CC BY
548
Лубенникова М. В., Афанасьев В. А., Афанасьев К. А.Выделение ДНК - важный этап молекулярно-генетического исследования// Электронный научно-методический журнал Омского ГАУ. - 2020. - № 2 (21) апрель - июнь. - URL http://e-journal.omgau.rU/images/issues/2020/2/00828.pdf. - ISSN 2413-4066
УДК: 577.21
Лубенникова Марина Владимировна
кандидат сельскохозяйственных наук Лаборатория биотехнологии пантовых оленей ВНИИПО ФАНЦА, г. Барнаул nic2019nik@yandex.ru
Афанасьев Виктор Александрович
кандидат ветеринарных наук Лаборатория биотехнологии пантовых оленей ВНИИПО ФАНЦА, г. Барнаул viktor-afanasev-92@mail.ru
Афанасьев Константин Александрович
кандидат ветеринарных наук Лаборатория биотехнологии пантовых оленей ВНИИПО ФАНЦА, г. Барнаул konstantin.afanasev.1992@mail.ru
Выделение ДНК - важный этап молекулярно-генетического исследования
Аннотация. Известно, что исходным этапом, влияющим на результат молекулярно-генетического исследования и дальнейшую идентификацию биоматериала, является процедура выделения и очистки ДНК из биологических объектов. С момента открытия структуры и свойств ДНК технологии её выделения непрерывно совершенствуются и модифицируются. Основная задача этапа выделения - получение очищенных препаратов ДНК, которые в дальнейшем могут использоваться для решения широкого спектра вопросов, в частности реакции амплификации, обратной транскрипции, клонировании, секвенсе, гибридизации, синтезе ДНК и т. д. Процессы получения нуклеиновых кислот могут быть основаны на общеизвестных принципах, их модификациях и использовании специализированных коммерческих наборов. Целью работы стало ознакомление с основными методами выделения ДНК.
Ключевые слова: ДНК, метод, реагент, экстракция, образец, контаминация.
Самым значимым открытием ХХ века в области генетики стало определение молекулы ДНК. Это достижение не было совершено в одночасье и одним представителем ученого мира. Впервые ДНК была открыта швейцарским врачом Фридрихом Мишером при изучении лейкоцитов из гноя на хирургических повязках. В 1869 г. Мишер отметил, что при выделении белков из лейкоцитов в осадок выпадает вещество с кислотными свойствами. Он назвал его «нуклеином» [1]. Позднее Мишер для получения нуклеина стал использовать молоки ло-
сосевых рыб, которых сам ловил в Рейне. Однако о роли ДНК в передаче наследственной информации еще долгое время не знали. Только через 83 года генетическая роль нуклеиновой кислоты была установлена исследователями А. Херши и М. Чейз.
А. Херши и М. Чейз работали с бактериофагом Т2 - вирусом, заражающим кишечную палочку. В 1952 г. ученые установили, что наследственная информация содержится не в белках, как считалось до этого, а в ДНК. Таким образом, результаты, полученные А. Херши и М. Чейз в своих исследованиях, стали решающим доказательством роли ДНК в передаче наследственной информации [2].
Известно, что исходным этапом, влияющим на результат молекулярно-генетического исследования и дальнейшую идентификацию биоматериала, является процедура выделения и очистки ДНК из биологических объектов [3]. С момента открытия структуры и свойств ДНК технологии её выделения непрерывно совершенствуются и модифицируются.
На сегодняшний день существуют различные методы, которые позволяют выделять нуклеиновые кислоты из широкого спектра образцов (растительные и животные ткани, грибы, бактерии, вирусы и т. д.) [4]. Основной задачей этапа выделения служит получение очищенных препаратов ДНК, которые в дальнейшем могут использоваться для решения широкого спектра вопросов, таких как постановка реакции амплификации, проведение обратной транскрипции, детектирование накопления продуктов амплификации методом ПЦР в реальном времени, клонирование, секвенс, гибридизация, синтез ДНК и т. д., которые в свою очередь не могут быть выполнены непосредственно на биологических образцах без предварительной очистки нуклеиновых кислот [5].
Процессы получения нуклеиновых кислот могут быть основаны на общеизвестных принципах, их модификациях и использовании специализированных коммерческих наборов.
Большинство современных методов выделения ДНК состоят из следующих этапов:
- лизис клеток;
- лизис ядра;
- удаления из полученного материала ингибиторов, инактивация клеточных нуклеаз;
- отделение искомых нуклеиновых кислот от клеточной массы;
- очистка и концентрирование ДНК [6].
Для того чтобы получить высокоочищенную ДНК следует использовать наиболее подходящие методы выделения [7].
Цель работы - ознакомиться с основными методами выделения ДНК.
По основным физическим и биохимическим признакам можно выделить следующие методы выделения ДНК: жидкофазные и твердофазные.
Жидкофазные методы используют в том случае, когда необходим лизис биоматериала (например ткань, кровь) хаотропными или детергентными веществами. За стадией лизиса проходит несколько этапов с использованием органических растворителей, таких как хлороформ, фенол, этанол. Полного разделения нуклеиновых кислот и белков можно добиться с использованием перхлората натрия. Классическая методика получения чистого продукта основана на том, что ДНК это полярная молекула и не растворяется в органических растворителях.
При выделении нуклеиновых кислот твердофазными методами используются следующие принципы и процессы: водородные связи с немодифицированной гидрофильной матрицей; ионообмен в водном растворе; аффинность; механизмы исключения по размеру. Принцип твердофазных методов заключается в адсорбции на себе нуклеиновых кислот.
Более подробно остановимся на основных методах выделения ДНК.
Экстракция ДНК с помощью органических растворителей (фенол-хлороформная экстракция).
В 1976 г. в статье P. M. Rae с соавт. встречается упоминание о применении этого метода. С тех пор данная технология является одним из самых распространённых методов выделения нуклеиновых кислот [8].
Сущность методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом и последующем перемешивании и центрифугировании смеси. Получается раствор с двумя фазами: водной и органической, при этом все липиды и жиры располагаются в органической (нижней) фазе, белки - на границе фаз, а нуклеиновые кислоты находятся в водной (верхней) фазе. Для повышения чистоты экстракта эти манипуляции следует повторить несколько раз [9].
Преимуществами данного метода является: получение ДНК хорошего качества и высокой концентрации; подходит для разного рода объектов; низкая стоимость; не требует специальных материалов и оборудования; хорошо работает со старым, разложившимся материалом, костями; выделенная ДНК очень стабильна и хорошо хранится в замороженном состоянии.
Недостатками метода являются: высокая токсичность; занимает много времени; не всегда удаляет ингибиторы; возможна контаминация (большая смена наконечников и пробирок); трудно автоматизировать [10, 11]. Из-за токсичности реагентов и сложного многостадийного манипулирования экстракция органическими растворителями не считается идеальной и непрактична для большого количества образцов. Тем не менее, она часто используется в качестве стандартного метода при оценке эффективности новых способов экстракции нуклеиновых кислот и постоянно претерпевает модификации [12].
Экстракция ДНК на стекле.
В 1990 г. Boom с соавт. представил весьма удобный способ выделения нуклеиновых кислот. Он включает в себя стадию лизиса клеток с помощью сильного хаотропного агента. Данный компонент разрушает клеточные мембраны, инактивирует внутриклеточные РНКазы и последующую сорбцию нуклеиновой кислоты на носителе (диатомовая земля, стеклянные бусы и др.). Вследствие высокой концентрации хаотропных солей (гуанидин тиоцианата, гуанидин хлорида и др.) нуклеиновая кислота вступает в обратимую связь со стеклом, при этом соединение белков с матрицей не происходит. Хаотропные соединения - это вещества, которые нарушают упорядоченную структуру воды, в результате мембраны приходят в состояние хаоса (йодид натрия, мочевина и др.). Хаотропные агенты разрушают клеточные мембраны и лизируют клетки с последующим выходом нуклеиновой кислоты. Для отмывания примесей используют хаотропную соль, а хаотропную соль отмывают этанолом (80%-м). Для снятия со стекла очищенной нуклеиновой кислоты используют буфер с низкой ионной силой [13].
Экстракция ДНК с помощью силики.
На сегодняшний день одним из популярных является метод выделения ДНК с помощью силики. Он основан на применении для лизиса клеток сильного хаотропного агента -гуанидина тиоционата (GuSCN) и дальнейшей сорбции ДНК на носителе (например, частицами силики (SiO2) в качестве абсорбента). В пробе после отмывок остается ДНК, сорбированная на носителе, от которого она легко отделяется с помощью элюирующего буфера. Метод технологичен, удобен и пригоден для подготовки образцов к амплификации. Однако вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок возможны потери ДНК. Это имеет особенно большое значение при работе с небольшим количеством биоматериала [14].
Необходимо отметить, что в связи с большим количеством стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом необходима аккуратность, поскольку возможна перекрестная контаминация между пробами образующейся аэрозолью ДНК.
Преимуществами метода является то, что он быстро и просто выполним, экономичен, возможно автоматизировать.
К недостаткам относится сложность выделения ДНК из объектов с малым количеством биологического материала.
Экстракция ДНК на спин-колонках.
Метод экстракции ДНК на спин-колонках представляет собой усовершенствованную технологию выделения на частичках силики, предложенную американскими учёными в 1979 г. [15]. Они установили, что в щелочных условиях и при повышенных концентрациях соли ДНК связывается с силикатами. Это дает возможность отделить частицы силики со связанной ДНК от остальных компонентов клетки. Спин-колонки сделаны таким образом, что при нанесении на колонку клеточного лизата с последующим центрифугированием, ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит через неё. Далее ДНК несколько раз промывают и элюируют в пробирку.
Преимуществами этого метода являются высокая чистота и хорошее качество выделенной ДНК, простота и высокая воспроизводимость по сравнению с экстракцией фенол-хлороформом. Однако следует отметить, что большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено [16].
В зависимости от биоматериала и сложности его лизиса, экстракция на спин-колонках по времени может занять от 20 минут. Однако стоимость одного выделения здесь существенно выше, чем у фенол-хлороформной экстракции, так как для каждой реакции необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата, реагенты.
Экстракция ДНК с помощью магнитных частиц.
Технология этого метода основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы (целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.). К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют [17].
Для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование (например, центрифуга). Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике. Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца [18].
Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же.
Метод экстракции с помощью магнитных частиц обладает рядом преимуществ: легкость в исполнении; большая емкость сорбента дает возможность получить большие количества ДНК / РНК; в процессе выделения потери минимизированы (не требуется разделение фаз и осаждение материала); минимальный набор оборудования; отсутствие стадий центрифугирования; снижен риск контаминации благодаря тому, что практически весь материал связывается сорбентом; конечный продукт имеет высокую степень очистки. Недостатком данного метода является то, что он достаточно дорогой.
Экстракция ДНК с помощью ионообменной смолы.
Данный метод основан на применении ионообменников типа ^е1ех. Они в свою очередь собирают примеси затрудняющие реакции, а не ДНК как это происходит со стеклом. Смола ^е1ех является сополимером стирола с дивинилбензолом, содержащим иминодиаце-татные группы, связывающие поливалентные ионы металлов и относится к одному из старейших методов очистки ДНК.
Такая технология состоит из двух стадий. Первая стадия кипячение образца, вследствие этого происходит распад клеточной стенки, нуклеиновые кислоты попадают в раствор. Во вторую стадию на ионообменнике происходит сорбция примесей. Метод весьма интересен тем, что достаточно прост в исполнении. Как правило, он подходит для работы с клиническим биоматериалом. Надо признать, что в некоторых случаях наблюдаются образцы с такими примесями, которые с использованием ионообменников убрать не удается. Помимо этого, есть микроорганизмы, у которых клеточные стенки невозможно разрушить с помощью простого кипячения. Для таких образцов нужны дополнительные этапы обработки.
В том случае, когда необходимо получить статистические данные, можно воспользоваться простыми методиками на основе детергентов, или обработкой биоматериала щелочью с дальнейшей ее нейтрализацией. При этом применение таких методов экстракции ДНК для клинической диагностики может явиться причиной получения отрицательных результатов. Это связано с тем, что в реакционной смеси продукт ДНК будет низкого качества.
Метод выделения ДНК с помощью ионообменной смолы имеет ряд преимуществ: быстрота, простота, безопасность; можно автоматизировать; экономичный; низкий риск контаминации; удаляет ПЦР-ингибиторы; подходит для любого типа материала, за исключением костей.
Существует ряд недостатков данного метода: ДНК плохо очищена; степень эффективности экстракции непостоянна (качество и количество ДНК сильно изменяется); большая вероятность ингибирования самими смолами; выделенная ДНК нестабильна; ДНК нельзя использовать для ПДРФ-анализа, т.к. она одноцепочечная [14].
Экстракция ДНК на бумажных фильтрах.
Сюда относится экстракция ДНК с помощью пластинок FTA (Fast Technology for Analysis of nucleic acids). В основе метода пластинок FTA лежит целлюлозный фильтр (Ватман BFC180), который импрегнирован смесью сильных буферов, содержащей реактивы лизи-рующие клетки, денатурирующие белки и защищающие нуклеиновые кислоты от воздействия нуклеаз, окисления и повреждения ультрафиолетовыми лучами. Пластинки FTA быстро инактивируют микроорганизмы, в том числе возбудителей, передающихся через кровь, препятствуют росту бактерий и других микроорганизмов. Мембраны и органеллы клеток лизи-руются, а высвобожденные нуклеиновые кислоты задерживаются волокнами пластинки. Преимуществом является то, что нуклеиновые кислоты остаются фиксированными и стабильными, их можно перевозить, анализировать сразу или в течение длительного времени хранить при комнатной температуре. Поскольку фиксированные нуклеиновые кислоты остаются стабильными, пластинки FTA удобно использовать для отбора проб на большом расстоянии от лаборатории и их транспортировки [19].
К преимуществам метода также относят безопасное обращение с образцами, быстрое выделение образца ДНК высокого качества, возможность автоматизации процесса, длительное хранение образца при комнатной температуре. Метод имеет следующие недостатки: пригоден только для образцов жидкого типа, повышенная стоимость реактивов, количество ДНК, имеющееся на перфорате, нельзя подвергнуть количественному анализу или скорректировать [10].
В настоящее время имеется ряд методов, в которых можно получить ДНК и РНК из одной пробы одновременно. Для одновременного распада клеточных мембран и инактивации внутриклеточных рибонуклеаз (РНКаз) применяют сильные хаотропные агенты (гуанидин тиоцианат, цезия три-флуороацетат). Минусом таких методик являются то, что на анализ уходит много времени (16-44 ч), а также потребность в ультрацентрифугировании [20].
В заключении хотелось бы отметить, что выбор методики выделения ДНК зависит от многих факторов и основывается исходя из определённых критериев:
• поставленной задачи;
• первично выбранного материала;
• количества времени отведённого на анализ;
• ожидаемого результата (требуемая степень чистоты и концентрация нуклеиновых кислот);
• размер партии;
• стоимость процедуры;
• лабораторная инфраструктура, наличие обученного персонала;
• дальнейшее применение полученной ДНК (ПЦР, синтез, клонирование, метод детектирования и его аналитическая чувствительность).
Выбор конкретного метода выделения нуклеиновых кислот по-прежнему остается трудной задачей, от решения которой зависит получение правильного и надежного результата. Неверный выбор метода выделения ДНК или его неверное осуществление могут привести либо к получению загрязненной ДНК, непригодной для исследования, либо её потере [3].
Список источников:
1. Dahm R Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid research / R. Dahm // Human Genetics. - 2008. - P. 565-581.
2. Курчанов Н.А. Генетика человека с основами общей генетики: учебное пособие / Н.А. Курчанов. - СПб.: СпецЛит, 2009. - С. 7-12.
3. Великов В.А. Молекулярная биология. Практическое руководство / В.А. Великов. -Саратов, 2013. - 84 с.
4. Moss D. An Easily Automated, Closed-Tube Forensic DNA Extraction Procedure Using a Thermostable Proteinase / D. Moss, S.A. Harbison, D.J. Saul // Int. J. Legal Med. - V. 117. - 2003. - P. 340-349.
5. Мацука Г.Х. Методы молекулярной биологии / Г.Х. Мацука // Сб. науч. тр. АН УССР, Ин-т молекуляр. биологии и генетики. - Киев, 1979. - 267 с.
6. Каюмов А.Р. Практикум по молекулярной генетике / А.Р. Каюмов, О.А. Гимадутди-нов // Учебно-методическое пособие. - Казань, 2016. - 36 с.
7. HarwoodA.J. Basic DNA and RNA Protocols, Methods in Molecular Bi-ology / A.J. Har-wood. - V. 58. - New Jersey: Humana Press, Totowa, 1994. - P. 3-7.
8. Rae P.M. Factors influencing the yield of satellite DNA in extractions from Drosophila vi-rilis and Drosophila melanogaster adults and embryos / P.M. Rae, T.R. Barnett, D.G. Babbitt // BBA Sect. Nucleic Acids Protein Synth. - 1976. - Р. 154-160.
9. Chachaty E. Isolating Chromosomal DNA from Bacteria / E. Chachaty, P.Saulnier // The Nucleic Acid Protocols Handbook, Springer. - 2000. - P. 29-32.
10. Кулмаганбетова Г.Н. Современные проблемы биологии / Г.Н. Кулмаганбетова. -Астана, 2012. - 32c.
11. Мустафин Р.Н. Анализ генома человека / Р.Н. Мустафин, А.Х. Нургалиева, Д.С. Прокофьева, Э.К. Хуснутдинова // Учебное пособие. - Уфа, 2016. - С. 7-13.
12. Петров Д.Г. Методы выделения и очистки ДНК из лизатов клеток (обзор) / Д.Г. Петров, Е.Д. Макарова, Н.Н. Гермаш, И.Е. Антифеев // Научное приборостроение. - 2019. -т. 29, № 4. - С. 28-50.
13. Boom R. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids / R. Boom, C.J. Sol, MM. Salimans et al. // Microbiol. - V. 28. - 1990. - P. 495-503.
14. Нургалиева А.Х. Молекулярно-генетические методы изучения наследственных болезней человека / А.Х. Нургалиева, А.С. Карунас, Р.И. Хусаинова, И.М. Хидиятова, В.Л. Ах-метова и др. // Учеб. пособие. - Уфа, 2013. - С. 12-14.
15. Vogelstein B. Preparative and analytical purification of DNA from agarose / B. Vogelstein, D. Gillespie // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 76 (2). - 1979. - Р. 615-619.
16. Green M.R. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / M.R. Green, J. Sambrook // Cold Spring Harbour Laboratory Press. - 2012.
17. Demeke T. The Effects of Plant Polysaccharides and Buffer Additives on PCR / T. De-meke, R.P. Adams // Biotechniques. - V. 12. - 1992. - P. 332-334.
18. Hoorfar J. Making Internal Amplification Control Mandatory for Diag-nostic PCR / J. Hoorfar, N.Cook, B. Malorny et al. // Microbiol. - V. 41. - 2003. - P. 5835.
19. Аукенов Н.Е. Выделение и очистка нуклеиновых кислот. Состояние проблемы на современном этапе / Н.Е. Аукенов, М.Р. Масабаева, У.У. Хасанова // Наука и здравоохранение. - № 1. - 2014. - С. 51-53.
20. Perry D. Isolation of DNA and RNA / D. Perry, J. David // Methods in Molecular Medicine. - 2001. - V. 31. - P. 25-30.
Marina Lubennikova
Candidate of agricultural Sciences Laboratory of biotechnology of Siberian stags
Federal Altai Scientific Centre of Agro-Bio Technologies (FASCA), Barnaul
Viktor Afanas'ev
Candidate of veterinary Sciences Laboratory of biotechnology of Siberian stags
Federal Altai Scientific Centre of Agro-Bio Technologies (FASCA), Barnaul
Afanas'ev Konstantin
Candidate of veterinary Sciences Laboratory of biotechnology of Siberian stags
Federal Altai Scientific Centre of Agro-Bio Technologies (FASCA), Barnaul
DNA isolation as an important stage of molecular genetic research
Annotation. It is known that the initial stage that affects the result of molecular genetic research and further identification of the biomaterial is the procedure for isolation and purification of DNA from biological objects. Since the discovery of the structure and properties of DNA, its isolation technologies have been continuously improved and modified. The main task of the isolation stage is to obtain purified DNA preparations that can be used in the future to solve a wide range of issues, such as amplification reactions, reverse transcription, cloning, sequencing, hybridization, DNA synthesis, etc. Processes for producing nucleic acids can be based on well- known principles (classical methods), their modifications, and the use of specialized commercial kits. The aim of the work was to get acquainted with the main methods of DNA isolation. Keywords: DNA, method, extraction, sample, contamination.
