CC BY
82
УДК 504.54.001.5; 504.064
ВЫБОР ОПТИМАЛЬНОЙ МАТЕМАТИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ ДЛЯ ОПИСАНИЯ ДОЗО-ЗАВИСИМОГО ЭФФЕКТА ПРИ АНАЛИЗЕ ТОКСИЧНОСТИ ПОЧВ КОНТАКТНЫМ МЕТОДОМ БИОТЕСТИРОВАНИЯ
© П. Ю. Галицкая*, С. Ю. Селивановская, А. А. Савельев
Казанский (Приволжский) федеральный университет Россия, Республика Татарстан, 420008 г. Казань, ул. Кремлевская, 18.
Тел.: + 7 (843) 233 77 80.
E-mail: gpolina33@yandex.ru
Представлены результаты определения токсичности почвы, загрязненной кадмием и хромом, полученные с использованием контактного метода биотестирования на основе Bacillus pumilus КМ-21. Для выбора модели описания результатов экотоксикологических исследований с наибольшими прогнозными качествами с точки зрения определения ЕС50. предложен алгоритм, включающий балльное ранжирование результатов сравнения экспериментально полученных и прогнозных значений тест-функций в области близкой к 50%-ному ингибированию. Выявлено, что с точки зрения точности определения EC50, оптимальной из рассмотренных является кинетическая модель неполного ингибирования.
Ключевые слова: контактное биотестирование, почвы, металлы, математическое моделирование, Bacillus pumilus.
Растущая антропогенная нагрузка на экосистемы диктует необходимость разработки системы мер по ее минимизации. Для эффективного природоохранного управления необходима информация о степени опасности загрязняющих веществ для окружающей среды, прежде всего, их токсичности [1, 2]. Наиболее сложными для анализа являются плотные многокомпонентные объекты, такие как почва, бытовые и промышленные отходы [3, 4]. Одним из перспективных направлений в оценке плотных многокомпонентных объектов являются биологические методы, в частности, микробные тесты [5, 6]. Наиболее разработаны методы, основанные на оценке аборигенной микрофлоры [7, 8]. Однако при интерпретации результатов зачастую возникают проблемы, связанные с отсутствием незагрязненного образца, идентичного анализируемому. Альтернативой указанным методам являются методы биотестирования, основанные на оценке ответной реакции интродуци-рованной микрофлоры [9]. В настоящее время разработано большое количество таких тестов, включая ряд коммерческих [2, 3, 9, 11].
В качестве характеристики токсичности используют показатель ЕС50 - значение концентрации анализируемого вещества, вызывающей 50%-ное изменение тест-функции. Традиционно данный параметр рекомендуют вычислять с использованием линейной регрессии, построенной по линейному участку зависимости концентрация-ингибирование тест-функции [8, 12-16]. Однако выделение линейной части на кривой зависимости ингибирование-концентрация чаще всего субъективно. Преодолеть недостатки этого метода можно при использовании для расчета ЕС50 нелинейных моделей. В литературе представлены некоторые модели [5, 17, 18], однако сравнения их прогностических качеств для решения конкретных задач проведено не было.
Цель данной работы - выбор модели для описания экспериментальных данных, полученных
методом микробного биотестирования и расчет на основании данной модели показателя EC5I> Материалы и методы Тест-объектом служила культура бактерий Bacillus pumilus КМ-21. Биотестировании проводили при достижении оптической плотности культуры 0.8-0.9 опт. ед, которую определяли на ФЕК-4А (А = 600 нм, кювета 10 мм).
Анализу на токсичность подвергали ряд почвенных образцов, искусственно загрязненных солями индивидуальных металлов. Содержание токсикантов (в расчете на элемент) в почвенных образцах составило: Cd(NO3)2 • 4Н2О - 0.25, 1. 3, 5.8, 11.6, 23.2, 58.0, 232.0 мг/кг; K2Cr2O7 - 0.31, 3.12, 4.68, 6.24, 7.80, 11.70, 15.60, 992.70, 3971.00 мг/кг. Для уточняющих экспериментов было дополнительно создано 6 почвенных образцов, три из которых содержали Cd(NO3)2 • 4Н2О в количестве 5.8, 7.6 и 11.7 мг/кг, а три - K2Cr2O7 в количестве 7.7, 10.3 и 11.7 мг/кг (в расчете на элемент).
Токсиканты вносили в почвенные образцы в виде водных растворов, затем образцы инкубировали в течение 7 суток при комнатной температуре. Перед биотестированием образцы высушивали при 120 °С в течение 2 часов.
Контактное биотестирование. Дегидрогеназную активность культуры определяли модифицированным методом, предложенным Ronnpagel и соавторами [9], по скорости восстановления резазурина. К навеске образца 3г, помещенной в пробирки с завинчивающимися пробками, приливали 1 мл бактериальной суспензии, 3 мл дистиллированной воды и помещали на ротатор. Через 2 часа инкубирования добавляли 4 мл резазу-рина (20 мг/л), растворенного в калиево-фосфатном буфере. Пробирки вновь помещали на ротатор на 50 мин., а затем пробы центрифугировали в течение 10 мин. при 3.5 тыс. об/мин. Невосстановленный резазурин определяли в надосадочной жидкости спектрофотометрически при А =600нм.
* автор, ответственный за переписку
x100
Для того, чтобы избежать влияния окрашенных компонентов ростовой среды или почв, предусматривали так называемую «слепую пробу», где 1 мл бактериальной суспензии был заменен на 1 мл дистиллированной воды. Для контроля активности культуры в каждой серии опытов предусматривали вариант, в котором почвенную навеску заменяли на дистиллированную воду (контроль активности культуры - Ка).
Для оценки эффекта воздействия рассчитывали относительную активность культуры (Аотн):
(р€Л _ Р )
Аотн, % = ( проба проба
(РКа _ РКа) '
где р - экстинкция пробы при оценке активно-
Ка
сти культуры; Рсл - экстинкция слепой пробы при
Ка
оценке активности культуры; р - экстинкция
проба
пробы образца; рсл - экстинкция слепой пробы
проба
образца.
Все измерения проводили в 21 кратной повторности.
Для вычисления концентраций, вызывающих 50%-ное ингибирование тест-функции (ЕС50) использовали линейную и нелинейные модели. В качестве нелинейных моделей для описания полученных результатов применяли две кинетических модели (модель 1 и модель 2) [18], сигмоидальную модель (модель 3) [17] и логистическую модель (модель 4) [5]:
(модель 1) ^ =_____£___ где у - тестируемый
1 + Ь ■ х
параметр, х - концентрация ингибитора, Ь, С -параметры модели;
(модель 2) у = С ■ (1 + а ■ х) , где у - тестируе-1 + Ь ■ х
мый параметр, х - концентрация ингибитора, а,Ь, С - параметры модели;
а
(модель 3) y =
., где y -
1 + exp (b ■ (ln x - c)) тестируемый параметр, x - концентрация ингибитора, a, b, c - параметры модели;
(модель 4) _ k , где y - тестируемый
1+fx v a,
параметр, x - концентрация ингибитора, k, a, b -параметры модели.
Для оценки распределения значений EC50 (в том числе доверительного интервала ЕС50) применялся метод рандомизации, использующий случайные перестановки регрессионных остатков [19]. Пусть xi - содержание токсиканта в i-м эксперименте, и yij - значение активности для j-ой повторности в
нем. В качестве оценки истинного значения относительной активности для i-ой концентрации брали средние значения у. . В предположении, что все
отклонения от среднего Г- = у■■ — у- независимы и
ij ^ j ^-.
одинаково распределены, их перестановки использовали для построения новых значений активностей у*. = у. + fp(. , гдеp(i,j) означает перестановку. В
качестве выборочной статистики использовали оценку ЕС50: методом наименьших квадратов с весами (численная минимизация) оценивали коэффициенты модели, после чего по модели вычисляли ЕС50. В соответствии с теорией [19], при выполнении предположений и большом числе повторностей (нами использовалось 999) статистическое распределение полученных значений ЕС50 является аппроксимацией истинного распределения ЕС50.
Для вычислений использовали программный пакет R [20].
Результаты и их обсуждение
Выбор бактерий рода Bacillus был обусловлен тем, что, во-первых, бациллы являются характерными обитателями почв, во-вторых, они играют существенную роль в круговороте биогенных элементов, в-третьих, у данных бактерий отмечен высокий уровень дегидрогеназной активности [5, 9]. Согласно данным литературы, дегидрогеназная активность микробов коррелирует с их метаболической активностью [8].
Выбор наиболее адекватной модели для описания экспериментальных результатов и определения ЕС50 проводили на примере почв, загрязненных хромом и кадмием. Оценку токсичности почв проводили с использованием контактного метода биотестирования. Согласно данным литературы, такие методы являются более релевантными по сравнению с традиционными элюатными для оценки плотных многокомпонентных объектов, в частности почв [5, 8, 21].
На первом этапе с применением контактного метода был определен эффект, оказываемый модельными почвенными образцами, загрязненными хромом и кадмием, на дегидрогеназную активность Bacillus pumilus КМ-21 (рис. 1).
Для определения степени их токсичности необходимо было рассчитать ЕС50. Поскольку непосредственно в эксперименте эти значения не были установлены, необходимо было построить модель зависимости доза-эффект и вычислить эти значения. Моделирование результатов производилось с использованием четырех нелинейных и одной линейной модели. Линейная регрессия является традиционной для расчета ЕС50, использованные нами нелинейные модели описаны рядом зарубежных авторов для оценки результатов экотоксикологи-ческих исследований [5, 17, 18].
300-
250-
200-
150-
100-
50-
150 -
о
С
50-
10
15
Ч/~і—■ 1000
С, мг/кг
10
20 30 40
С, мг/кг
50
200 250
а
б
0
0
0
5
0
Рис. 1. Относительные значения дегидрогеназной активности Bacillus pumilus КМ-21 при биотестировании почв, загрязненных хромом (а) и кадмием (б).
Для того, чтобы сравнить модели с точки зрения решаемой задачи необходимо было получить распределение концентраций для каждого значения активности, близкого к 50 (для каждой из моделей), а затем вычислить функции правдоподобия для дополнительной (контрольной) выборки для концентраций, близких к EC50 с использованием этих распределений.
При построении моделей для увеличения точности последующей оценки EC50, каждому значению Аотн был присвоен вес, зависящий от его близости к значению 50%. Вес значения, соответствующего концентрации х, был выбран равным
wx = exp (—(ln х — ln c)2/(2 • 32)), где с - грубая °цен-
ка EC50 (6 для Cd, и 10 для Cr), и 32 - оценка дисперсии логарифма концентрации. Чтобы оценить распределение значений EC50 и доверительного интервала, был использован описанный выше метод перестановки регрессионных остатков
(bootstrapping) при решении прямой задачи. Применение этого метода позволяет на небольшом количестве исходных данных независимо генерировать большое количество кривых концентрация-ответ тест-функции и, следовательно, получить доверительный интервал с большей точностью [19].
Гистограммы, отражающие распределение значений ЕС50 и соответствующие доверительные интервалы, полученные с использованием четырех нелинейных моделей, представлены на рис. 2. При построении гистрграмм на оси абсцисс откладывали концентрации токсикантов, а по оси ординат -плотность вероятности, которая представляет собой отношение приращения функции распределения F(x) к приращению аргумента х, т.е. для бесконечно малого малого приращения dx плотность вероятности есть (F(x+dx)-F(x))/dx. Значение F(x) на концах интервалов оценивалось как доля выборочных значений, меньших x, а в качестве dx бралась ширина интервала. Таким образом, площадь каждо-
го столбца гистограммы является оценкой вероятности попадания в соответствующий интервал, а сумма всех площадей равна единице (отметим, что высота столбцов при этом заранее не ограничена, и зависит от диапазона значений). Как видно из полученных результатов, использование разных моделей приводило к получению различных значений ЕС50, а также соответствующих доверительных интервалов. Чтобы определить, какая из моделей дает лучший прогноз значений ЕС50, были проведены уточняющие эксперименты. Для этого были созданы дополнительные модельные почвенные образцы (контрольная выборка), с содержанием металлов, при которых относительная дегидрогеназная активность была близка к 50%. Так, для хрома эти концентрации в расчете на элемент составили 7.8, 10.2 и 11.7 мг кг-1 , а для кадмия - 5.8, 7.7 и 11.6 мг кг-1. Полученные образцы были подвергнуты биотестированию и определены значения Аотн. Параллельно с использованием четырех нелинейных моделей и модели линейной регрессии были получены прогнозные значения относительной активности для случаев, когда аргумент принимал значения, равные указанным концентрациям токсикантов. Результаты представлены в табл. 1. Полученные данные показали, что средние значения Аотн, установленные в уточняющих экспериментах, отличались от прогнозных значений всех моделей. Чтобы сравнить качество моделей были найдены модули разности между прогнозными и реальными значениями и в соответствии со значениями модулей дана балльная оценка моделей от 1 до 5 (1 балл присваивался модели модели с наименьшим значением модуля разности).
Из данных табл. 2 видно, что наименьшей прогнозной способностью в отношении ЕС50 обладает уравнение линейной регрессии (средний балл 4.67).
Моделью наиболее близко прогнозирующей реальные результаты является модель 2 (средний балл 1.5).
10.0
Концентрация
Модель 1
10.0 10.2 Концентрация
Модель 2
9.6
9.8
10.4
10.6
10.8
9.5
10.5
10.0
Концентрация
200 300
Концентрация
Модель 3 Модель 4
Рис. 2. Доверительные интервалы ЕС50, полученные с помощью 4 нелинейных моделей, на примере почвенных образцов,
загрязненных хромом.
Таблица 1
Результаты прогнозирования относительной дегидрогеназной активности и реальные значения, полученные в уточняющих экспериментах
Тестируемый образец С, мг/л или мг/кг -^отн %
Реальные зна- Модель Модель Модель Модель Линейная мо-
7.7 57.6 61.7 5S.6 64.7 S4.6 42.3
Почва, загрязненная 10.3 53.1 4S.7 50.7 46.2 61.S 60.6
хромом 11.7 40 45.9 44.4 37.S 50.4 69.6
5.S 52 5S 57.6 62.4 5S S6.S
Почва, загрязненная 7.6 49 50.5 52.4 57.6 52.3 101
кадмием 11.7 44 41.3 44.1 49 43.2 129.4
Таким образом, для расчета ЕС50 при контактном биотестировании на основе Bacillus pumilus КМ-21 целесообразно использовать кинетическую модель неполного ингибирования. Предложенный алгоритм, включающий балльное ранжирование результатов сравнения эксперимен-
тально полученных и прогнозных значений тест-функций в области близкой к 50%-ному ингибированию, может быть рекомендован для выбора модели описания результатов экотоксикологических исследований с наибольшими прогнозными качествами с точки зрения определения ЕС50.
9.5
10.5
11.0
0
100
Таблица 2
Балльная оценка адекватности математических моделей описания результатов биотестирования почв
Тестируемый образец С, мг/л или мг/кг Модель 1 Модель 2 Модель 3 Модель 4 Линейная
Почва, загрязненная 7.7 2 1 3 5 4
10.3 2 1 3 5 4
хромом 11.7 3 2 1 4 5
Почва, загрязненная кадмием 5.8 2.5 1 4 2.5 5
7.6 1 3 4 2 5
11.7 3 1 4 2 5
Среднее значение 2.25 1.50 3.17 3.42 4.67
Работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.
ЛИТЕРАТУРА
1. Filip Z. International approach to assessing soil quality by ecologically-related biological parameters // Agriculture, Ecosystems and Environment, 2002. №88. P. 169-174.
2. Classens S., Rensburg L. V., Riedel K. J., Bezuidenhout J. J., van Rensburg P. J. J. Evaluation of the effucuency of various commercial products for the bioremediation of hydrocarbon contaminated soil // The Environmentalist. 2006. No. 26. P. 51-62.
3. Kapanen A., Itavaara M. Ecotoxicity Tests Compost Applications // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2001. №49. P. 1-16.
4. Malkomes H. P. Mikrobiologisch-oekotoxicologische Bodenuntersuchungen von zwei Unkrautbekaempfung mit hohen Dosierungen eingesetzten Fettsaeure-Herbiziden // Umweltchemie und Oekotoxicology. 2006. №18 (1). P. 13-20.
5. Abbondanzi F., Cachada A., Campisi T., Guerra R., Reccagni M. Optimization of a microbial bioassay for contaminated soil monitoring: bacterial inoculum standartisation and comparison with Microtox® assay // Chemosphere. 2003. №53. P. 889-897.
6. Van Beelen P. A review on the application of microbial toxicity tests for deriving sediment quality guidelines // Chemos-phere. 2003. No 53. P. 795-808.
7. Хазиев Ф. Х. Методы почвенной энзимологии. М.: Наука, 2005. 248 с.
8. Moreno J. L., Sanchez-Marín A., Hernández T., Garsia C. Effect of cadmium on microbial activity and a ryegrass crop in two semiarid soils // Environmental management. 2006. Vol 37. №5. P. 626-633.
9. Ronnpagel K., Liss W., Ahlf W. Microbial bioassays to assess the toxicity of soild-associated contaminants// Ecotoxico;ogy and Environmental Safety. 1995. V.31. P.99-103.
10. Сазонова В. Е., Замуняк Л. А., Савельева Л. М., Морозова Е. В., Костюк О.Б. Использование биотестов при разработке мониторинга водной экосистемы // Экология. 1997. №3. C. 207-212.
11. Селивановская С. Ю., Латыпова В. З. Создание тест-системы для оценки токсичности многокомпонентных образований // Экология. 2004. №1. C. 21-25.
12. ISO/DIS 10712. Water Quality - Pseudomonas putida growth inhibition test (Pseudomonas Cell Multiplication Inhibition Test)/ International Standard. 1995. 14 p.
13. ПНД Ф Т 14.1;2;3;4.3-99. Токсикологические методы контроля. Методика определения токсичности воды по смертности и изменению плодовитости дафний. Москва, 1999. 31 с.
14. Prokop Z., Holoubek I. The Use of a Microbial contact toxicity test for evaluating cadmiun bioavailability in soil // J. Soils and Sediments. 2001. №1. P. 21-24.
15. ФР.1.39.2003.00923 Методика определения токсичности отходов, почв, осадков сточных вод, сточных, и очищенных сточных, поверхностных, грунтовых и питьевых вод методом биотестирования с использованием равноресничных инфузорий Paramecium caudatum. Казань, 2003. 20 с.
16. Ivask A., Fracois M., Kahru A., Dobourguier H.-C., Virta M., Douay F. Recombinant luminescent bacterial sensors fotr the measurement of bioavailability of cadmium and lead in soils polluted by metal smelters // Chemosphere. 2004. №55. P. 147-156.
17. Haanstra L., Doelman P., Oude Voshaar V. H. The use of sigmoidal dose response curves in soil ecotoxicological research // Plant Soil. 1985. №84. P. 293-297.
18. Speir T. W., Kettles H. A., Parshotam A., Searle P. L., Vlaar L. N. C. A simple kinetic approach to derive the ecological dose value, ED50, for the assessment of Cr(Vl) toxicity to soil biological properties // Soil Biol. Biochem. 1995. №27. P. 801-810.
19. Efron B., Tibshirani R. An lntroduction to the Bootstrap. New York: Chapman&Hall, 1993. P. 332.
20. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. lSBN 3-900051-07-0, URL: http://www.R-project.org
21. Кабиров Р. Р., Сагитова А. Р., Cуханова Н. В. Разработка и использование многокомпонентной тест-системы для оценки токсичности почвенного покрова городской территории // Экология. 1997. №6. C. 408-411.
Поступила в редакцию 13.04.2011 г. После доработки - 27.02.2012 г.
