН3а3в находится в пределах 1.5-2 млрд спор/мл КЖ; продуктивность изолятов ВТН14 2.62-3.12 млрд спор/мл КЖ близка по значению к эталонному штамму.
Рис 4. Дендрограмма генетических отношений между изолятами бактерий Вт. Цифры на узлах дендрограммы означают значения бустрэпа при 100 повторностях.
Таблица 4. Продуктивность изолятов ВТ на дрожжеполисахаридных средах
№ изолята ■ Титр спор, млрд/мл КЖ на среде №:
3 10 11
1 1.8 2.14 1.6
2 1.5 1.45 1.96
9 1.8 2.32 2.0
31 1.95 2.58 1.8
ВТН1 800 2.45 2.75 2.67
5 1.7 1.6
19 1.5 1.82
ВТН3а3в 1.8 1.9
27 2.62
28 2.84
34 3.12
ВТН14 7- 3.35
1/23
Содержание экзот
В качестве тест-объекта использовали личинок комнатной мухи 3-суточного возраста однородной популяции, отродившихся в течение одного дня из одной
:сина изолятов ВТНг
кладки яйц, выращенных на среде постоянного состава.
Для постановки опыта готовили разведения автоклавированного супернатан-
Вестник защиты растений, 4, 2009 та КЖ 1:4, 1:8, 1:16, 1:32. Каждое разведение испытывали в трех параллельных определениях. Для испытания в стеклянную банку емкостью 0.2 л с приготовленной средой вносили по 2 мл соответствующего разведения. После тщательного перемешивания помещали 25 личинок и закрывали банки бязевой салфеткой. В контрольные банки вносили 2 мл стерильной воды. Опытных и контрольных личинок помещали в термостат при температуре 28°С. На 5-е сутки опыта проводили выбор пупариев. Конечный результат оценивали по количеству вылетевших мух. Число погибших мух с поправкой на гибель в контроле вычисляли по формуле:
х= (К-В)/Кх100,
где К- количество мух, вылетевших в контроле, В- количество мух, вылетевших в опыте.
Результаты исследований, представленные в таблице 5, свидетельствуют: изоляты 1, 2, 9, 31, отнесенные по биохимическим и генетическим признакам к ВТН4, содержат экзотоксин в пределах
3.76-5.93 мкл/г корма, что свидетельствует о присутствии экзотоксина на уровне, близком к эталонному штамму.
Таблица 5. Уровень экзотоксиногенности изолятов ВТН] для комнатной мухи
№ изо-лята Разведение КЖ Корма мкл/г Гибель, % ЛК50, мкл/г корма
1 1:4 25.0 96.0 4.9
1:8 12.5 88.0
1:16 6.25 60.0
1:32 3.125 4.0
1:4 25.0 90.0 5.93
1:8 12.5 72.5
1:16 6.25 55.0
1:32 3.125 40.0
9 1:4 25.0 92.0 5.8
1:8 12.5 69.8
1:16 6.25 47.6
1:32 3.125 32.3
31 1:4 25.0 100 3.76
1:8 12.5 86.3
1:16 6.25 80.4
1:32 3.125 57.9
ВТН! 1:4 25.0 100 3.04
800 1:8 12.5 100
(эталон) 1:16 6.25 81.9
1:32 3.125 71.9
Оценка ларвицидной активности изолятов ВТН14
Для определения ларвицидной активности изолятов В1 Н14 готовили 6 следующих разведений КЖ: 1%; 0.01%; 0.001%, 0.0005%, 0.00025% и 0.000125%. В опыт брали разведения 0.0005%, 0.00025%, 0.000125% и 0.00006%.
В чашки Петри с 50 мл соответствующей концентрации КЖ помещали по 25 личинок комаров Ae. aegypti начала 4-возраста в 4-кратной повторности. В контроле личинок помещали в чашки с отстойной водопроводной водой. Опытных и контрольных личинок помещали в термостат при 26-28°С. Учет гибели личинок проводили через 24 часа. Ларвицидная активность изолятов, выделенных из луговых почв Сирии, незначительно уступает эталонному штамму, депонированному в коллекции ВНИИСХМ (табл. 6). Энтомоцидность изолятов В1 Н1 определена в лабораторном эксперименте на
личинках колорадского популяции.
жука природной
Таблица 6. Ларвицидная активность изолятов ВТН14 для Aedes aegypti
№ изо- Концентрация Гибель L4 ЛК50,
лята КЖ, 10-3 % через 24 ч. 10-3%
27 0.5 88
0.25 40 0.24
0.125 24
0.06 4
28 0.5 92
0.25 62 0.20
0.125 20
0.06 6
34 0.5 100
0.25 70 0.17
0.125 32
0.06 10
ВТН14 0.5 100
(эталон) 0.25 78 0.15
0.125 36
0.06 12
КЖ того или иного изолята испытывали в трех концентрациях: 10%, 2% и 0.4%. Каждая концентрация испытыва-лась в трех повторностях, по 25 личинок второго возраста в каждой повторности. Для опытов использовали пенициллино-вые флаконы с водой, в которые помещали ветки картофеля. Последние опрыскивали соответствующими растворами КЖ изолятов и помещали в стеклянный кристаллизатор, одновременно подсаживая на каждую ветку по 25 личинок второго возраста. В контроле ветки опрыскивали водой. Через три дня корм меняли на свежий. Учет гибели личинок с поправкой на контроль вели через 4 и 7 дней. Эффективность рассчитывали по формуле Аббота, а LK50 - по формуле Кербера (Abbot, 1925).
х2= (Мо-Мк)/(100-Мк)х100,
где Мо- количество погибших особей в опыте, % (как среднее арифметическое из трех повторностей);
Мк- количество погибших особей в контроле, % (как среднее арифметическое из трех повторностей).
На основании полученных данных вычисляли ЛК5о по формуле Кербера:
lg ЛК5о= lg Cm - o(Ex2-0.5),
где CM- максимальная из испытанных концентраций; с - логарифм отношений каждой предыдущей концентрации к последующей (логарифм кратности разведений);
Ех2 - сумма отношений числа насекомых, погибших от данной концентрации, к общему числу насекомых, подвергшихся действию этой концентрации.
Была определена восприимчивость гусениц мельничной огневки к изолятам ВТН и ВТНзазв. Испытаны концентрации культу-ральной жидкости, %: 1.0, 0.5, 0.25 (табл. 7)
В стеклянные емкости 0.2 дмз с 5 г пшеничной муки вносили по 2 мл раствора соответствующей концентрации. После тщательного перемешивания помещали 25 гусениц 2-возраста и выдерживали в термостате при температуре 26°С. Гибель гусениц учитывали на 7 и 10-й день опыта (табл. 8).
Вестник защиты растений, 4, 2009 Таблица 7. Действие изолятов ВТЩ на личинок колорадского жука 2 возраста
№ изолята Концентрация КЖ, % Гибель L2, по дням учета, % 4 7 ЛК50, %
1 10.0 2.0 0.4 60 52 36 100 98 82 0.23
2 9 10.0 2.0 0.4 10.0 2.0 0.4 52 36 16 56 44 28 100 92 68 100 100 74 0.29 0.27
31 10.0 2.0 0.4 52 44 32 100 100 80 0.24
BTHj 800 (эталон) 10.0 2.0 0.4 64 52 40 100 100 92 0.20
Таблица 8. Восприимчивость гусениц мельничной огневки к ВТН1 и ВТНзазв
№ изо- Концентрация Гибель на сутки учета, % ЛК50, %
лята КЖ, % 7 10
Bt H,
1 1.0 0.5 0.25 46.7 23.7 3.33 65.1 31.2 8.4 0.69
2 1.0 0.5 0.25 46.7 20.0 0 72.0 28.0 0 0.71
9 1.0 0.5 0.25 50.0 26.7 6.7 56.8 31.4 6.7 0.74
31 1.0 0.5 0.25 33.2 20.0 3.3 45.9 26.7 8.4 0.81
ВТН! 800 (эталон) 1.0 0.5 0.25 53.4 23.7 6.6 66.8 37.9 13.3 0.65
ВТНзазв.
5 1.0 0.5 0.25 33.2 16.7 0 54.9 19.6 0 0.84
19 1.0 0.5 0.25 23.4 13.3 0 39.2 15.8 8.4 0.91
ВТНзазв (эталон) 1.0 0.5 0.25 23.4 16.7 0 40.3 24.0 0 0.89
Испытано также действие 1% культу-ральной жидкости изолятов ВТН и ВТНзазв на отрождающихся гусениц зерновой моли (табл. 9).
Таблица 9. Действие 1% КЖ изолятов ВТИ^ и ВТН3а3в на отрождающихся гусениц
_зерновой моли_
Гибель гусениц по дням _учета, %_
№ изолята
1 32.4 62.8
2 28.4 66.6
9 20.6 70.2
31 28.4 80.2
BTHj 800 (эталон) 30.4 88.5
5 18.2 48.5
19 27.2 56.8
ВТН3а3в (эталон) 31.8 64.4
Проведенные исследования подтвердили устоявшееся мнение, что бациллы группы Тюрингиензис широко распространены по многим регионам и континентам. Разработанные несложные мето-
дические приемы позволяют легко их обнаружить и выделить в монокультуру.
Идентификация и биотестирование показали, что выделенные в Сирии разновидности, относящиеся к ЕМ; Н1, ЕЙ НЗаЗЬ и ЕЙ Н14, по своим свойствам, в т.ч. по практической значимости, близки к типовым штаммам.
Выделенные штаммы с успехом могут быть использованы в качестве основы для производства и эффективного применения в защите растений для контроля численности вредных насекомых. При этом следует отметить, что биологическая энтомопатогенная активность выделенных штаммов вполне может быть повышена путем соответствующей селекции и подбором наиболее оптимальных питательных сред и режимов культивирования.
Евдокимова Г.А., Кислых Е.Е., Мозгова Н.П. Биологическая активность почв в условиях агро-техногенного загрязнения на Крайнем Севере. JL, Наука, 1984, 120 с.
Кандыбин Н.В., Патыка В.Ф., Ермолова В.П., Па-тыка Т.И. Микробиоконтроль численности насекомых и его доминанта Bacillus thuringiensis // Инновационный центр защиты растений, С.-Петербург-Пушкин, 2009, 244 с.
Кандыбин Н.В. Фундаментальные и прикладные исследования микробиометода защиты растений от вредителей. Состояние и перспективы // Биологическая защита растений - основа стабилизации агро-экосистем. Материалы конференции, 2006, с. 32-44.
Патыка В.Ф., Патыка Т.И. Экология Bacillus thuringiensis. Ин-т микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАНУ, Киев, 2007, 216 с.
Abbott W.S. A method for computing the effectiveness of an insecticide // J. Econ. Entomol, 1925, 18, c. 265-267.
Adelaida M., Gaviria Rivera, Fergus G. Priest. Molecular typing of Bacillus thuringiensis Serovars by RAPD-PCR // Systematic and Applied Microbiology, 2003, 26, 2, p. 254-261.
Bradley D., Harkey M.A., Kim M.K., Biever D., Bauer L..S. The insecticidal CrylB protein of Bacillus thuringiensis has dual specificity to coleopteran and lepidopteran larvae // J. of Invertebrate Pathology, 1995, 65, p. 162-173.
Chatterjee S.N., Bhattacharya Т., Dangar Т.К., Chandra G. Ecology and diversity of Bacillus thuringiensis in soil environment // African J. of Biotechnology, 2007, 6 (13), p. 1587-1591.
De Barjac H., Bonnfoi A.A. Classification of strains of Bacillus thuringiensis Berliner with a key to their differentiation // Invert. Pathology, 1968, 11, p. 335-347.
De Barjac H., Frachon E. Classification of Bacillus thuringiensis strains // Entomophaga, 1990, 35, p. 233-240.
Donovan W.P., Donovan J.C, Engleman J.T.. Gene knockout demonstrates that vip3A contributes to the pathogenesis of Bacillus thuringiensis towards Agrotis ipsilon
Литература
and Spodoptera exigua // J. of Invertebrate Pathology, 2001, 78, p. 45-51.
Estruch J.J., Warren G.W., Mullins M.A., Nye G.J., Craig J.A., Koziel M.G. Vip3A a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects // Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 1996, 93, p. 5389-5394.
Imre S. Otvos, Holly Armstrong, Nicholas Conder // Safety of Bacillus thuringiensis var. kurstaki Applications for Insect Control to Humans and Large Mammals // 6th Pacific Rim Conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Environmental Impact. Victoria BC, 2005.
Lambert B., Peferoen M. Insecticidal promise of Bacillus thuringiemis//Bioscience, 1992, 42, p. 112-122.
Levin D.B. Human Health Impact Assessment after Bt Exposures, p. 61-63 // Cóté J.C., Otvos I.S., Schwartz J.L., and Vincent C. (ed.). Proceeding of the 6th Pacific Conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Environmental Impact. Érudit, Montreal, 2007, 140 p.
Lysenko O. The taxonomy of entomogenous bacteria // Insect Pathology, I (Steinhaus E.A. ed.), New York, Acad. Press, 1963.
Lysenko O. Nonsporeforming bacteria pathogenic to insect: incidence and mechanisms // Am. Rev. Microbiol. 1985, 39, p. 217-224.
Moellenbeck D.J., Peters M.L., Bing J.W., Rouse J.R., Higgins L.S., Sims L. et al. Insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis protect corn from corn rootworms // Nature Biotechnology, 2001, 19, p. 668-672.
Naresh Arora, Neema Agrawal, Vimala Yerramilli, Rajk Bhatnagar. Biology and application of Bacillus thuringiensis in Integrated Pest Management // General Concepts in Integrated Pest and Disease Management. Springer, 2007, p. 227-244.
Raimondo S., Pauley T.K., Butler L. Potential impacts of bacillus thuringiensis v ar. kurstaki on five salamander species in West Virginia // Northeastern Naturalist, 2003,10(1), p. 25-38.
Rosenquist H., Smidt L., Andersen S.R., Jensen G.B.,
Wilcks A. Occurrence and significance of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis in ready-to-eat food // FEMS Microbiology Letters, 2005, 250, 1, p. 129-136.
Sayyed A.H., Crickmore N., Wright D.J. CytlAa from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis is toxix to the diamond back moth, Plutella xylostella, and synergizes the activity of CrylAc towards a resistant strain // Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67, p. 5859-5861.
Smirnoff U.A. The formation of crystals in Bacillus thuringiensis var. Thuringiensis Berliner before sporulation of low temperature inculcation // J. of Insect pathology, 1965, 5, 2, p. 242-250.
Van de Peer Y., De Wachter Y. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Appiic. Biosci., 1994, 10, p. 669-870.
Yoon J-M., Kim G-W. Randomly amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction analysis of two different populations of cultured Korean catfish Silurus asotus // Indian
Academy of Sciences, 2001, 26, p. 641-647.
Zhang Yu-ping et al. A small-scale procedure for extracting nucleic acids from woody plants infected with various phytopathogens for PCR assay // J. of virological Methods, 1998, 71, p. 45-50.
Автор считает своим долгом выразить глубокую благодарность проф. Н.В.Кандыбину и ведущему научному сотруднику ВНИИСХМ В.П.Ермоловой за руководство моей стажировкой в этом институте, а также сотрудникам Всероссийского НИИ защиты растений Н.А.Беляковой, Н.В.Миронен-ко и Ю.Б.Мусатовой за оказанную мне помощь.
ISOLATION OF ENTOMOPATHOGENIC BACILLUS THURINGIENSIS IN DEIR EZZOR REGION OF SYRIA AND EVALUATION OF ITS BIOLOGICAL EFFICIENCY
Al-Hummada Abdalla Jamal Bacillus thuringiensis (BTHj, BTH3a3b, BTH14) has been isolated from soil, dead and living insects, identified and biotested in Deir Ezzor region Syria. 56 isolates of 2000 samples have been chosen by their morphological and cultural properties. Nine isolates have been identified as Bacillus thuringiensis and biotested. The detailed information is given, concerning the morphological, cultural, physiological, biochemical, genetic and insecticidal properties of those nine isolates. Their identity to referent BT strains is demonstrated.
