CC BY
48
УДК 632.937.16
DOI 10.26897/0021-342X-2020-4-43-53
Известия ТСХА, выпуск 4, 2020
ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ PSEUDOMONAS SAVASTANOI PV. GLYCINEA И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ЗАЩИТЕ СОИ ОТ БАКТЕРИАЛЬНОГО ОЖОГА
Р.И. ТАРАКАНОВ1, А.Н. ИГНАТОВ2-3, Ф.С. ДЖАЛИЛОВ1
(1 ФГБОУ ВО Российский государственный аграрный университет -МСХА имени К.А. Тимирязева;
2 ООО «Исследовательский Центр «ФитоИнженерия»;
3 Российский университет дружбы народов)
Бактериальный ожог является одним из основных бактериальных заболеваний бобовых культур, снижающих рентабельность выращивания сои в Российской Федерации. Среди псевдомонад, изолированных из семян растений сои, пораженных бактериальным ожогом, были отобраны 4 штамма Pseudomonas savastanoi pv. glycinea (Psg). Их свойства совпадали с референтным штаммом CFBP 2214 по результатам заражения растений, LOPAT-тестов, ПЦР-анализа на ген коронафакат лигазы, и частично - по профилю вирулентности бактериофагов. Из образцов почвы с полей, на которых выращивалась соя, были выделены 4 изолята бактериофагов, способных поражать Psg. По результатам проверки штаммовой специфичности бактериофагов для дальнейшего использования в качестве средства защиты растений сои от бактериального ожога был выбран бактериофаг фG17, способный поражать 4 из 5 испытанных штаммов патогена. Проверка эффективности бактериофага на вегетирующих растениях сои на искусственном инфекционном фоне показала достоверное снижение распространенности и развития болезни при двукратном применении фагового препарата. Биологическая эффективность данного приема была близка к эталону (Стрекар, КС, 0,5%) и составляла 74,75%.
Ключевые слова: бактериальный ожог сои, бактериоз, бактериофаги, биологическая защита растений, органическое растениеводство, Pseudomonas savastanoi pv. Glycinea.
Введение
Соя культурная (Glycine max (L.) Merr., 1917) - стратегическая зернобобовая и масличная культура многоцелевого назначения. В 2018 г. в мире было произведено более 356 млн т соевых бобов [21]. Потребление данной культуры возрастает год от года, появляются инновационные отрасли использования сои, и она может стать одним из ключевых растительных объектов развивающейся биоэкономики и биоэнергетики. Широкое внедрение в производство сои - эффективный путь решения проблем недостатка кормового и пищевого белка, успешно используемый в мировом сельском хозяйстве [27]. Однако рост урожайности ограничивается несколькими факторами, и прежде всего - засоренностью посевов, вредителями и болезнями. Болезни сои экономической значимости вызывают более 45 видов грибов, 15 видов вирусов и 6 видов фитопатогенных бактерий [16, 17].
Известны несколько бактериальных болезней сои: бактериальный ожог (син. бактериальная угловатая пятнистость, англ. «bacterial blight») - пустульная, или ржаво-бурая бактериальная пятнистость, и др. Однако наиболее вредоносным является бактериальный ожог [20].
Возбудителем болезни является бактерия Pseudomonas savastanoi pv. glycinea (Coerper, 1919) Gardan et al., 1992 (Psg, синоним - Pseudomonas syringae pv. glycinea (Coerper, 1919) Young et al., 1978) [1]. Патоген распространен во всех основных зонах
выращивания сои, включая 41 страну мира [3, 10]. Psg принадлежит геномовиду 2 комплекса Pseudomonas syringae и был реклассифицирован как P savastanoi, включающий в себя патоварианты (pvs.) savastanoi, glycinea, tabaci и phaseolicola [17]. Psg поражает все надземные части сои, но характерные симптомы обычно наблюдаются на листьях среднего и верхнего ярусов и на стручках. Через 5-15 дней после заражения на листьях появляются некротические маслянистые пятна, окруженные хлоротичным ореолом. Обычно эти пятна увеличиваются и сливаются, образуя не-кротичные зоны на листьях [5]. Если заражение прошло на раннем этапе, то болезнь проявляется в виде карликовости и быстрой гибели растений [13].
Основным источником первичной инфекции являются зараженные семена [26], реже - сорные растения, зараженные растительные остатки. Потери урожая сои по причине этой болезни могут достигать 40% при благоприятных для патогена погодных условиях и других факторах [4]. При этом снижаются не только урожайность и масличность, но и всхожесть зараженных семян [18]. Массовое проявление бактериального ожога обычно наблюдается во второй половине лета, когда происходит вторичное заражение растений [17, 25].
Меры защиты включают в себя выращивание устойчивых сортов, соблюдение севооборота, предпосевное протравливание семян и обработку растений во время вегетации. Одним из самых надежных способов защиты от патогена является селекция устойчивых к патогену сортов, однако эффективность этого направления снижается ввиду быстрого появления вирулентных к устойчивым сортам рас патогена [14, 24]. Сложность борьбы с Psg обусловлена также высокой исходной изменчивостью популяции патогена и ее малой изученностью [18].
Для химической защиты растений от заболевания используются пестициды на основе меди, антибиотиков и бактерий-антагонистов [6]. Но, к примеру, использование антибиотиков приводит к быстрому накоплению в фитоценозе резистентных к ним форм бактерий, медь имеет свойство накапливаться в продукции и экосистеме, а биологический эффект от применения антагонистов является невысоким и зависит от условий применения [23].
С учетом вышесказанного и в связи с принятием в 2019 г. закона о производстве органической продукции актуальным становится поиск новых способов биологической защиты растений. В этом плане весьма перспективным представляется применение бактериофагов как агентов биологического контроля возбудителя бактериального ожога сои [11, 22].
Целью нашей работы являлось выделение изолятов бактериофагов Pseudomonas savastanoi pv. glycinea, определение их специфичности по отношению к штаммам фитопатогена и оценка эффективности защитного действия на сое при искусственном заражении растений.
Методика исследования
Исследование проводили в 2019-2020 гг. в лаборатории защиты растений РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева.
Выделение патогена. После проращивания поверхностно-стерилизованных семян на фильтровальной бумаге в течение 5 дней из непроросших, а также из имеющих типичные симптомы бактериального заражения (некроз семядольных листьев, подсемядольного колена, бактериальный экссудат) проростков выделяли бактерии путем гомогенизации пораженных фрагментов семени и проростков пестиком в ступке с добавлением стерильной воды. Последовательные 10-кратные разведения гомогената высевали на среду Кинга Б и инкубировали при 28°C в течение 4-х сут.
При отборе типичных флуоресцирующих колоний псевдомонад их признаки сравнивались с референтным штаммом Pseudomonas savastanoi pv. glycinea CFBP 2214.
Отобранные изоляты имели следующие биохимические и морфологические характеристики: белый, слегка кремоватый цвет колоний, колонии круглые, блестящие, 3-дневные колонии образуют сидерофор- пиовердин, диффундирующий в среду и окрашивающий ее при УФ-излучении в синий цвет, не обладают пектолитической активностью.
У выделенных изолятов анализировали биохимические признаки по системе LOPAT (образование левана, оксидазы, пектолитическая активность на ломтиках картофеля, аргининдигидролазная активность и реакция сверхчувствительности (СВЧ) на растениях табака) согласно ранее описанным методам [9] с использованием коммерческих экспресс-тестов Микро-Цитохромоксидаза и Микро-Аргинин (ЗАО «НИЦФ», Санкт-Петербург).
Изоляты бактерий, имевшие характерные для вида Pseudomonas savastanoi признаки, анализировали методом ПЦР со специфичными праймерами. Выделение ДНК проводили с 2-суточных колоний чистых культур бактерии при помощи набора для выделения ДНК «ГС-проба» (ООО «АгроДиагностика»). Для проведения анализа использовали праймеры PsgFOR-1 ('5-GGC GCT CCC TCG CAC TT-3') и Ps-gREV-2 ('5-GGT ATT GGC GGG GGT GC-3'), специфичные для фрагмента гена cfl (размер продукта - 650 п.н.), кодирующего коронафакат лигазу (coronafacate ligase), терморегулируемый ген, требующийся для синтеза фитотоксина коронатина [5].
Для проведения амплификации готовили ПЦР-смесь, содержащую 5х Master Mix (5х MasDDTaqMIX-2025,«Диалат ЛТД») - 5 мкл; 1,0 мкл каждого праймера с концентрацией 10 пМ/мкл; 5 нг целевой ДНК - 5 мкл; воду для ПЦР - 13 мкл. Окончательный объем смеси составлял 25 мкл. ПЦР-амплификацию проводили в термоциклере АТС 201 «Nyxtechnik» по программе [28]. Ампликоны разделяли методом электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с бромистым этидием в буфере TBE0^ (рис. 1).
6 5 4 3 2 1 М
щш Щ0 W <650 bp
Рис. 1. Результаты амплификации по праймерам PsgFOR-1 и PsgREV-2: М - маркер молекулярного веса GeneRuler 100 bp, Fermentas;
1 - положительный контроль (штамм CFBP 2214); 2 - отрицательный контроль;
3 - штамм Psg A31; 4 - А7-1; 5 - AF-3; 6 - В-7)
Проверку патогенности изолятов проводили на 25-дневных растениях сои сорта Батя, выращенных в пластиковых горшках объемом 0,5 л с торфяным субстратом с перлитом (ООО «Велторф) в теплице при средней температуре 25/20°C (день/ночь) и естественном освещении (июнь-август).
Суспензию бактериальных клеток 2-суточной культуры патогена готовили в стерильной воде с первоначальным разведением до оптической плотности 0,5, измеряемой
фотометром при 590-610 нм и последующим доведением до концентрации 108 КОЕ в 1 мл. За двое суток до инокуляции и в течение суток после нее в теплице поддерживали повышенную влажность воздуха (95%) и постоянную температуру воздуха 27°С.
Заражение проводили методом опрыскивания поверхности листьев суспензией патогена с добавлением 0,01%-ного адъюванта Сильвет Голд, ВЭ для улучшения проникновения патогена в устьица. В качестве отрицательного контроля использовали стерильную воду с адьювантом, в качестве положительного - суспензию референтного штамма патогена CFBP 2214. Учет результатов проводили через 14 дней после заражения (рис. 2).
Рис. 2. Симптомы поражения бактериальным ожогом сои сорта Батя на 14-е сутки после искусственного заражения референтным штаммом СББР 2214: А - верхняя сторона; В - нижняя сторона листа
Выделение бактериофагов. Из образцов почв с полей с посевами сои, пораженными бактериальным ожогом сои, проводили выделение бактериофагов общепринятыми методами [10]. Выделенные изоляты фагов хранили при +4°С для дальнейшей оценки литической активности против штаммов Psg.
Тестирование специфичности бактериофагов. В работе использованы 4 высоковирулентных штамма Psg, выделенные из семян и проростков сои в 2020 г., и референтный штамм CFBP 2214. Для подготовки к тестированию фагочувствительности бактерии фитопатогена выращивали в течение 48 ч при температуре 27°С на среде Кинга Б с 1,5% агара.
Для тестирования вирулентности изолятов бактериофагов использовали капельный метод на двухслойном агаре [21]. В качестве верхнего слоя при титровании фагов выступала среда Кинга Б с содержанием агара 0,7%. Реакцию считали положительной, если на месте нанесения капли суспензии фага через 12 ч при температуре 27°С происходило формирование бляшки (полное просветление бактериальной культуры).
Эффективность применения бактериофагов в защите сои от бактериального ожога. Оценку проводили при искусственном заражении растений в теплице лаборатории защиты растений РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева в июле и августе 2020 г. Для оценки биологической эффективности бактериофагового препарата против бактериального ожога сои проводили обработку растений суспензией фагов в концентрации 107 бляшкообразующих единиц в 1 мл (БОЕ/мл). Концентрацию фагов проверяли путем серийных разведений и посевом на верхний агар с бактерией-хозяином. Предварительно за 2 дня до обработки фагами проводили заражение патогеном растений сои (фаза 3-4 настоящих листьев) согласно методике, описанной выше. Вторую обработку фагами проводили через 6 дней после заражения патогеном. В качестве эталона использовали также двукратную обработку препаратом Стрекар, КС (25 г/л фи-тобактериомицина + 70 г/л карбендазима, НПЦ «ФармБиомед», Москва). Для защиты
фагов от воздействия УФ компоненты солнечного света добавляли 0,75% обезжиренного молока [7]. Расход рабочего раствора препаратов составлял 10 мл/10 растений. Повторность вариантов опыта - трехкратная, по 15 растений в каждой.
Оценку развития болезни проводили на 14-е сутки после заражения с помощью ранее разработанной шкалы [12]. Статистическую обработку анализируемых данных проводили методом дисперсионного анализа с помощью программ Statistica 12.0 (StatSoft Co, USA) и Microsoft Excel 2013 (Microsoft Co., USA) при сравнении средних по критерию Дункана. Данные, выраженные в процентах, перед обработкой преобразовывали в арксинусы.
Результаты и обсуждение
Из образцов семян сои, полученных из Амурской и Воронежской областях в 2018 и 2019 гг., нами выделено более 50 изолятов флуоресцирующих псевдомонад, из которых отобраны 4 штамма Pseudomonas savastanoi pv. glycinea. Они были патогенными на растениях сои, идентичны референтному штамму CFBP 2214 по морфологическим признакам культуры на среде Кинга Б, по результатам LOPAT-теста (+, -, -, -,+) и ПЦР-анализа со специфичными праймерами для гена cfl. Список штаммов, а также их происхождение указаны в таблице 1.
Таблица 1
Штаммы Pseudomonas savastanoi pv. glycinea, использованные в работе
Названия штаммов Сорт сои Место выращивания Год выращивания
A31, А7-1, AF-3 Батя Амурская область, Благовещенский район 2018, 2019
В-7 ОАК Пруденс Воронежская область, Лискинский район 2019
CFBP 2214 Нет данных Новая Зеландия 1958
Из образцов почв с полей под посевами сои из Амурской и Воронежской областей, а также из Краснодарского и Хабаровского краев в 2020 г. было выделено 4 изолята фагов, полученных при использовании вышеописанных 5 штаммов бактерии-хозяина.
Тестирование вирулентности изолятов бактериофагов по отношению к штаммам Psg проводили капельным методом (рис. 3). За положительный результат принимали только литическое действие на месте нанесения капли с суспензией фага.
Результаты испытания специфичности 4 изолятов фагов к 5 штаммам патогена представлены в таблице 2. Наиболее вирулентным являлся изолят бактериофага фG17, способный поражать 4 из 5 штаммов бактерии-хозяина, используемых в данном исследовании. Этот изолят был выбран для дальнейшей работы по оценке защитного действия на растениях сои против бактериального ожога.
Рис. 3. Тестирование вирулентности изолятов бактериофагов фв11 и фв17 по отношению к штамму Psg А31 капельным методом
Таблица 2
Специфичность изолятов бактериофагов по отношению к коллекции штаммов Р. 8ауа81апв1 р^ glycinea
——Изоляты фагов Штаммы PsG ——^^^^ <33 <311 <<317 <34
А31 - - + +
А7-1 - + + -
AF-3 - + - -
В-7 + - + -
CFBP 2214 - + + -
Положительная реакция фагов к штаммам Рэд, % 20 60 80 20
Представляет интерес то, что два из четырех изолятов бактериофагов (фGП и фG17) были вирулентны по отношению к референтному штамму CFBP 2214, выделенному в Новой Зеландии в 1958 г. Штамм патогена А7-1 из Амурской области имел идентичный референтному фаготип. Остальные штаммы патогена также поражались чаще двумя изолятами бактериофагов, а два фага (фG3 и фG4) были вирулентны только к одному штамму бактерии, соответственно А31 и AF-3.
Результаты двух независимых вегетационных экспериментов приведены в таблице 3. Обработка вегетирующих растений сои суспензией бактериофага фG17 при искусственном заражении приводила к снижению развития болезни почти в 4 раза в варианте с обработкой бактериофагами в сравнении с контролем. Таким образом, биологическая эффективность применения фагового препарата была близка к эффективности эталонного пестицида Стрекар, КС, составив примерно 75%.
Таблица 3
Эффективность бактериофагового препарата на основе изолята фG17 против бактериального ожога сои при искусственном заражении (сорт Батя, 2020)
Название препарата Эксперимент 1 (июль 2020 г.) Эксперимент 2 (август 2020 г.) Среднее
Р, % R, % БЭ, % Р, % R, % БЭ, % Р, % R, % БЭ, %
Контроль (вода) 93,2 а 62,4 а - 86,6 а 49,6 а - 89,9 56,0 -
Стрекар, КС, (0,5%) -эталон 24,4 Ь 13,1 Ь 79,0 26,6 Ь 11,0 Ь 77,8 25,5 12,1 78,4
Суспензия бактериофага <317, 107 БОЕ/мл 26,6 Ь 15,9 Ь 74,5 28,7 Ь 12,4 Ь 75,0 27,7 14,2 74,8
Примечание. В таблице между вариантами, обозначенными одинаковыми буквами, отсутствуют статистически достоверные различия по критерию Дункана при 95%-ном уровне вероятности.
Выводы
1. Из зараженных растений сои выделены и охарактеризованы как Psg штаммы, вызывающие бактериальный ожог сои. Их свойства совпадали с референтным штаммом CFBP 2214 по результатам LOPAT-тестов, ПЦР-анализа на ген коронафакат лигазы, и частично - по профилю вирулентности бактериофагов.
2. Из образцов почвы выделено 4 изолята бактериофагов с использованием 5 штаммов-мишеней Psg. Все они проявляли штамм-специфическое литическое действие по отношению к 5 штаммам патогена.
3. По результатам фаготипирования предложен для использования при защите сои от бактериального ожога бактериофаг фG17, способный поражать 4 из 5 штаммов патогена.
4. Обработка вегетирующих растений бактериофагом фG17 при искусственном заражении Psg способствовала значительному снижению развития болезни (почти в 4 раза) по сравнению с вариантом без обработки и биологической эффективности в 74,8%, статистически неразличимой от применения эталонного пестицида Стре-кар, КС, в рекомендованной концентрации препарата 0,5%.
Выполнено в рамках тематического плана-задания на выполнение науч-но-исследовательскихработ Федеральным государственным бюджетным образовательным учреждением высшего образования «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева» по заказу Министерства сельского хозяйства Российской Федерации за счет средств федерального бюджета в 2020 г.
Библиографический список
1. Qi, M. Genome Sequence Analyses of Pseudomonas savastanoi pv. glycinea and Subtractive Hybridization-Based Comparative Genomics with Nine Pseudomonads / M. Qi, D. Wang, С.А. Bradley, Y. Zhao // PLoS ONE. - 2011. - № 6 (1), e16451. DOI: 10.1371/journal.pone.0016451.
2. Игнатов А.Н. Распространение бактериальных и фитоплазменных болезней растений в России / А.Н. Игнатов // Защита и карантин растений. - 2015. - № 5. -
C. 6-10.
3. Глобальная база данных ЕОКЗР. URL: https://gd.eppo.int/taxon/PSDMGL.
4. Jagtap D. Bio-efficacy of different antibacterial antibiotic, plant extracts and bioagents against bacterial blight of soybean caused by Pseudomonas savastanoi pv. glycinea /
D. Jagtap // Scientific Journal of Microbiology. - 2012. - № 1 (1). - P. 1-9.
5. Ignjatov M. Characterization of Pseudomonas savastanoi pv. glycinea isolates F Лазарев А.М., rom Vojvodina / M. Ignjatov // Phytopathologia Polonica. - 2007. - № 4. -P. 43-54.
6. Лазарев А.М. Ареал и зона вредоносности угловатой пятнистости (бактериального ожога) сои / А.М. Лазарев // Пути повышения эффективности использования ресурсов зернобобовых в селекции. - СПб., 2016. - С. 72-74.
7. ОрынбаевА.Т., и др. Выделение бактериофагов Xanthomonas campestris pv. campestris и их использование для защиты капусты от сосудистого бактериоза / А.Т. Орынбаев и др. // Известия ТСХА. - 2019. - № 2. - С. 35-48.
8. Fatmi M. // Detection of Plant-Pathogenic Bacteria in Seed and Other Planting Material, First Edition. The American Phytopathological Society (APS) / M. Fatmi, R.R. Walcott, N.W. Schaad Minnesota. - USA, 2017. - P. 372.
9. Lelliott R.A. Methods in Plant Pathology. Vol. 2: Methods for the Diagnosis of Bacterial Diseases of Plants. Blackwell Scientific Publications. - Oxford, UK, 1987. -P. 216.
10. Бактериофаги: биология и практическое применение / Под ред. Э. Каттер, А. Сулаквелидзе: Пер. с англ. - коллектив переводчиков; Науч. ред. А.В. Летаров. -М.: Научный мир, 2012. - 640 с.
11. Jones, Jeff. Bacteriophages for Plant Disease Control // Annual review of phytopathology. - 2007. - № 45. - P. 245-262. DOI: 10.1146/annurev.phyto.45.062806.094411.
12. Jadhav, Sachin. Grading of Soybean Leaf Disease Based on Segmented Image Using K-means Clustering // IAES International Journal of Artificial Intelligence. - 2016. -P. 15-18. DOI: 5. 13. 10.11591/ijai.v5.i1.pp13-21.
13. Semangun H. Penyakit-Penyakit Tanaman Pangan di Indonesia // Gadjah Mada University Press. - 2004. - Yogyakarta. - P. 145.
14. Farhatullah Dr. Genetic analysis of race-specificity of Pseudomonas savastanoi pv. glycinea // Pakistan Journal of Botany. - 2011. № 43. - P. 7-13.
15. Nomura K., Melotto M. Suppression of host defense in compatible plant-Pseudo-monas savastanoi interactions / К. Nomura, М. Melotto // Curr Opin Plant Biol. - 2005. -№ 8. - P. 361-368.
16. Diseases of Soybean (Glycine max [L.] Merr.) Glen L. Hartman, collator (last update: 6/25/15). URL: https://www.apsnet.org/edcenter/resources/commonnames/Pages/ Soybean.aspx.
17. Young JM, Saddler GS, Takikawa Y, DeBoer SH, Vauterin L. et al. Names of plant pathogenic bacteria 1864-1995. Rev Plant Pathol. - 1996. - № 75. - Р. 721-763.
18. Monteil C.L. Population-genomic insights into emergence, crop adaptation and dissemination of Pseudomonas savastanoi pathogens / C.L. Monteil // Microbial genomics. - 2016. - Vol. 2. - № 10. DOI: 10.1099/mgen.0.000089.
19. Abo-Moch F. Determination of Races of Pseudomonas savastanoi pv. glycinea Occurring in Europe / F. Abo-Moch А. Mavridis, К. Rudolph. Journal of Phytopathology. -2008. - Vol. 143. - P. 1-5. DOI: 10.1111/j.1439-0434.1995.tb00190.x.
20. Заостровных В.И. Мониторинг видового состава болезней сои в различных зонах соесеяния / В.И. Заостровных // Дальневосточный аграрный вестник. -2018. - № 4 (48). - С. 51-67.
21. OEC - Soybeans (HS92: 1201) Product Trade, Exporters and Importers". oec. world. Retrieved May 17, 2020).
22. Fujiwara A. Biocontrol of Ralstonia solanacearum by treatment with lytic bacteriophages / А. Fujiwara, М. Fujisawa, R. Hamasaki, Т. Kawasaki, F. Makoto Yamada // Applied and Environmental Microbiology. - 2011. - Vol. 77 (12). - P. 4155-4162.
23. Volksch В. Biological Control of Pseudomonas savastanoi pv. glycinea by Epiphytic Bacteria under Field Conditions / B. Volksch // Microbial Ecology. - 2001. - Vol. 41 (2). - P. 132-139.
24. Keen N.T. New disease resistance genes in soybean against Pseudomonas savastanoi pv glycinea: evidence that one of them interacts with a bacterial elicitor / N.T. Keen, R.I. Buzzell // Theoret. Appl. Genetics. - 1991. - Vol. 81. - P. 133-138. URL: https://doi. org/10.1007/BF00226123.
25. Giesler L.J. Bacterial diseases of soybean. The Board of Regents of the University of Nebraska on behalf of the University of Nebraska-Lincoln Extension, 2011. - P. 1-2.
26. Krawczyk K. Kosakoniacowanii as the New Bacterial Pathogen Affecting Soybean (Glycine max Willd.) / К. Krawczyk, N. Borodynko-Filas // European Journal Plant Pathology. - 2020. - Vol. 157. - P. 173-183. URL: https://doi.org/10.1007/ s10658-020-01998-8.
27. Магомедов К.Г. Влияние регуляторов роста на структуру урожая и урожайность сои / К.Г. Магомедов // Фундаментальные исследования. - 2008. - № 5. -С.35-37.
28. Schaad N. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria / N. Schaad, J.B. Jones, W. Chun // APS Press St. Paul, Minnesota, USA. - 2001. - P. 373.
ISOLATION OF SPECIFIC BACTERIOPHAGES -
PSEUDOMONAS SAVASTANOI PV. GLYCINEA - AND THEIR USE IN SOYBEAN BACTERIAL BLIGHT CONTROL
R.I. TARAKANOV1, A.N. IGNATOV2- 3, F.S. DZHALILOV1
(' Russian State Agrarian University - Moscow Timiryazev Agricultural Academy 2 "FitoInzheneriya (PhytoEngineering)" R&D Center 3 Russian University of People's Friendship)
Bacterial blight is one of most harmful diseases of legumes, reducing the profitability of soybean production in Russian Federation. Among a number of Pseudomonas isolates obtained from diseased seeds and plants of soybean, 4 strains were selected and confirmed as Pseudomonas savas-tanoi pv. glycinea (Psg). Properties of the isolated bacteria were similar to type strain of Psg CFBP 2214 in plant virulence, LOPAT tests, and PCR analysis for coronafacate ligase gene, and partly -in the phage reaction profile. Four isolates of bacteriophages specific to Psg were obtained from soil samples taken from fields with soybean crops. Virulence testing for the bacteriophages showed that bacteriophage 0G17 infected 4 of 5 tested Psg strains, and it was chosen for further experiments with bacterial blight control. The bacteriophague effect control conducted on soybentplants inoculated by Psg experiments confirmed that 2 treatments of plants by the bacteriophage significantly reduced the disease development. Biological effect of the bacteriophage application was 74.75%, which is very close to the pesticide Strekar in a concentration of 0.5%.
Key words: soybean bacterial blight, bacterial diseases, bacteriophages, biological control ofplant diseases, organic farming, Pseudomonas savastanoi pv. glycinea
References
1. Qi, M., Wang D., Bradley C.A., Zhao Y. Genome Sequence Analyses of Pseudomonas savastanoi pv. glycinea and Subtractive Hybridization-Based Comparative Genomics with Nine Pseudomonads // PLoS ONE. 2011. 6(1), e16451. DOI: 10.1371/journal. pone.0016451.
2. Ignatov A.N. Rasprostranenie bakterialnykh i fitoplazmennykh bolezney rasteniy v Rossii [Spread of bacterial and phytoplasmic plant diseases in Russia] // Zashhita i karan-tin rasteniy. 2015; 5: 6-10. (In Rus.)
3. Globalnaya baza dannyx EOKZR [EPPO Global Database] // [Electronic resource] https://gd.eppo.int/taxon/PSDMGL. (In Rus.)
4. Jagtap D. Bio-efficacy of different antibacterial antibiotic, plant extracts and bioagents against bacterial blight of soybean caused by Pseudomonas savastanoi pv. gly-cinea // Scientific Journal of Microbiology. 2012; 1(1): 1-9.
5. Ignjatov M. Characterization of Pseudomonas savastanoi pv. glycinea isolates From Vojvodina // Phytopathologia Polonica. 2007; 4: 43-54
6. LazarevA.M., Areal i zona vredonosnosti uglovatoy pyatnistosti (bakterial'nogo ozhoga) soi [Area and zone of harmfulness of angular spotting (fire blight) of soybeans // Puti
povysheniya effektivnosti ispol'zovaniya resursov zernobobovykh v selektsii. Sankt-Peter-burg. 2016: 72-74. (In Rus.)
7. OrynbaevA.T. etal. Vydelenie bakteriofagov Xanthomonas campestris pv. camp-estris i ikh ispolzovanie dlya zashhity kapusty ot sosudistogo bakterioza [Isolation of bac-teriophages Xanthomonas campestris pv. campestris and their use to protect cabbage from vascular bacteriosis] // Izvestiya TSXA. 2019; 2: 35-48. (In Rus.)
8., M. Fatmi, R.R. Walcott., N.W. Schaad // Detection of Plant-Pathogenic Bacteria in Seed and Other Planting Material, First Edition. The American Phytopathological Society (APS). Minnesota, USA. 2017: 372.
9. Lelliott R.A. Methods in Plant Pathology Vol. 2: Methods for the Diagnosis of Bacterial Diseases of Plants. Blackwell Scientific Publications. Oxford, UK. 1987: 216
10. Bakteriofagi: biologiya i prakticheskoe primenenie [Bacteriophages: biology and practical application] / Ed. by E. Katter, A. Sulakvelidze // Translated from Englisfsh by a group of translators; ed. by A.V. Letarov. - Moskva: Nauchniy mir, 2012: 640. (In Rus.)
11. Jones, Jeff. Bacteriophages for Plant Disease Control // Annual review of phytopathology.2007.45.P. 245-262. DOI: 10.1146/annurev.phyto.45.062806.094411.
12. Jadhav, Sachin. Grading of Soybean Leaf Disease Based on Segmented Image Using K-means Clustering // IAES International Journal of Artificial Intelligence. 2016: 15-18. DOI: 5. 13. 10.11591/ijai.v5.i1.pp13-21.
13. Semangun H. Penyakit-Penyakit Tanaman Pangan di Indonesia // Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. 2004: 145.
14. Farhatullah Dr. Genetic analysis of race-specificity of Pseudomonas savastanoi pv. glycinea // Pakistan Journal of Botany. 2011; 43: 7-13.
15. Nomura K., Melotto M. Suppression of host defense in compatible plant-Pseu-domonas savastanoi interactions // Curr Opin Plant Biol. 2005; 8: 361-368.
16. Diseases of Soybean (Glycine max [L.] Merr.) Glen L. Hartman, collator (last update: 6/25/15) https://www.apsnet.org/edcenter/resources/commonnames/Pages/Soy-bean.aspx.
17. Young JM, Saddler GS, Takikawa Y, DeBoer SH, Vauterin L, et al. Names of plant pathogenic bacteria 1864-1995. Rev Plant Pathol. 1996; 75: 721-763.
18. Monteil C.L. Population-genomic insights into emergence, crop adaptation and dissemination of Pseudomonas savastanoi pathogens // Microbial genomics. - 2016; 2; 10. DOI: 10.1099/mgen.0.000089
19. Abo-Moch F., Mavridis A., Rudolph K. Determination of Races of Pseudomonas savastanoi pv. glycinea Occurring in Europe. Journal of Phytopathology. 2008; 143: 1-5. DOI: 10.1111/j.1439-0434.1995.tb00190.x.
20. Zaostrovnykh V.I. Monitoring vidovogo sostava bolezney soi v razlichnykh zon-akh soeseyaniya [Monitoring of the species composition of soybean diseases in different zones of soybean growing] // Dal'nevostochniy agrarniy vestnik. 2018; 4 (48): 51-67. (In Rus.)
21. OEC - Soybeans (HS92: 1201) Product Trade, Exporters and Importers". oec. world. Retrieved May 17, 2020.
22. Fujiwara A., FujisawaM., Hamasaki R., Kawasaki T., Makoto F., Yama-da T. Biocontrol of Ralstonia solanacearum by treatment with lytic bacteriophages // Applied and Environmental Microbiology. 2011; 77(12): 4155-4162
23., B. Volksch. Biological Control of Pseudomonas savastanoi pv. glycinea by Epiphytic Bacteria under Field Conditions // Microbial Ecology. 2001; 41 (2): 132-139.
24. Keen N.T., Buzzell R.I. New disease resistance genes in soybean against Pseudomonas savastanoi pv glycinea: evidence that one of them interacts with a bacterial elici-tor // Theoret. Appl. Genetics. 1991; 81: 133-138. https://doi.org/10.1007/BF00226123
25. Giesler L.J. Bacterial diseases of soybean. The Board of Regents of the University of Nebraska on behalf of the University of Nebraska-Lincoln Extension. 2011: 1-2.
26. Krawczyk K., Borodynko-Filas N. Kosakoniacowanii as the New Bacterial Pathogen Affecting Soybean (Glycine max Willd.) // European Journal Plant Pathology. 2020; 157: 173-183. https://doi.org/10.1007/s10658-020-01998-8
27. Magomedov K.G. Vliyanie regulyatorov rosta na strukturu urozhaya i uro-zhaynost' soi // Fundamentalnye issledovaniya. 2008; 5: 35-37.
28. Schaad N., Jones J.B., Chun W. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria // APS Press St. Paul, Minnesota, USA. 2001: 373.
Тараканов Рашит Ислямович, магистрант кафедры защиты растений РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49; тел.: (499) 976-12-79; e-mail: tarakanov.rashit@mail.ru).
Игнатов Александр Николаевич, заместитель генерального директора по научной работе, доктор биологических наук, Исследовательский центр ООО «ФитоИнженерия» (141880, Московская область, Рогачево, ул. Московская, 58, Российская Федерация); Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов» (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6; тел.: (926) 197-36-00; e-mail: an.ignatov@gmail.com).
Джалилов Февзи Сеид-Умерович, доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой защиты растений РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49; тел.: (499) 976-12-79; e-mail: labzara@mail.ru).
Rashit I. Tarakanov - postgraduate student, the Plant Protection Department, Russian State Agrarian University - Moscow Timiryazev Agricultural Academy (127550, Moscow, Timiryazevskaya Str., 49; phone: (499) 976-12-79; e-mail: tarakanov.rashit@mail.ru).
Aleksandr N. Ignatov - DSc, Research Director, "Fitolnzheneriya (PhytoEn-gineering)" R&D Center, Moskovskaya Str., 58, 141880, Rogachevo, Moscow reg., Russian Federation; Peoples' Friendship University of Russia, Miklukho-Maklay Str., 6, 117198, Moscow; phone: (9926) 197-36-00; e-mail: an.ignatov@gmail.com
Fevzi S. Dzhalilov - DSc (Bio), Professor, Head of the Plant Protection Department, Russian State Agrarian University - Moscow Timiryazev Agricultural Academy (127550, Moscow, Timiryazevskaya Str., 49; phone: (499) 976-12-79; e-mail: labzara@mail.ru).
