CC BY
11
DOI: 10.37489/0235-2990-2021-66-9-10-4-11 Оригинальная статья/Original Article
Выделение актиномицетов редких родов — продуцентов антибиотиков из почв с применением сока Aloe arborescens
*О. Н. СИНЁВА
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва, Российская Федерация
Isolation of Rare Genera of Actinomycetes — Antibiotic Producers from Soils Using Aloe Arborescens Juice
*OLGA N. SINEVA
Gause Institute of New Antibiotics Moscow, Russian Federation Резюме
В настоящее время актуальной проблемой является поиск новых антибиотиков, в связи с распространением устойчивости патогенных микроорганизмов к существующим антибактериальным препаратам. Актиномицеты являются продуцентами большого количества антибиотиков, применяемых в медицине. Большинство антибиотиков выделено из актиномицетов рода Streptomyces, в то же время актиномицеты редких родов могут быть продуцентами новых антибиотиков.
Цель: изучить влияние комплекса биологических веществ сока алоэ на стимуляцию роста актиномицетов редких родов.
Материал и методы. Объекты: образцы дерново-подзолистой почвы и чернозёма. Для выделения актиномицетов использовали стандартный метод посева почвенных суспензий на овсяный агар и среду № 2 Гаузе. Хемотак-сономические признаки определяли с помощью методов восходящей тонкослойной хроматографии. Родовую принадлежность культур определяли по определителю Берджи и материалам сравнения состава клеточных стенок актинобактерий. Для изучения геносистематических признаков проводили выделение ДНК, полимеразную цепную реакцию со стандартными праймерами 27f и 1492r, секвенирование по Сенгеру. Антибиотическую активность определяли в отношении тест-микроорганизмов: Staphylococcus aureusИНА 00985 (FDA 209P), Staphylococcus aureus ИНА 00761 (MRSA), Staphylococcus aureus ИНА 00762 (УФ-2), Micrococcus luteus ATCC 9341, Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Saccharomyces cerevisiae ИНА 01042. Результаты. При добавлении сока алоэ из образцов дерново-подзолистой почвы и чернозёма выделено 527 культур актиномицетов, определено их филогенетическое положение. Доминирующими актиномицетами в исследованных образцах почвы являются представители рода Streptomyces. На втором месте по количеству выделенных культур — представители рода Micromonospora. Выделены также актиномицеты редких родов: Nonomuraea, Strep-tosporangium, Nocardia, Actinomadura, Actinocorallia, Pseudonocardia, Amycolatopsis, Saccharomonospora, Saccharopo-lyspora, Promicromonospora, Kribbella. Установлено, что выделенные культуры обладают антибиотической активностью в отношении тест-микроорганизмов.
Заключение. Для выделения актиномицетов из почвы и выявления их биоразнообразия целесообразно применять сок алоэ, предварительно подвергнув листья биостимуляции.
Ключевые слова: продуценты антибиотиков; актиномицеты; сок алоэ; Streptomyces
Для цитирования: Синёва О. Н. Выделение актиномицетов редких родов — продуцентов антибиотиков из почв с применением сока Aloe arborescens. Антибиотики и химиотерапия. 2021; 66: 9-10: 4-11. doi: 10.24411/0235-2990-202166-9-10-4-11.
Abstract
The search for new antibiotics is an urgent problem due to the spread of resistance to existing antibacterial drugs in pathogenic microorganisms. Actinomycetes are producers of a large number of antibiotics used in medicine. Most antibiotics are isolated from actinomycetes of the Streptomyces genus, while rare genera of actinomycetes can be the producers of new antibiotics.
The aim of the study is to investigate the effect of the biological substances complex present in aloe juice on the growth stimulation of rare genera of actinomycetes.
Material and methods. Objects: samples of sod-podzolic soil and chernozem. The standard method of sowing soil suspensions on oat agar and Gause medium No. 2 was used to isolate actinomycetes. Chemotaxonomic properties were determined using the methods of ascending thin-layer chromatography on a cellulose layer. The generic identity of cultures was determined using Bergey's manual and materials comparing the composition of cell walls of actinobacteria. DNA PCR with standard 27f and 1492r primers, as well as Sanger sequencing, were performed to study genosystematic features. Antibiotic activity was determined against the test microorganisms: Staphylococcus
© Коллектив авторов, 2021
*Адрес для корреспонденции: ул. Большая Пироговская, д. 11, стр. 1, НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе г. Москва, Российская Федерация, 119021. E-mail: olga.sineva81@yandex
© Team of Authors, 2021
"Correspondence to: 11 bld 1 Bolshaya Pirogovskaya st., Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, 119021 Russian Federation. E-mail: olga.sineva81@yandex
aureus HHA 00985 (FDA 209P), Staphylococcus aureus HHA 00761 (MRSA), Staphylococcus aureus HHA 00762 (y<O-2), Micrococcus luteus ATCC 9341, Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Saccharomyces cerevisiae HHA 01042.
Results. A total of 527 actinomycete cultures were isolated from samples of sod-podzolic soil and chernozem with the addition of aloe juice; their phylogenetic position was determined. The dominant actinomycetes in the studied soil samples are the representatives of the genus Streptomyces. Bacteria of the genus Micromonospora take the second place by the number of isolated cultures. Rare genera of actinomycetes have also been identified: Nonomuraea, Strep-tosporangium, Nocardia, Actinomadura, Actinocorallia, Pseudonocardia, Amycolatopsis, Saccharomonospora, Sac-charopolyspora, Promicromonospora, Kribbella. It was determined that the isolated cultures possess antibiotic activity against test microorganisms.
Conclusion. It is advisable to use aloe juice after subjecting the leaves to biostimulation to isolate actinomycetes from the soil and identify their biodiversity.
Keywords: antibiotic producers; actinomycetes; aloe juice; Streptomyces
For citation: Sineva O. N. Isolation of rare Genera of actinomycetes — antibiotic producers from soils using AloeArborescens juice. Antibiotiki i Khimioter = Antibiotics and Chemotherapy. 2021; 66: 9-10: 4-11. doi: 10.24411/0235-2990-2021-66-9-10-4-11.
Введение
Большинство используемых в медицине антимикробных препаратов разработано на основе природных метаболитов бактерий и грибов. Актино-мицеты, грамположительные мицелиальные бактерии порядка ЛсйпотусвТа1вз являются продуцентами таких классов антибиотиков, как макролиды, антрациклины, полиэфирные антибиотики, циклополилактоны, аминогликозиды, стрептот-рицины, актиномицины, хиноксалиновые пептиды, гликопептиды и др. Для поиска актиноми-цетов — продуцентов биологически активных соединений разрабатываются методы селективной изоляции [1]. В качестве селективных агентов для выделения культур актиномицетов из природных источников широко используют антибиотики, ан-тифунгальные препараты или их комбинации [2-4], применяют обработку сухим жаром [5, 6], химическими веществами [6], используют вещества растительного или животного происхождения [7, 8], также применяют комплексные методы [9-11].
В нашем исследовании для выделения акти-номицетов был использован сок Алоэ древовидного (Л1ов атЬотвзсвт) — вид растений рода Алоэ семейства Асфоделовые. Сок алоэ содержит биологически активные вещества: алоэ-эмодин (гид-роксиантрахинон, который обладает антибактериальным, противогрибковым, противовирусным действием) [12-15], аминокислоты, стероиды, производные антрацена, эфирные масла, органические кислоты, аллантоин, полисахариды, флаво-ноиды, микроэлементы, сок богат ферментами, витаминами, содержит бета-каротин и др. [13, 16].
Материал и методы
Объектами исследования были образцы дерново-подзолистой почвы (образец № 1, отобранный в г. Москве) и чернозёма (образец № 2, отобранный в Оренбургской области). Образцы почвы были отобраны в летний период из верхних горизонтов почвы (горизонт А).
Для выделения и дифференцированного подсчёта колоний актиномицетов использовали стандартный метод посева почвенных суспензий на плотные питательные среды — овся-
ный агар и органический агар № 2 Гаузе [17, 18]. Для приготовления почвенных суспензий использовали сок алоэ, выделенный по методике: срезанные листья алоэ древовидного помещали в тёмное место при температуре +4°С на 10 дней. Листья протирали 70% этиловым спиртом, разрезали и отжимали сок. Свежевыжатый сок пропускали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Полученный фильтрат добавляли в пробирку с дистиллированной стерильной водой, конечная концентрация сока алоэ составляла 10 и 50%. Посевы инкубировали в термостате при температуре 28°С в течение 14 дней.
Количество актиномицетов в 1 г почвы определяли по числу колоний, выросших на твёрдой питательной среде. Далее колонии выделяли в чистую культуру на среду № 2 Гаузе и овсяный агар и определяли систематическое положение выделенных культур.
Для оценки численности актиномицетов в почве и обработки данных, полученных при хранении актиномицетов, использовали методы математической статистики, доверительную вероятность принимали равной 0,95 [19]. Статистическую обработку данных проводили в программе Exel 2010 (Microsoft Inc., 2011).
Изучение фенотипических признаков: культуры, выращенные на овсяном агаре, просматривали в микроскоп OLIMPUS BX-41, культуральные признаки определяли по окраске воздушного и субстратного мицелия.
Хемотаксономические признаки (наличие изомеров ди-аминопимелиновой кислоты (ДАПК) и анализ дифференцирующих сахаров в гидролизатах клеток определяли с помощью методов восходящей тонкослойной хроматографии в целлюлозном слое [20].
Используя полученные данные о составе клеточных стенок, определяли родовую принадлежность культур по определителю Берджи [21] и материалам сравнения состава клеточных стенок у актинобактерий [22].
Для изучения геносистематических признаков проводили сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК.
Выделение ДНК и полимеразнцю цепную реакцию проводили согласно методике Н. А. Манучаровой [23], используя набор для выделения Power Soil DNA Isolation Kit (MO BIO, США). Для проведения полимеразной цепной реакции использовали праймеры: 27f (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и 1492r (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') фирмы «СИНТОЛ» (Россия). Амплификацию проводили на автоматическом ам-плификаторе 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, США). Для ПЦР-амплификации использовали набор реагентов фирмы «Thermo Fisher Scientific» (США).
Очистку амплифицированной ДНК от праймеров и других компонентов ПЦР-реакции проводили методом прямого переосаждения ДНК в мягких условиях (http://www.genome-centre.ru/info.html). Для определения нуклеотидной последовательности использовали праймеры: 27f , 1492r, 341f — gcd
(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG — 3'), 785f (5-GGMTTAGA-TACCTGGTAGTCC-3'), фирмы «СИНТОЛ» (Россия). Реакцию сек-венирования проводили на автоматическом амплификаторе 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, США). Секвенирование проводили на автоматическом капиллярном секвенаторе 3500 Genetic Analyser (Applied Biosistems, США) с использованием реагентов BigDye Terminator v3 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosistems, США), в соответствии с рекомендациями производителя.
Идентификацию актиномицетов осуществляли методом сравнения нуклеотидной последовательности ПЦР-фрагмен-тов генов 16S рРНК с последовательностями, представленными в базе данных GenBank NCBI по протоколу nBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) и Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu). Дендрограммы были построены с помощью алгоритма «neighbor-joining» в программе MEGA 6.
Выделенные из почвы культуры были проверены на антибиотическую активность (методом перпендикулярных штрихов и методом агаровых лунок) в отношении тест-организмов: Staphylococcus aureus ИНА 00985 (FDA 209P), S.aureus ИНА 00761 (MRSA), S.aureus ИНА 00762 (УФ-2), Micrococcus luteus ATCC 9341, Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Saccharomyces cerevisiae ИНА 01042.
Состав жидких питательных сред: среда А4: соя — 10,0 г/л, глюкоза — 10,0 г/л, NaCl — 5,0 г/л, CaCO3 — 2,5 г/л, дистиллированная вода; рН=7,2-7,4; среда «сах»: сахароза — 20,0 г/л, соя — 10,0 г/л, KNO3 — 2,0 г/л, NaCl — 3,0 г/л, CaCO3 — 3,0 г/л, дистиллированная вода; рН=7,0.
Результаты и обсуждение
Исследование влияния сока алоэ на выделение актиномицетов из почвенных образцов показало, что сок алоэ, добавленный в почвенные суспензии в концентрациях 10 и 50%, способствует увеличению количества выделенных актиномицетов. Данная закономерность установлена для обоих типов почв (рис. 1, 2).
Идентификация на основании морфологических и хемотаксономических признаков выделенных актиномицетов позволила оценить соотношение количества выделенных актиномицетов
Рис. 2. Количество актиномицетов, выделенных из образца дерново-подзолистой почвы: a — овсяная среда; b — среда № 2 Гаузе.
Fig. 2. The number of actinomycetes isolated from a sample of sod-podzolic soil: a — oat medium; b — Gause medium No. 2.
Рис. 1. Количество актиномицетов, выделенных из образца чернозёма: a — овсяная среда; b—среда № 2 Гаузе. Fig. 1. The number of actinomycetes isolated from a sample of chernozem: a — oat medium, b—Gauze medium No. 2.
широко распространённого рода Б^врТотусвз и актиномицетов редких родов. Для образца чернозёма было отмечено высокое содержание актиномицетов редких родов: 21-24% — в контроле и 22-29% — в опытных вариантах с добавлением сока алоэ при культивировании на среде № 2 Гаузе, 14-16% — в контроле и 18-19% — в опытных вариантах при культивировании на овсяной среде. Самый большой процент культур актиномицетов редких родов (29%) был выявлен при добавлении 50% сока алоэ, выдерживании суспензии 10 мин и посеве на среду № 2 Гаузе. Доля выделенных ак-тиномицетов редких родов в дерново-подзолистой почве была меньше: 8-10% — в контроле и 11-18% — в опытных вариантах при культивировании на среде № 2 Гаузе, 16-17% — в контроле и
37
92
С
-Micromonospora_sp._OS/1
■ Micromori ospora_coxen sis_sl rain_FoRo65
■ Micromonospora_sp._OS/6
100
M icro mon ospora_sp._OS/4 M¡cromonospora_peucetia_isolate_Y70 Micro mo nospora_peucetia_strain_DS M_43363
991 Micro monospora_sp._OS/5 'DO I Micromonospora purpurea X92595
Micromoriospora_$p _OS/3
60
0.005
Рис. 3. Филогенетическое дерево культур рода Micromonospora. Fig. 3. Phylogenetic tree of cultures of the Micromonospora genus.
if, - Slreptoepofangium_alburn_slrain_DSM_43023
I Slfeptosporan9ium_sp _OSH4 Streptcspor3rpg>um_roseurri^strain_OSM_43ti21 — $trepto$porartgium_canum_itrain_7i77
Slrept ospora ngium_kcxeanu m_strain_H BUM 176012 Stfeptosporan9ium_sp._OS/IO
Nooomuraea.sp _OSfi7 Nonomuraea_afrpcana_$líamjFO_i4745 Nonomuraea_S3air>onea-strair^DSM_4367& Nonomuraeajurkmeniaca_stfBin_OSM_43926
Streptosporsng ium_sonchi_stra m_NE AU-QS7 Streptosporangium_purpuratum_strain_CY-15110
Streptosporangium jiaohe*níí_sirain_NEAU-Jh1 -4 Slreplosporarvgrum_sp _0S/6
Рис. 4. Филогенетическое дерево культур родов Streptosporangium и Non-omuraea.
Fig. 4. Phylogenetic tree of cultures of the Streptosporangium and Nonomuraea genera.
16-24% — в опытных вариантах при культивировании на овсяной среде. Таким образом, использование сока алоэ помогло увеличить долю выделенных актиномицетов редких родов из образца дерново-подзолистой почвы.
В большинстве вариантов при добавлении сока алоэ наблюдалось пропорциональное увеличение количества выделенных колоний акти-номицетов редких родов и колоний актиномице-тов, распространённого рода БТгвротусвз, т. е. были созданы условия для активного роста представителей обеих групп актиномицетов, но в некоторых вариантах удалось увеличить долю выделенных актиномицетов редких родов.
Всего в ходе работы в чистую культуру было выделено 527 штаммов актиномицетов. Предварительная идентификация выделенных культур актиномице-тов показала, что 426 штаммов актиномицетов относятся к роду БгврТотусвз, 44 штамма— к распространённому роду М1-сготопозрога, 57 штаммов — к другим редким родам: Ыоп-отигава, БКврТозрога^шт, Ыосагйт, Лсйпо-
согаШа, Рзвийопосагй1а, Лтусо-Шорз1з, БассНаготопозрога, НассНагороХузрога, Рготсгото-позрога, КпЬЪвИа.
На втором месте по количеству выделенных колоний в обоих типах почв были ак-тиномицеты рода Мгсготопо-зрога, из образца дерново-подзолистой почвы была выделена 21 культура, из образца чернозёма 23 культуры микромоноспор.
Филогенетический анализ был проведён для 6 культур — М1сготопозрога эр. OS/1, Мсго-топозрога эр. OS/2, М1сготопо-зрога эр. OS/3, М1сготопозрога эр. OS/4, Мсготопозрога эр. OS/5, Мсготопозрога эр. OS/6, проявляющих способность к синтезу антибиотиков. Культуры под номерами OS/1, OS/2, OS/3 были выделены из образца дерново-подзолистой почвы, культуры под номерами OS/4. С)8/5, OS/6 — из образца чернозёма. Филогенетическое дерево для данных культур приведено на рис. 3.
В обоих типах почв присутствовали актиномицеты
M¡cromonospora_coriariae_s(rain_NAR01 — Micromonospora_cremea_strain_CR30 Micromonsopora sp. OS/2
семейства Streptosporangia-ceae. Из образца чернозёма было выделено 6 культур актиномицетов рода Streptospo-rangium и 3 культуры рода Nonomuraea; из дерново-подзолистой почвы 3 культуры рода Streptosporangium и 2 культуры рода Nonomuraea. Для 5 культур семейства Strepto-sporangiaceae было установлено филогенетическое положение (рис. 4).
В экспериментах было выделено 13 культур — представителей рода Nocardia (OS 21-OS 33). Все изоляты формировали хорошо развитый субстратный мицелий, некоторые культуры формировали воздушный мицелий. Представители данного рода присутствовали как в дерново-подзолистой почве, так и в чернозёме. Для 8 культур был проведён филогенетический анализ (рис. 5).
В проведённых опытах были выделены представители семейства Thermomono-sporaceae: 8 культур, отнесённых к роду Actinomadura (штаммы OS/34, OS/35, OS/36, OS/37 были выделены из образца дерново-подзолистой почвы, OS/38, OS/39, OS/4Ü, OS/41 — из образца чернозёма) и одна культура под номером OS/42, была отнесена к роду Actinocorallia (выделена из чернозёма). Филогенетическое положение выделенных культур родов Actinomadura и Actinocorallia представлено на рис. 6.
Среди выделенных культур к семейству Pseudonocar-diaceae было отнесено 11 культур актиномицетов. Из образца дерново-подзолистой почвы было выделено 4 культуры рода Pseudonocardia OS/43-OS/46 и одна культура OS/47 была выделена из образца чернозёма. Филогенетическое положение выделенных культур актиномицетов рода Pseudonocardia представлено на рис. 7.
65 100
58
45
100
69 I Nocardia_sp._OS/21
I Nocardia_carnea_strain_zl2-4 — Nocardia_carnea_strain_ATCC_634 Noca rd ia_sp._OS/22 63 1 Nocardia_carnea_strain_DSM_43397 Nocardia_sp._OS/24 Nocardia_sp._OS/25
j- Nc 1— I
60
■ N ocardia_abscessus_stra inj MM IB_D-1592 -Nocardia asteroides strain DSM 43255
ENocard ia_asteroides_strai n_ATCC_19247 cardia_asteroides_sirain_DSM_43757 ,._cardia_asteroides_strain_NBRC_15531 68 I Nocardia_sp _OS/29
Nocardia_brasiiiensis_strain_DSM_43758 Nocsrdia_sp._OS/30
Noca rdia_brasi!iensis_strai п_АТСС_19296 loo I Nocardia_vinacea_strain_MK703-102F1
100
1 Nocardia vinacea strain W7850
100
82 67
Nocardia_cummidelens_strain_173707 — Nocardia_sp._OS/26 Nocardia_cummidelens_strain_R89 Nocard ia_soli_strai n__DSM_44488 Noca rd ia_sp . _OS/28
0.005
Рис. 5. Филогенетическое дерево культур рода Nocardia. Fig. 5. Phylogenetic tree of cultures of the Nocardia genus.
Рис. 6. Филогенетическое дерево культур семейства Thermomonosporaceae. Fig. 6. Phylogenetic tree of cultures of the Thermomonosporaceae family.
P«wHjnoMidia„ip._OS47 PMLKtanecartajw1rcl^ila_sw*iJM5NU_22072 — Pseudor«a«di3_ip QSM6
ТЛря
PseudO(KK3r(>«_yuiwanwie_s4r»n_IHSNU.22019 PMu&!«WMrdia_4> 0SM3 P»mtonocaflji3_aianriiphiia_ttrirt_Y-i 6303
-PMU<JW4C3fde_«Wm0ptlil3_tlf*l_NRRL.B.1978
P«iKloftiicji(Ji4_Mtiuf«a_slrart_iMSNU Ps»uftjn«3f<)ia_ip _S053
-Pievdofto«idia_iHcchaioiytca_«fwi_MO
- P»udoiweaidia_s0_w.w 1203ЧИ -к»» tfr*n_CMKUQ95
OS'-«
PMu0oooeaidn_ca<boKvdivow»_it4ri_Y0 p»vdo<4card4 wäret»
j— fSC«
лП"ри
0005
Рис. 7. Филогенетическое дерево культур актиномицетов рода Pseudono-cardia.
Fig. 7. Phylogenetic tree of actinomycete cultures of the Pseudonocardia genus.
64
■ Amycolatopsis sp. OS/51
■ Amycolalopsis albispora strain WP1
53
- Amycolatopsis acidiphila strain 2-5
- Amycolatopsis sacchari strain K24
-Amycolatopsis sp. strain SM23N
-Amycolatopsis sp. ATCC 39116
Рис. 8. Филогенетическое дерево культур актиномицетов рода Amycolatopsis.
Fig. 8. Phylogenetic tree of actinomycete cultures of the Amycolatopsis genus.
К роду АтусоШор$1$ было отнесено 4 культуры под номерами OS/48-OS/51, все культуры были выделены из образца дерново-подзолистой почвы. Филогенетическое положение культур рода АтусоШорз1з представлено на рис. 8.
Из образца чернозёма были выделены культуры: БассНагоро1узрога эр. OS/56, БассНаготопо-врога эр. OS/57, Ргот1сготоповрога эр. OS/54 и Рготсготопозрога эр. OS/55, КпЬЬвИа эр. OS/52. Из дерново-подзолистой почвы — Ргот1сготопо-врога эр. OS/53.
Результаты первичного определения антибиотической активности показали, что 369 штам-
мов актиномицетов активны в отношении грамположи-тельных тест-организмов, 79 штаммов актиномицетов активны в отношении грам-отрицательных бактерий, 52 штамма актиномицетов проявляли активность в отношении дрожжей. Большинство активных культур принадлежало к роду БГвротусвв.
Антибиотическая активность культур актиномицетов редких родов представлена в табл. 1, 2. Изученные культуры не обладали антибиотической активностью в отношении грамотрицательных тест-организмов. Четыре культуры; Ыосагйт OS/28, БассНагоро1у-врога OS/56 БассНаготоповрога OS/57 и Рготсготопозрога эр. OS/53 были активны в отношении БассНаготусвз свгвргвгав. Выявлена антибиотическая активность у штаммов Ыоп-отигава эр. OS/16, Ыопотигава эр. OS/17 (см. табл. 2).
В экспериментах было показано стимулирующее действие сока алоэ на рост актиномицетов, так же было отмечено снижение количества посторонней микро-биоты (немицелиальных бактерий и грибов).
Известно, что сок алоэ содержит биологически активные вещества — биогенные стимуляторы, которые представляют собой сложный комплекс веществ (органические кислоты, аминокислоты, гуминовые соединения, фос-фолипиды, витамины, микроэлементы и др.) [24]. Действие данных веществ стимулировало прорастание спор актиномицетов. Угнетение роста бактериальных и грибных колоний на чашках Петри можно объяснить присутствием в соке алоэ эмодина, обладающего антибактериальным и антифунгальным действием.
Выявленные отличия между образцами почв в количестве выделенных актиномицетов (из образца чернозёма было выделено в 3,5 раза больше колоний актиномицетов, чем из образца дерново-подзолистой почвы) согласуются с данными литературы — актиномицеты являются ге-теротрофами, в чернозёмах, богатых гумусом,
1001 Amycolatopsis alba strain DSM 44262(2) ' Amycolatopsis alba strain DSM 44262
— Amycolalopsis sp. OS/46
— Amycolatopsis coloradensis strain 173907
- Amycolatopsis orientals strain IMSNU 20053
- Amycolatopsis sp. OS/49 -Amycolatopsis sp. OS/SO
Таблица 1. Антибиотическая активность культур актиномицетов редких родов Table 1. Antibiotic activity of cultures of rare genera actinomycetes
Штаммы актиномицетов Антибиотическая активность в отношении тест-микроорганизмов (зоны подавления, мм)
S.aureus S.aureus S.aureus M.luteus B.subtilis
ИНА 00985 ИНА 00761 (MRSA) ИНА 00761 (УФ-2) ATCC 9341 ATCC 6633
Культуры рода Micromonospora
OS/1 Н/а Н/а Н/а 9,3±0,4 Н/а
OS/2 10,5±1 10,2±0,5 10±1,2 19,8±0,3 10,2±0,2
OS/3 Н/а Н/а 5±0,2 25,5±0,4 15,5±0,6
OS/4 10,2±0,2 10,2±0,7 9,7±0,6 10,5±0,5 Н/а
OS/5 Н/а Н/а 3,1±0,4 20,3±0,4 10,3±0,4
OS/6 10,3±0,4 Н/а 10,5±0,5 20,3±0,4 5,6±0,6
Культуры рода Streptosporangium
OS-10 Н/а Н/а Н/а 22,2±0,8 Н/а
OS-14 Н/а Н/а Н/а 23,8±0,5 Н/а
Культуры рода Nocardia
OS/21 Н/а Н/а Н/а 15,2±0,5 Н/а
OS/29 11,1±0,5 Н/а Н/а 17,2±0,5 Н/а
OS/30 Н/а Н/а Н/а 10,8±0,4 Н/а
OS/32 13,9±0,6 Н/а Н/а 14,5±0,5 11,1±0,5
OS/33 Н/а Н/а Н/а 9,8±0,2 Н/а
Культуры рода Actinomadura
OS/34 Н/а Н/а Н/а 5,3±0,3 5,5±0,3
OS/35 Н/а Н/а Н/а 5,6±0,3 Н/а
OS/36 10,9±0,5 10,5±0,3 15±0,5 5,5±0,3 5,6±0,3
OS/37 9,9±0,4 10,5±0,3 10,2±0,2 10,8±0,4 Н/а
OS/39 5,5±0,3 Н/а 5,6±0,3 5,5±0,3 Н/а
OS/40 Н/а Н/а Н/а 5,3±0,3 Н/а
OS/41 5,6±0,4 5,9±0,5 5,8±0,5 Н/а Н/а
Культуры рода Pseudonocardia
OS/44 2,3±0,3 Н/а 10,2±0,5 10,2±0,7 Н/а
OS/45 10,3±0,4 Н/а 2,5±0,3 3,5±0,4 Н/а
Культура рода Saccharomonospora
OS/57 5,6±0,3 Н/а 10,5±0,5 Н/а Н/а
Культура рода Kribbella
OS/52 10,3±0,3 7,3±0,3 14,6±0,3 10,5±0,5 7±0,5
Примечание. Здесь и в табл. 2: Н/а — антибиотическая активность не обнаружена. Note. Here and table 2: Н/а — no antibiotic activity detected.
Таблица 2. Антибиотическая активность культур рода Nonomuraea на 5-7 сутки роста. Среда А4. Table 2. Antibiotic activity of cultures of the Nonomuraea genus on the 5-7th day of growth. A4 medium. Штаммы рода Nonomuraea Антибиотическая активность в отношении тест-микроорганизмов
(зоны подавления, мм) S.aureus S.aureus S.aureus M.luteus B.subtilis
_ИНА 00985 ИНА 00761 (MRSA) ИНА 00761 (УФ-2) ATCC 9341 ATCC 6633
OS-16_Н/а_Н/а_Н/а_11,4±0,3_Н/а
OS-17 11,5±0,3 11,4±0,4 19,4±0,3 13,3±0,3 11,1±0,4
присутствует большое количество и разнообразие актиномицетов [25]. Почвы Москвы — это почвы с низким содержанием гумуса и высоким содержанием тяжёлых металлов, что оказывает влияние на численность актиномицетов, в то же время, в данном образце почвы было обнаружено большое родовое разнообразие актиномицетов, сравнимое с образцом чернозёма.
Большинство выделенных актиномицетов обладало антибиотической активностью в отношении тест-организмов. В настоящее время большинство антибиотиков выделено из рода Streptomyces, но актиномицеты редких родов являются продуцентами уникальных антибиотиков, таких как рифамицин (Amycolatopsis med-iterranei), эритромицин (Saccharopolyspora
erythraea), тейкопланин (Actinoplanes teichomy-ceticus), ванкомицин (Amycolatopsis orientalis), гентамицин (Micromonospora purpurea) и др. [14, 26, 27]. В нашей работе обнаружена антибиотическая активность у культур актиномицетов редких родов (Micromonospora, Streptosporangium Nocardia, Actinomadura, Pseudonocardia, Saccharomonospora Saccharopolyspora Kribbella, Nonomuraea), которые могут быть потенциальными продуцентами новых биологически активных веществ. Стоит отметить, что культуры Micromonospora OS/2, Micromonospora OS/4, Actinomadura OS/36, Actinomadura OS/37, Actinomadura OS/41, Kribbella OS/52, Nonomuraea OS/17 проявляли активность в отношении ме-тициллинорезистентного стафилококка.
Заключение
Для выделения актиномицетов редких родов из почвы и выявления их биоразнообразия целесообразно применять сок алоэ, предварительно подвергнув листья биостимуляции. Согласно про-
Литература/References
1. Berdy J. Thoughts and facts about antibiotics: Where we are now and where we are heading. The Journal of Antibiotics. 2012; 65 (8): 385-395. doi: 10.1038/ja.2012.27.
2. Терехова Л.П., Галатенко О.А., АлфероваИ.В., Преображенская Т.П. Использование селективных сред для выделения актиномицетов. Преображенская Т.П. ред., В: Поиск продуцентов антибиотиков среди актиномицетов редких родов. Гылым (Алма-Ата). 1990. [Te-rekhova L.P., Galatenko O.A., Alferova I.V., Preobrazhenskaya T.P. Ispol'zovanie selektivnykh sred dlya vydeleniya aktinomitsetov. In: Preobrazhenskaya T.P editor, Poisk produtsentov antibiotikov sredi aktinomitsetov redkikh rodov. Gylym (Alma-Ata). 1990. (in Russians)]
3. Otoguro M, Hayakawa M, Yamazaki T., limura Y. An integrated method for the enrichment and selective isolation of Actinocineospora spp. In soil and plant litter J Appl Microbiol. 2001; 91 (1): 118-130. doi: 10.1046/j.1365-2672.2001.01372.x.
4. Benhadj M, Gacemi-Kirane D, Manasria T., Guebla K., Ahmane Z. Screening of rare actinomycetes isolated from natural wetland ecosystem (Fet-zara Lake, northeastern Algeria) for hydrolytic enzymes and antimicrobial activities. Journal of King Saud University — Science. 2018; 31 (4). doi:10.1016/j.jksus.2018.03.008.
5. Jiang Y., Li Q., Chen X., Jiang C. Isolation and cultivation methods of Ac-tinobacteria. In D. Dhanasekaran (ed.). Actinobacteria — basics and biotechnological applications. Rijeka: InTech; 2016; 39-57. doi 10.5772/61457.
6. Singh V., Haque S, Singh H, VermaJ., VibhaK., Singh R., Jawed A, Tripathi C.K.M. Isolation, screening, and identification of novel isolates of acti-nomycetes from India for antimicrobial applications. Front Microbiol. 2016; 7: 1921. doi: 10.3389/fmicb.2016.01921.
7. Мачавариани Н.Г, ТереховаЛ.П. Новый метод выделения актиномицетов из почвы. В: Сборник научных докладов. Актуальные вопросы в современной науке. 2013. Варшава. Июнь 28-30. С. 9-12. [Macha-variani N.G., Terekhova L.P. Novyi metod vydeleniya aktinomitsetov iz pochvy. In: Sbornik nauchnykh dokladov. Aktual'nye voprosy v sovre-mennoi nauke. 2013. June 28-30. Varshava. S. 9-12. (in Russians).]
8. Куликова Н.Г. Разработка селективных методов выделения акти-нобактерий — потенциальных продуцентов антибиотиков из разных экологических систем: автореф... Дис. ... канд. биол. наук. М.: 2017. Доступно по: https://www.gause-inst.ru/sites/default/files/2019-01/Autoref_Kulikova.pdf Ссылка активна на26.07.2021 [Kulikova N.G. Razrabotka selektivnykh metodov vydeleniya aktinobakterii — potent-sial'nykh produtsentov antibiotikov iz raznykh ehkologicheskikh sistem: avtoref ... Diss. kand. biol. nauk. — Moscow: 2017. Dostupno po: https://www.gause-inst.ru/sites/default/files/2019-01/Autoref_Kuli-kova.pdf Ssylka aktivna na 26.07.2021. (in Russians)]
9. Waithaka P.N., Mwaura F.B., Wagacha J.M., Gathuru E.M. Methods of isolation actinomycetes from the soils of Menengai crater in Kenia. Greener Journal of Microbiology and Antimicrobials. 2017; 8 (3): 008-017. doi: 10.15580/GJMA.2017.2.041817051.
10. SubramaniR., SipkemaD. Marine rare actinomycetes: a promising source of structurally diverse and unique novel natural products. Mar Drugs. 2019. 17 (5): 249. doi: 10.3390/md17050249.
11. Qiu D, Ruan J., Huang Y. Selective isolation and rapid identification of members of the genus Micromonospora. App Environ Microbiol. 2008; 74 (17): 5593-5597. doi: 10.1128/AEM.00303-08.
12. Stanley M.C., Ifeanyi O.E, Eziokwu O.G. Antimicrobial effects of Aloe vera on some human pathogens. Int J Curr Microbiol App Sci. 2014; 3 (3): 1022-1028.
13. OlennikovD.N., Ibragimov T.A., Chelombit'ko V. A., NazarovaA. V., Rokhin A. V., Zilfikarov I. N. Chemical composition of Aloe arborescens and its
Информация об авторе
Синёва Ольга Николаевна — к. б. н., научный сотрудник отдела микробиологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе» Москва, Российская Федерация. ORCID: 0000-0002-0063-4922. eLIBRARY SPIN-код: 4862-2509.
ведённым исследованиям, выделенные актино-мицеты редких родов проявляют антибиотическую активность в отношении тест-организмов, т. е. могут быть потенциальными продуцентами новых антибиотиков.
change by biostimulation. Chemistry of Natural Compounds. 2009; 45. (4): 478-482. doi 10.1007/s10600-009-9405-z.
14. Nidiry E. S. J., Ganeshan G., Lokesha A.N. Antifungal activity of some extractives and constituents of Aloe vera. Res J Med Plants. 2011; 5 (2): 196-200. doi: 10.3923/rjmp.2011.196.200.
15. Meier N., Meier B., Peter S., Wolfram E. In-Silico UHPLC method optimization for aglycones in the herbal laxatives Aloe barbadensis Mill., Cassia angustofolia Vahl Pods, Rhamnus frangula L.Bark, Rhamnus pur-shianus DC. Bark, and Rheum palmatum L. Roots. Molecules. 2017; 22 (11), 1838. doi: 10.3390/molecules22111838.
16. Olennikov D.N., Zilfikarov I.N., Penzina T.A. Use of microcolumn HPLC for analysis of aloenin in Aloe arborescens raw material and related drags. Pharmaceu Chem J. 47 (9): 494-497. doi: 10.1007/s11094-013-0988-0.
17. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.Л., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномицетов. М.: Наука; 1983. [Gauze G.F., Preobrazhenskaya T.P., Sveshnikova M.L., Terekhova L.P., Maksimova T.S. Opredelitel' aktinomitsetov. Moscow: Nauka; 1983. (in Russian)]
18. McCarty A.J., Williams S.T. Methods for studying the ecology of actino-mycetes. Methods in Microbiology. 1990; 29: 583-563.
19. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. М.: Издательство РАМН; 2000. [PlatonovA.E. Statisticheskii analiz v meditsine i bio-logii: zadachi, terminologiya, logika, komp'yuternye metody. Moscow: Izdatel'stvo RAMN; 2000. (in Russians)]
20. LechevalierH.A., LechivalierM.P., GerberN.N. Chemical composition as a criterion in the classification of actinomyces. Adv Appl Microbiol.1971; 14: 47-72.
21. Беркли Р., Бок Э., Бун Д., Бреннер Д., Васильева Л.В., Видель Ф. и др. Определитель бактерий Берджи. 9 издание. Т. 2. Пер. с англ. Хоулт Дж., Криг Н., Снит П., Стейли Дж., Уильямс С. ред. Мир, М.; 1997. [Berkley R.C.W., Bock E., Boone D. R., Brenner D.J., Vasil'eva L.V., Widdel F. et al. Bergey's manual of determinative bacteriology. 9th ed. V 2. Holt J. G., Krieg N.R., Sneath PH.A., Staley J.T., Williams S.T., editors. Mir, Moscow; 1997.
22. Yamaguchi T. Comparison of the cell-wall composition of morphologically distinct actinomycetes. J Bacteriol. 1965; 89: 444-453.
23. МанучароваН.А Молекулярно-биологические методы в почвоведении и экологии: учебное пособие. М.: Университетская книга; 2014. [ManucharovaN.A. Molekulyarno-biologicheskiye metody v poch-vovedenii i ekologii: uchebnoye posobiye. Moscow: Universitetskaya kniga; 2014. (in Russian)]
24. Соколов С.Я. Фитотерапия и фитофармакология: руководство для врачей. М.: Медицинское информационное агентство. 2000. [Sokolov S.Ya. Fitoterapiya i fitofarmakologiya: rukovodstvo dlya vrachei. Moscow: Meditsinskoe informatsionnoe agentstvo. 2000. (in Russians)]
25. Добровольская Т.Г., Звягинцев Д.Г., ЧерновИ.Ю., ГоловченкоА.В., Зенова Г.М., Лысак Л.В., Манучарова НА.., Марфенина О.Е., Полянская Л.М., Степанов А.Л., Умаров М.М. Роль микроорганизмов в экологических функциях почв. Почвоведение. 2015; 9: 1087-1096. doi: 10.1134/S1064229315090033. [Dobrovol'skaya T. G., ZvyagintsevD. G., Chernov I. Yu., Golovchenko A. V., Zenova G. M., Lysak L. V., Manucharova N. A., Marfenina O. E., Polyanskaya L. M., Stepanov A. L., Umarov M. M. The role of microorganisms in the ecological functions of soils. Eurasian soil science. 2015; 9: 959-967. doi: 10.1134/S1064229315090033. (in Russians).]
26. Berdy J. Bioactive Microbial Metabolites. J Antibiot. 2005; 58 (1): 1-26. doi 10.1038/ja.2005.1.
27. Ding T., YangL-J., Zhang W-D., Shen Y-H. The secondary metabolites of rare actinomycetes: chemistry and bioactivity. RSC Advances. 2019 (9): 21694-21988. doi: 10.1039/C9RA03579F.
About the author
Olga N. Sineva — Ph. D. in biology, Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, Russian Federation. ORCID: 00000002-0063-4922. eLIBRARY SPIN-Kog: 4862-2509.
