Введение в культуру in vitro растений трансгенного табака с геном интерлейкина-18 человека Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Р.А. Карначук, Е.С. Гвоздева, С.А. Парфенова

ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ IN VITRO РАСТЕНИЙ ТРАНСГЕННОГО ТАБАКА С ГЕНОМ ИНТЕРЛЕЙКИНА-18 ЧЕЛОВЕКА

Работа поддержана ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», государственный контракт № 02.512.11.2035.

Получена каллусная культура in vitro растений табака с геном интерлейкина-18 человека. В качестве эксплантов использованы стерильные проростки растений родительской линии SR1 и двух трансгенных Il18№7-1 и Il18№7-11. Основой среды явилась МС с добавлением 2,4-Д, ИУК и кинетина. Показаны отличия в скорости роста и размеров каллусных клеток трансгенных линий и родительской SR1.

Важным направлением в генной инженерии является использование трансгенных растений в качестве продуцентов «съедобных» вакцин для возможной иммунизации как человека, так и животных. Уже существует ряд вакцин гепатита В [1], малярии [2] и других, получаемых на основе трансгенных растений. Значительным достижением было создание HBsAg вакцины в трансгенном каллусе люпина и трансгенном салате [3]. Поверхностный антиген HBsAg продуцировался в трансгенной культуре люпина от 11 до 150 нг/г сырой массы каллуса. В исследовании российских ученых эффективность экспрессии HBsAg в трансгенном табаке составила 0,0003-0,001% от общего количества белка [4].

Для масштабного получения растительной ткани используют клеточные культуры, выращиваемые в виде суспензий. Необходимым этапом является введение в каллусную культуру для оптимизации питательных сред и условий культивирования.

Задачей наших исследований было получение in vitro клеточной культуры трансгенного табака с геном интерлейкина-18 человека.

Генетически модифицированные растения табака (Nicotiana tabacum L., линия SR1) созданы в Институте цитологии и генетики СОР АН [5]. Трансгенные линии Il18№7-1 и Il18№7-11 получены методом агробактери-ального переноса (трансформации) с применением различных типов генетических конструкций, включающих ген интерлейкина-18 человека, а также маркерный ген nptlI (неомицин-трансферазы II) и репортерный ген uidA.

Из семян трансгенных (Il18№7-1 и Il18№7-11) и родительской линий табака SR1 выращены стерильные

растения, листья которых взяты в качестве эксплантов. Подбирались питательные среды с различным соотношением гормонов для стимуляции каллусогенеза. Основой среды послужил состав компонентов по МС [6], к которому добавляли разные соотношения ауксинов (2,4-Д и ИУК) и цитокинина (кинетин). Культивирование осуществляли при постоянных условиях в темноте при температуре 25-27°С и влажности 70%. Длительность одного субкультивирования составляла 3540 сут. Оценку роста каллусной культуры проводили по приросту воздушно-сухой биомассы.

Первичный каллус образовывался на 35-40-е сут. Интенсивность каллусогенеза зависела от гормонального состава среды. Отмечено, что на трансгенных эксплантах образование каллуса происходило с меньшей частотой.

Выявлены значительные морфометрические отличия между исходной и трансгенными линиями. Так, по сравнению с исходной линией SR1, которая была представлена клетками правильной округлой или овальной формы, трансгенная линия Il18№7-1 преимущественно состояла из сильно вытянутых в длину клеток, объем которых был больше растительных в 1,5-2 раза (рис. 1, 2). Клетки трансгенной линии Il18№7-11 имели округлую форму, объем которых в 610 раз меньше, чем у исходной линии SR1 (рис. 3).

Прирост сухой биомассы каллуса всех линий табака выражался типичной S-образной кривой. Следует отметить, что каллус родительской линии SR1 достигал максимального веса на 20-е сут, после чего рост замедлялся (рис. 4), тогда как для трансгенной линии Il18№7-1 это происходило на 10-е сут (рис. 5), а для Il18№7-11 - на 20-25-е сут (рис. 6).

□ ср □ кр ■ удл ■ дл

3000 -2500 -

I 2000 -

° 1500 -

S 1000 -

(ù

ю

° 500 -

0

- Е| X т - Б №

-1- И г ! Г .IL С. _1

5 10 15 20 25 30

Время культивирования, сут

Рис. 1. Морфометрия клеток каллусной культуры табака линии БЯ1, вымащиваемой в темноте на среде МБ с додавленитм 2,4-Д [1 мг/л]

(в

ю

О

5000

4500

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

0

□ ср Щ кр □ удл

I дл

10 15 20 25

Время культивирования, сут

30

Рис. 2. Морфометрия клеток каллусной культуры! табака линии 1Ь-18 №7-1, выращиваемой в темноте на среде МБ с добавлением 2,4-Д [1 мг/л]

1400

1200

1000

800

600

400

200

0

3,5

2,5

0,5

10 15 20 25

Время культивирования, сут

Рис. 3. Морфометрия клеток каллусной культуры табака линии 1Ь-18 №7-11, вымащиваемой в темноте на среде МБ с добавлением 2,4-Д [1 мг/л]

Время культивирования, сут Рис. 4.Прирост биомассы каллусной культуры табака линии БЮ, вытращиваемой в темноте на среде с 2,4-Д [1 мг/л], в течение 2-го пассажа

5

3

2

3 п

£

х

о

2.5

2 Н

1.5 1

0.5

0

i

Í

Í

Í

10 15 20 Время культивирования, сут

Í

25

30

Рис. 5. Прирост биомассы каллусной культуры табака линии 1Ь-18 № 7-1, выращиваемой в темноте на среде с 2,4-Д [1мг/л], в течение 2-го пассажа

5

4.5 4

3.5 -3

2.5 -2 -

1.5 1

0,5

0

1

10 15 20

Время культивирования, сут

25

30

Рис. 6. Прирост биомассы каллусной культуры табака линии IL-18 № 711, выращиваемой в темноте на среде с 2,4-Д [1мг/л], в течение 2-го пассажа

5

Таким образом, получена каллусная ткань двух линии SR1. Также показано, что максимальный при-

линий трансгенных клеток от эксплантов табака с рост каллусной ткани линии Il18№7-1 происходил

геном интерлейкина-18 человека, клетки которых значительно раньше, чем у исходной нетрансгенной

отличались по форме и размерам от родительской линии SR1.

ЛИТЕРАТУРА

1. Mason H.S., Jam D.M., Arntren C.J. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. Vol. 89.

P. 11745-11749.

2. Turpen T.N., Reinl S.J., Charoenvit V., Hoffman S.J., Fallarme V., Grill L.K. Malarial epitopes expressed on the surface of recombinant tobacco mo-

saic virus // Biotechnology. 1995. Vol. 13. P. 53-57.

3. Kapusta J., Modelska A., Figlerowich M. et al. A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus // FASEB. 1999. Vol. 13. P. 1796-1799.

4. Золова О.Э., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И. и др. Создание трансгенных растений табака, экспрессирующих ген поверхностного антигена

вируса гепатита В // Биотехнология. 1999. № 6. С. 29-34.

5. Дейнеко Е.В., Сидорчук Ю.В., Загорская А.А. и др. Аномалии строения цветков и мужская стерильность у трансгенных растений табака //

Докл. РАН. 1999. Т. 368. С. 135-138.

6. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15, № 13. P. 473-

497.

Статья поступила в редакцию журнала 4 декабря 2006 г., принята к печати 11 декабря 2006 г.