CC BY
26
Вестник ДВО РАН. 2019. № 5
УДК 547.94; 579.96 DOI: 10.25808/08697698.2019.207.5.009
Е В. ЛЕЩЕНКО, Е В. ИВАНЕЦ, М П. СОБОЛЕВСКАЯ
Вторичные метаболиты грибов-микромицетов морских растений
Из четырех изолятов факультативных морских грибов рода Penicillum (P. thomii KMM 4667, P. thomii Maire KMM 4675, P. thomii KMM 4674 и P. sp. KMM 4672), ассоциированных с морскими растениями, выделено 30 новых вторичных метаболитов различной химической природы. Структуры соединений установлены на основе данных ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения. Абсолютные конфигурации ряда соединений определены с помощью вычислений спектров электронного кругового дихроизма (ECD) в рамках нестационарной теории функционала плотности (TD-DFT) и сравнения КД-спектров с литературными данными, а также с помощью метода Мошера. Исследована цитотоксическая и противовоспалительная активность ряда выделенных соединений.
Ключевые слова: морские грибы, вторичные метаболиты, поликетиды, сесквитерпены, цитотоксическая активность, противовоспалительная активность.
Secondary metabolites of micromycetes fungi of marine plants. E.V. LESHCHENKO (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok, Fareastern Federal University, Vladivostok), E.V. IVANETS, M.P. SOBOLEVSKAYA (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).
Thirty new secondary metabolites of various chemical nature were isolated from marine fungi of the genus Penicillum: P. thomii KMM 4667, P. thomii Maire KMM 4675, P. thomii KMM 4674 andPenicillium sp. KMM 4672, associated with the marine plants. The structures of the compounds were established based on NMR spectroscopy and high resolution mass spectrometry. The absolute configurations of several compounds were determined using the Mosher's method and by time-dependent density functional theory (TD-DFT) calculation of ECD spectra and comparison of these spectra with published data. The cytotoxic and anti-inflammatory activity of a number of isolated compounds was examined.
Key words: marine fungi, secondary metabolites, polyketides, sesquiterpenes, cytotoxic activity, anti-inflammatory activity.
Введение
Интенсивные исследования наземных микроорганизмов, продуцирующих биологически активные соединения, были начаты в середине прошлого века и продолжаются в настоящее время. В то же время число новых метаболитов, продуцируемых ими, снижается, так как около 90 % культур синтезируют уже известные соединения. Поэтому закономерен интерес к изучению метаболитов микроорганизмов из других биологических сообществ, в том числе из морских. Активное изучение грибов-микромицетов из морских источников как продуцентов биологически активных соединений началось в начале 2000-х годов.
Анализ литературных данных показывает, что значительное число новых биологически активных метаболитов морских грибов выделены из грибов, ассоциированных
ЛЕЩЕНКО Елена Владиславовна - младший научный сотрудник (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток), научный сотрудник (Дальневосточный федеральный университет, Владивосток), ИВАНЕЦ Елена Валерьевна - младший научный сотрудник, *СОБОЛЕВСКАЯ Мария Павловна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток). *Е-таП: afiyat@piboc.dvo.ru
с морскими водорослями и травами [13]. Грибы морских водорослей и трав, имеющие биологически активные вторичные метаболиты, играют важную роль в химической защите организма хозяина от растительноядных животных, подводных насекомых и патогенных микроорганизмов [9]. В то же время грибы морских водорослей и трав дальневосточных морей до сих пор остаются малоисследованными.
Заметные антибиотические свойства проявляют многие метаболиты из грибов морских водорослей. Так, хлорированный бензофенон - песталон из гриба Pestalotia sp., выделенного из бурой водоросли Rosenvingea sp., и цереброзиды - флавусиды А и В, выделенные из гриба Aspergillus flavus, ассоциированного с зеленой водорослью Codium fragile, обнаруживают высокую активность в отношении клинических изолятов метициллин- и муль-тилекарственно-резистентных штаммов Staphylococcus aureus [4, 16]. Антифунгальную и антибактериальную активность в отношении культур S. aureus, Escherichia coli, Colletotrichum lagenarium и Fusarium oxysporum проявляют ксантоновые производные - уйказины В и С из гриба A. wentii, выделенного из красной водоросли Gymnogongrus flabelliformis [15].
Мощной антипротозойной активностью обладают необычные нерегулярные терпено-иды из гриба Drechslera dematioidea, выделенного из водоросли Liagora viscida, макро-лид - айгиаломицин D из водорослевого гриба Aigialus parvus BCC 5311, производное те-трамовой кислоты - аскосалипираллидинон А из облигатного гриба Ascochytas alicorniae, ассоциированного с зеленой водорослью Ulva sp. [7, 11, 12].
Ряд метаболитов различных химических классов из грибов морских водорослей и трав рассматриваются в настоящее время в качестве потенциальных противоопухолевых препаратов [3, 5]. Среди них ингибитор формирования тубулиновых микротрубочек дике-топиперазинплинабулин из гриба Aspergillus sp. CNC-139, ассоциированного с морской водорослью [3] (фаза II клинических испытаний), лептозин А и сансалвамид - ингибиторы топоизомеразы II из грибов Leptosphaeria sp. и Fusarium sp., выделенных из морской травы Halodule wrightii [6].
В этой обзорной статье мы обсуждаем сведения о структурах и свойствах некоторых метаболитов из морских изолятов грибов, изученных в лаборатории химии микробных метаболитов ТИБОХ ДВО РАН совместно с кафедрой биоорганической химии и биотехнологии Дальневосточного федерального университета. В работе использовались коллекция морских микроорганизмов и оборудование Дальневосточного центра структурных молекулярных исследований (ЯМР- и масс-спектрометрия) ТИБОХ ДВО РАН.
Результаты и обсуждение
В ранее опубликованных работах мы описали выделение и идентификацию шести новых природных алкалоидов, карнехиназолинов А-С и карнеамидов А-С, двух новых арилгликозидов, карнемицинов А и В, нового дриманового сесквитерпеноида из морского гриба Aspergillus carneus КММ 4638, ассоциированного с бурой водорослью Laminaria sachalinensis (Miyabe) [7], десяти новых меротерпеноидов-аусталидов и семи новых 6,6-спирокеталей - саргассопениллинов A-G из грибов P. thomii KMM 4645 и P. lividum KMM 4663, ассоциированных с бурой водорослью Sargassum miyabei [18, 19].
Продолжая нашу работу по поиску новых биоактивных метаболитов из морских грибов, мы исследовали штамм Penicillium thomii KMM 4667, выделенный с поверхности ризома морской травы Zostera marina (Японское море) [1]. Гриб культивировали в течение 21 суток на специально модифицированной рисовой среде. Мицелий гриба со средой экстрагировали этилацетатом. Сухой экстракт растворяли в системе этанол-вода (1 : 4) и последовательно экстрагировали гексаном и этилацетатом. Этилацетатный экстракт хрома-тографировали последовательно на колонке с силикагелем и методом обращенно-фазной ВЭЖХ. В результате были получены сесквитерпены эудесманового типа - томимарины А-D (1-4) (рис. 1).
14
0\2 3
13
1 2
Рис. 1. Структуры томимаринов A—D (1-4)
HO
Молекулярная формула соединения 1 была определена как C15H24O3 на основании данных масс-спектрометрии высокого разрешения HRESIMS [M+Na]+ (m/z 275.1623) и 13С ЯМР-анализа. Анализ двумерных ЯМР-спектров 1 показал присутствие в структуре молекулы циклогексен-2-еноновой системы, метильных групп при С-4 и С-10 и 1,2-дигидрок-сипропильного остатка при С-7 в качестве боковой цепи. Относительная конфигурация соединения 1 была определена с помощью NOESY эксперимента.
Абсолютная стереохимия 1 установлена при сравнении экспериментальных и теоретически вычисленных КД-спектров. Для получения статистически усредненных спектров были выбраны стабильные конформации 1 в соответствии с их свободными энергиями Гиббса. В результате вычислены и статистически усреднены индивидуальные КД-спектры для десяти конформаций со стереохимией 5S, 7S, 10S, 11S и для двенадцати конформаций с иной стереохимией - 5S, 7S, 10S, 11R. Сравнение теоретических спектров с экспериментальным (рис. 2) показало, что все спектры качественно подобны в области l < 280 nm, где наблюдаются значительные эффекты Коттона. Конфигурация асимметрического центра при C-11 в соединении 1 не была установлена. Таким образом, абсолютные конфигурации других стереоцентров 1 были определены как 5S, 7S, 10S. Соединение получило название томимарин A.
Рис. 2. КД-спектры томимарина A (1): 1 - рассчитанные для 5S, 7S, 10S, 11S; 2 - рассчитанные для 5S, 7S, 10S, 11R; 3 - полученные экспериментально
Молекулярная формула соединения 2 определена на основании пика [M+H]+ (m/z 253.1816) в APPIMS и подтверждена данными 13С ЯМР-спектра. ЯМР-спектры соединения 2 были близки к соответствующим спектрам томимарина А (1), за исключением сигналов H-5 и C-5, C-7 и C-9. COSY и HMBC корреляции устанавливали структуру колец А и В и показали присутствие 1,2-дигидроксипропильного остатка в боковой цепи 2. Абсолютная стереохимия 2 была установлена так же, как и для томимарина А. КД-спектры для семи конформаций со стереохимией 5R, 7S, 10S, 11R и двенадцати конформаций иной альтернативной стереохимии (5R, 7S, 10S, 11S) были вычислены и статистически
усреднены. Таким образом, абсолютная конфигурация стереоцентров 2 установлена как 5R, 7S, 1OS. Соединение названо томимарином B.
Молекулярная формула соединения 3 была установлена как C15H24O3 на основании данных HRESIMS спектра m/z 275.1б21 [M+Na]+ и 13C ЯМР анализа. Сигналы 13C ЯМР-спектра 3 были практически идентичны сигналам для известного соединения a-агарофурана [8], за исключением сигналов C-7 и C-11-C-13. HMBC корреляции свидетельствовали о присутствии двух гидроксиметиленовых групп при C-11. Абсолютная структура соединения 3 была доказана с помощью методов ^Д-спектроскопии. Сравнение статистически усредненных теоретических KД-спектров (девять более стабильных конформеров) стереоизомера 5S, 7S, 1OS с экспериментальным спектром показало, что оба спектра качественно подобны в области 195 < l < 240 нм, где наблюдаются характеристические эффекты ^отгона. Таким образом, абсолютная структура соединения 3 была установлена как 5S, 7S, 1OS. Соединение получило название томимарин C.
Молекулярная формула соединения 4 была установлена как C15H2(SO3 (m/z 277.1780) [M+Na]+ на основании HRESIMS и 13C ЯМР анализа. ^рреляции, наблюдаемые в COSY, HSQC и HMBC спектрах 4, показали наличие циклогексенового кольца (А), положение метильной и гидроксиметильной групп при C-4 и C-10 установили соответственно структуру кольца В и пропан-1,3-диольного остатка при C-7. Сравнение статистически усредненных теоретических KД-спектров стереоизомера 7S, 1OS с экспериментальным KД показало, что оба спектра качественно подобны, и, таким образом, абсолютная структура соединения 4 была установлена как 7S, 1OS, 11S. Соединение получило наименование томимарин D.
Было показано, что соединения 1, 2 и 4 при концентрации 10,0 ßM индуцируют значительное снижение продукции NO в ЛПС-стимулированных макрофагах. Уровень NO в этих клетках был снижен на 24,9 ± 0,9 % (p < 0,01), 43,4 ± 1,5 % (p < 0,01) и 20,9 ± 5,7 % (p < 0,05) соответственно в сравнении с контрольными клетками, стимулированными липополисахаридом. Томимарин В показал максимальное ингибирование NO в ЛПС-стимулированных RAW 2б4.7 клетках.
Из этилацетатного экстракта культуры гриба Penicillium thomii Maire KMM 4б75, ассоциированного с бурой водорослью Sargassum pallidum, были выделены 11 новых метаболитов поликетидного биогенеза - паллидопениллинов S-15 (рис. 3) [14].
HRESIMS соединения S содержит пик m/z 291.1582 [M+Na]+. Молекулярную формулу соединения S установили как C15H24O4 на основании данных масс-спектрометрии высокого разрешения и спектра ЯМР С13. Анализ спектров ЯМР 1H и 13C, DEPT, HsQc, COSY и HMBC показал наличие в данном соединении декалиновой скелетной системы, А11 двойной связи, метильных групп при С-4, C-8 и С-13, гидроксильных групп при C-9 и C-13, а также присутствие 3-гидрокси-1-оксипропильного остатка в качестве боковой цепи.
Молекулярная структура и относительная конфигурация соединения 5 были подтверждены данными рентгеноструктурного анализа монокристалла, полученного при кристаллизации в этаноле. Абсолютная конфигурация была установлена методом Мошера и на основании NOESY взаимодействий. Так, этерификация соединения S с (R)- и (S)-MTPA хлорангидридами привела к образованию (S)- и (R) MTPA эфиров 5а и 5b соответственно. Разница химических сдвигов A5(5S-5R) в протонных спектрах полученных эфиров указывала на 9R конфигурацию, что позволило нам установить конфигурацию асимметрических центров соединения S как 4R, 5S, 8S, 9R, 10R, 13R. Соединение S было названо пал-лидопениллином A.
Для соединения б молекулярная формула C17H2(SO5 установлена на основании значений пиков квазимолекулярных ионов m/z 333.1б78 [M+Na]+, полученных при HRESIMS. Данные 1H и 13C ЯМР-спектров соединения б показали присутствие ацетокси группы при C-1 вместо гидроксильной группы в соединении S. Абсолютная конфигурация соединения б как 4R, 5S, 8S, 9R, 1OR, 13R была установлена на основании ^Д-спектроскопии. Соединение б получило наименование 1-ацетил-паллидопениллин A.
15 9- Н 11 ОН
5 Р=Н
О
6 р=ч£-'"г\2.
О
12 Р=ОН, ^=С!
13 Р=Н, ^=ОН
ОО
7 р= ^^2'
О
= ^ = Н
8 |*=Ч-
9 р=Н,
О
О
14
10
О
11
ОН
15
Рис. 3. Метаболиты гриба РетсШшт АотИ КММ 4675
Молекулярная формула соединения 7 установлена как С19Н2806 на основании HRESIMS и данных 13С ЯМР-спектра. Данные спектров ЯМР 1Н и 13С соединения 7 показали, что в структуре кольца А отсутствует гидроксильная группа в положении С-9 и присутствует ацетоксиметильная группа в положении С-8. NOESY взаимодействия Н-4/Н-10, ОН-13; Н-5/Н3-14; Н-8/Н-10 указывали на йаш-сочленение колец А и В, ^-ориентацию метильной группы в положении С-14 и ацетоксиметильной группы при С-8, а также на а-ориентацию гидроксильной группы при С-13. Абсолютная конфигурация соединения 7 установлена методом КД-спектроскопии как 4R, 5S, 8S, 10R,13R. Соединение 7 получило название пал-лидопениллин В.
Молекулярная формула соединения 8 установлена как С17Н2605 на основании HRESIMS и ЯМР 13С. Данные ЯМР Щ и 13С спектров этого соединения совпадают с данными ЯМР-спектров для паллидопениллина В (7), за исключением сигналов протонов и углеродов при С-8 и С-15. Эти данные и разница в 42 Da между молекулярными массами соединений 7 и 8 указывают на присутствие гидроксиметильной группы при С-8 в соединении 8. Соединение имеет характерные эффекты Коттона при 1 +0,26, 1204 -0,72, X -0,85 в КД-спектре, записанном в гексане. Эти данные хорошо соответствуют данным
для соединений 6 и 7, за исключением полосы поглощения низкой интенсивности, соответствующей положительному эффекту Коттона в области 215 < l < 250 нм. В результате абсолютная конфигурация соединения 8 была установлена как 4R, 5S, 8S, 10R, 13R. Данное соединение названо 15-деацетил-паллидопениллином B.
Молекулярная формула соединения 9 установлена как C17H26O5 на основании данных HRESIMS и ЯМР 13C. Структура соединения и положение 3-гидрокси-1-оксопропильной группы при C-4 определены на основании HMBC и COSY взаимодействий также, как и для соединениия 5. В КД-спектре соединения 9 в гексане наблюдали эффекты Коттона при 1192 +0,46, 1204 -0,15, 1294 -0,25, которые находились в хорошем соответствии с эффектами Коттона, наблюдаемыми для 6, 7 и 8. Эти данные позволили установить абсолютную конфигурацию 9 как 4R, 5S, 8S, 10R, 13R. Соединение получило название 1-деацетилпал-лидопениллин B.
На основании HRESIMS и ЯМР 13C данных молекулярная формула соединения 10 установлена как C15H22O5. ЯМР-спектральные данные для него соответствуют данным, полученным для 9, за исключением сигналов протонов и углерода при C-8. HMBC корреляции показали присутствие в соединении 10 карбоксильной группы в положении C-8. Относительная конфигурация была определена на основании NOESY взаимодействий. Соединение было названо паллидопениллином C.
Молекулярная формула соединения 11 установлена как C17H26O5 на основании данных HRESIMS и ЯМР 13C спектров. ЯМР-спектры данного соединения близко соответствовали спектрам паллидопениллина B (7), за исключением C-6-C-10 протонных и углеродных сигналов. HMBC взаимодействия H-9 (SH 1.56)/C-8 (SC 67.7), C-10 (SC 36.4); H3-15 (SH 1.07)/C-7 (5C 38.4), C-8, C-9 (5C 44.6) позволили установить структуру соединения 11 с гидроксильной и метильной группами в положении C-8. Относительная конфигурация 11 определена на основании наблюдаемых NOESY взаимодействий. Соединение было названо паллидопениллином D.
Молекулярная формула соединения 12 установлена как C17H27ClO6 на основании пиков квазимолекулярных ионов [M-H]- при m/z 361.1427 и [M+Cl]- при m/z 397.1179 в HRESIMS и была подтверждена данными ЯМР 13C. Интенсивность изотопных пиков M+2 указывала на присутствие атома хлора. HMBC взаимодействия позволили установить структуру кольца A и присутствие 3-ацетокси-1-оксопропильного фрагмента в положении C-4, как и в 1-ацетил-паллидопениллине A. Путем анализа констант спин-спинового взаимодействия H-11 и H-12, химических сдвигов C-11 (SC 61.4) и C-12 (5C 76.9) и HMBC взаимодействия определена структура кольца B, включая положение атома хлора при C-11, метильной и гидроксильной групп при C-13, а также гидроксильной группы при^12. Наблюдаемые NOESY корреляции указали на trans-сочленение колец A и B, ^-ориентацию атома хлора и метильных групп при С-14 и C-15 и на а-ориентацию OH-9, OH-12 и OH-13. Соединение 12 получило название паллидопениллин E.
Молекулярная формула 13 установлена как C17H28O6 на основании HRESIMS и ЯМР 13С. Корреляции, наблюдаемые в COSY и HMBC спектрах, позволили выявить строение колец А и В, положение метильных групп при С-8, С-13 и гидроксильных групп при C-11, C-12 и C-13. Структура и положение 3-ацетокси-1-оксопропильного остатка в положении C-4 в соединении 13 установлены на основании HMBC и COSY взаимодействий также как и в паллидопениллине Е. Относительные конфигурации C-4, C-5, C-8, C-10, C-11, C-12 и C-13 ассиметрических центров в соединении 13 идентичны конфигурациям асимметрических центров в соединении 12, что следует из анализа NOESY спектра. Соединение 13 было названо паллидопениллином F.
Молекулярная формула соединения 14 была определена как C17H26O5 на основании HRESIMS и ЯМР 13C. Структура кольца A и 3-ацетокси-1-оксопропильного фрагмента установлены также, как и для паллидопениллина E. Данные COSY-45 и HMBC спектров позволили определить структуру кольца B, включая двойную связь при С-12, С-13 и положение гидроксильной и метильной групп при C-11 и C-13. Относительная конфигурация
соединения 14 выявлена на основании NOESY взаимодействий H-5/H-9, H3-14; H-4/H-10 и H-8/H-10. Соединение 14 было названо паллидопениллином G.
Молекулярная формула соединения 15 идентифицирована как C17H26O5 на основании HRESIMS и ЯМР 13C. Структура кольца B и боковая цепь были установлены как и для паллидопениллина G. HMBC корреляции позволили определить структуру кольца A и положение ацетоксиметильной группы при C-8. Относительная конфигурация была установлена на основании NOESY корреляций. Соединение названо паллидопениллином H.
Соединения 5, 9, 11-13 были протестированы на цитотоксическую активность в отношении трех линий опухолевых клеток рака простаты человека 22Rv1, PC-3 и LNCaP. Паллидопениллин G (14) обнаружил активность в отношении 22Rv1 клеточных линий с ИК50 9,8 мкМ. Изучено действие паллидопениллинов на формирование и рост клеточной колонии 22Rv1 методом мягкого агара. Показано, что паллидопениллин G и 1-ацетил-паллидопениллин A ингибируют рост колонии этих клеток на 40 % в концентрациях 1 и 2 мкМ соответственно. Таким образом, его можно рассматривать в качестве перспективного канцер-превентивного агента.
15-деацетил-паллидопениллин B (8), паллидопениллин E (12) и паллидопениллин G (14) при концентрации 10 мкМ индуцируют достоверное снижение образования активной формы кислорода в макрофагах (АФК), стимулированных ЛПС. Уровень АФК уменьшился на 27 ± 1 (p < 0,01), 37 ± 3 (p < 0,01) и 36 ± 2 % (p < 0,01) соответственно по сравнению с контролем (клетками, обработанными ЛПС). Эти данные указывают на потенциальные иммуномодулирующие свойства изученных веществ.
Из липофильного экстракта штамма P. thomii KMM 4674, изолированного из микобио-ты ризома морской травы Z. marina, были выделены 12 новых поликетидных метаболитов декалинового ряда - зостеропениллинов A-L (16-27) (рис. 4) [2].
Молекулярная формула соединения 16 установлена как C15H22O3 на основании данных HRESIMS [M+Na]+ (m/z 273.1461) и подтверждена данными 13С ЯМР-спектра. COSY и HMBC спектры соединения 16 показали присутствие декалинового фрагмента в структуре молекулы, положение двойной связи при С-11, С-12 и метильных групп при C-8 и C-13. HMBC взаимодействия H-1a (5H 4.11)/C-2 (5C39.9), C-3 (5C210.2) и C-13; H-2a (5H 2.64)/C-1 (5C60.9), C-3; H-2b (5H 2.21)/C-3, C-4 свидетельствуют о наличии у-пиронового фрагмента в соединении 16. Относительная конфигурация соединения была установлена на основании анализа NOESY спектра подтверждена рентгеноструктурным анализом кристалла, полученного из смеси ацетонитрил-вода.
Абсолютная конфигурация 16 с помощью модифицированного метода Мошера определена как 4R, 5S, 8R, 9R, 10R, 13S (рис. 5). Соединение 16 было названо зостеропенил-лином А.
Молекулярная формула соединения 17 установлена как C15H22O3 на основании данных HRESIMS [M+Na]+ (m/z 273.1474) и подтверждена данными 13С ЯМР-спектра. Сигналы13С ЯМР-спектра соединения оказались очень близки соответствующим сигналам зостеро-пениллина А, за исключением сигналов С-9-С-11 и С-15 углеродных атомов в кольце А. COSY и HMBC корреляции в спектрах 17 позволили установить структуру кольца A, положение гидроксильной группы при C-9 и гидроксиметильной группы при C-8. Данные NOESY спектра указывали на транс-сочленение колец A и B, цис-сочленение колец B и C, а также на ^-ориентацию гидроксиметильной группы при C-8. Соединение 17 получило наименование зостеропениллин B.
Молекулярная формула соединения 18 определена как C15H22O3 на основании данных HRESIMS [M+Na]+ (m/z 273.1461) и подтверждена данными 13С ЯМР-спектра. Сигналы углеродных атомов для соединения 18 оказались близки соответствующим сигналам зо-стеропениллина В, за исключением сигналов С-6-С-10 и С-15 атомов в кольце А. Детальный анализ Щ,13С ЯМР и HMBC спектров позволил установить структуру соединения 18, включая гидроксильную и метильную группы при C-8. Относительная конфигурация
HO
OH
HO
OH
25
O 26
HO
OH
''OH 27
Рис. 4. Структуры зостеропениллинов A—L (16-27)
выявлена на основании NOESY взаимодействий. Соединение было названо зостеропенил-лином C.
Молекулярная формула соединения 19 установлена как С15Н22О2 на основании данных HRESIMS (m/z 257.1510 [M+Na]+) и подтверждена данными 13С ЯМР-спектра. Сигналы водородных и углеродных атомов в спектрах 19 были близки соответствующим сигналам зостеропениллина В, за исключением сигналов С-7-С-9 и С-15. Взаимные HMBC корреляции Н3-15/С-7 и С-9 позволили установить структуру кольца А и положение метильной группы при С-8. Соединение 19 было названо зостеропениллином D.
Сравнение теоретических статистически усредненных КД-спектров соединений 16-19 с соответствующими экспериментальными спектрами показало, что все спектры качественно подобны в области l > 200 нм, где наблюдались выраженные эффекты Коттона. Таким образом, абсолютные конфигурации были определены как 4R, 5S, 8S, 9R, 10R, 13S для 16; 4R, 5S, 8S, 10R, 13S - для 17; 4R, 5S, 8R, 10R, 13S -для 18; 4R, 5S, 8S, 10R, 13S - для 19.
O-MTPA
Рис. 5. Д5 (Ss-5r) уровни химических сдвигов (в м.д.) для S (16a) и R-MTPA эфиров (16b)
Молекулярная формула соединения 20 определена как С15Н24О3 на основании пика псевдомолекулярного иона с m/z 283.1538 [M-И^в HRESIMS и подтверждена 13C ЯМР анализом. По данным COSY спектров и наблюдаемым корреляциям в HMBC спектре установили присутствие декалиновой системы, насыщенного у-пиронового фрагмента в соединении 20 и положение метильных групп при С-8 и С-13 и гидроксильных групп при C-9, C-11 и C-12. Относительная конфигурация соединения определена на основании данных NOESY спектра и анализа констант спин-спинового взаимодействия (КССВ). Наблюдаемые NOESY корреляции и значение вицинальных констант спин-спинового взаимодействия между H-4 и H-5; H-5 и H-10; H-9 и H-10; H-10 и H-11; H-11 и H-12 указывают на транс-сочленение колец A и B, цис-сочленение колец B и C, а-ориентацию H3-14, 9-OH, 11-OH групп и ^-ориентацию H3-15 и 12-OH групп. Соединение 20 названо зостеропенил-лином E.
Молекулярная формула 21 идентифицирована как C15H24O4 на основании пика псевдомолекулярного иона с m/z 291.1579 [M+Na]+ в HRESIMS и подтверждена 13C ЯМР анализом. Сигналы углеродных атомов в спектре этого соединения близки соответствующим сигналам в спектрах зостеропениллина А, за исключением сигналов C-1-C-3, C-13 и С-14. Структура декалинового фрагмента и положение метильных групп при C-8 и C-13 и кислородных функций при C-9 и C-13 установлены с помощью COSY и HMBC корреляций также, как и для 16. COSY и HMBC корреляции указывают на присутствие 3-гидрокси-1-оксопропильного остатка при C-4. Относительная конфигурация 21 определена в результате NOESY эксперимента и анализа КССВ. Соединение 21 получило наименование зостеропениллин F.
Молекулярная формула соединения 22 установлена как C15H24O3 на основании пика псевдомолекулярного иона с m/z 275.1621 [M+Na]+ в HRESIMS и подтверждена 13C ЯМР анализом. Сигналы углеродных атомов в спектре 22 оказались близки соответствующим сигналам в спектре зостеропениллина D (19), за исключением сигналов C-1-C-3 и C-13, C-14. Структура декалиновой части, положение метильных групп при C-8 и C-13, кислородной функции при C-13 и 3-гидрокси-1-оксопропильного остатка при C-4 были определены на основании HMBC и COSY корреляций. Относительная конфигурация соединения 22 выявлена на основании данных NOESY эксперимента. Соединение 22 было названо зостеропениллином G.
Молекулярная формула соединения 23 установлена как C15H22O4 на основании HRESIMS (m/z 291.1571) [M+Na]+ и подтверждена данными 13С ЯМР-спектра. Структуры 1-, 2-, 3-, 4-замещенного циклогексанового кольца и боковой цепи в 23 определены, как и для зостеропениллинов Е (20) и F (21). Данные HMBC позволили установить структуру кольца В, положение двойной связи при С-12, С-13 и гидроксильной группы при C-11. Относительная конфигурация 23 была предложена на основании NOESY и КССВ. Соединение получило название зостеропениллин H.
Молекулярная формула соединения 24 идентифицирована как C15H22O3 на основании данных HRESIMS [M+Na]+ (m/z 273.1462) и подтверждена данными 13С ЯМР-спектра. Структуры кольца А и боковой цепи были установлены как для зостеропениллинов Е (20) и F (21). Наблюдаемые COSY и HMBC корреляции указывали на присутствие диеновой системы при C-11 и C-13(14) в соединении 24. Относительная конфигурация соединения была предложена на основании NOESY взаимодействий H-4/H-10; H-8 (5H 1.43)/H-10 и H-5 (5H 1.68)/H-9, H3-15 (5H 1.05). Соединение названо зостеропениллином I.
Молекулярная формула соединения 25 определена как C15H22O3 с помощью HRESIMS [M+Na]+ (m/z 291.1573) и подтверждена данными 13С ЯМР-спектра. Сигналы углеродных атомов в этом соединении практически совпадали с соответствующими сигналами в спектре соединения 22, за исключением сигналов С-7-С-9 и С-15 атомов. Эти данные и разница в 16 массовых единиц между молекулярными массами соединений 22 и 25 свидетельствуют о присутствии гидроксиметильной группы при С-8 в 22 вместо метильной группы в соединении 25. Наблюдаемые NOESY взаимодействия указывали на транссочленение
колец A и B, ¿^-ориентацию боковой цепи, метильной группы при С-14 и гидроксиметиль-ной группы при C-8. Соединение названо зостеропениллином J.
Молекулярная формула соединения 26 установлена как C15H22O5Na методом HRESIMS [M+Na]+ (m/z 305.1370) и подтверждена данными 13С ЯМР-спектра. В УФ-спектре данного соединения наблюдалась полоса поглощения при 242 нм, соответствующая еноновой хромофорной системе. Данные COSY и HMBC спектров позволили установить структуру колец А и В и указывали на 10-ен-12-он положение енонового хромофора в соединении 26. Структура боковой цепи была установлена на основании ЯМР-спектроскопии, как для зостеропениллина F (21). Относительная конфигурация 26 была предложена на основании анализа данных NOESY спектра и КССВ. Соединение 26 получило название зостеропениллин K.
Молекулярная формула соединения 27 определена как C15H24O5 на основании пика при m/z 307.1501 [M+Na]+ в HRESIMS и 13CNMR анализа. Структура кольца A в 27 была установлена также, как и для зостеропениллина K (26). Данные HMBC спектра соединения 27 позволили установить структуру кольца B, положение кислородных функций при C-12, C-13 и метильной группы при C-13. Относительная конфигурация соединения 27 выявлена на основании наблюдаемых NOESY корреляций H-5/H3-14; H3-14/H-12; H-4/H-6b; H-6b/H-8 и значения КССВ для H-4 (5H 3.09, J = 10,0 Hz). Соединение 27 было названо зостеропениллином L.
Было показано, что соединения 17, 23 и 25 индуцировали в липополисахарид-индуци-рованных мышиных макрофагах RAW 264.7 снижение выработки оксида азота на 27, 21 и 22 % соответственно в нецитотоксической концентрации 10 мкМ. Мы исследовали эффект зостеропениллинов 16-18, 22, 23, 25 и 26 на экспрессию белка р62, связанного с ауто-фагией. Анализ показал незначительное увеличение уровня p62 в клетках PC3, инкубированных с исследуемыми веществами. Эффект на экспрессию белка был схож с действием бафиломицина A1 (Baf), хорошо известного ингибитора аутофагии. Эти результаты показывают, что зостеропениллины способны ингибировать аутофагию в нецитотоксических концентрациях и могут повышать чувствительность клеток рака простаты человека для антиопухолевых препаратов.
В рамках продолжающегося поиска структурно новых биологически активных метаболитов из морских грибов, ассоциированных с морскими водорослями, мы исследовали гриб Pénicillium sp. KMM 4672, выделенный из вьетнамской бурой водоросли Padina sp. в 38-м рейсе НИС «Академик Опарин». Химические исследования привели к получению и идентификации трех новых 1,2-оксазадекалиновых эпидитиодикетипиперазинов претриходермамидов D-F (28-30) совместно с известными претриходермидом C (31) и Ж-метилпретриходермамидом B (32) (рис. 6) [17].
Брутто-формула соединения 28 была определена как C21H24N2O9S2 на основании псевдомолекулярного пика HRESIMS при m/z 511.0857 [M-H]-, что соответствует данным 13C ЯМР.
28 R1=OH R2=H 30 Ri=OH, R2=H
29 R1=H R2=OH 31 Ri=H, R2=oh
32 R1=H, R2=Cl
Рис. 6. Структуры соединений, выделенных из гриба Pénicillium sp. KMM 4672
Рис. 7. Значения Д5 (8S-8R) (в Гц) в MTPA-эфирах соединения 28
Прямое сравнение спектров 'И и13С ЯМР соединения 28 со спектрами претриходерма-мида C (31) [10] показало их сходство, включая сигналы двух метоксильных (5H 3.68, 3.78; 5C 55.7, 60.2), одной TV-метильной (5H 2.96; 5C 32.6), одной фенольной гидроксильной (5H 9.43) групп, двух ароматических метинов (5H 6.55, 7.32; 5C 103.3, 122.6) и двух амидных карбонильных групп (5C 164.2, 165.4), что говорит о близости углеродных скелетов соединений 28 и 31.
Корреляции, наблюдаемые в HMBC спектре, позволили установить наличие в структуре молекулы циклогексенового кольца с двойной связью между C-5 и C-6. Положение вторичных гидроксильных групп при C-7 и C-8 было доказано HMBC взаимодействиями от 7-OH (5H 4.89) к C-7 и от 8-OH (5H 4.35) к C-8. Таким образом была установлена плоская структура соединения 28.
Этерификация гидроксильных групп при C-7 и C-9' в соединении 28 (R)- и (S)-MTPA хлорангидридами привела к получению (S)- и ^-ди-MTPA-эфиров соответственно. Разница химических сдвигов Д8 (8s-8r) указывает на 7R конфигурацию (рис. 7).
Абсолютные конфигурации остальных стереоцентров в циклогексеновом кольце были определены как 4S, 8R, 9S. Абсолютные конфигурации установлены на основании ROESY корреляций 7-OH с H-9 и H-9 с 4-OH и 8-OH, а также значений КССВ 3JH8-H9 (9,4 Гц) и 3JH7-H8 (4,6 Гц), которые соответствуют расчетным диэдральным углам (177° и 46° соответственно). Абсолютные конфигурации при C-2, C-2' и C-3' были предложены такими же, как в известных адаметизине A (Ж-метилпретриходермамиде B) и адаметизине B (претриходермамиде C), на основании сходства химических сдвигов C-2, C-2' и C-3' для этих биогенетически родственных соединений. Соединение 28 было названо претриходермамидом D.
Брутто-формула соединения 29 определена как C21H24N2O9S2 (идентично соединению 28) на основании пика HRESIMS при m/z 511.0869 [M-H]- и 13C ЯМР анализа. Основные сигналы спектров 'И и 13C ЯМР соединения 29 соответствовали таковым в соединении 28, за исключением протонных и углеродных сигналов C-7 и C-8. Корреляции, наблюдаемые в HMBC спектре, подтверждают, что «плоская» структура соединения 29 идентична «плоской» структуре претриходермамида D (28). Вицинальные КССВ JH7-H8 (7,7 Гц) и JH8-H9 (10,7 Гц) в соответствии с уравнением Карплуса (расчетные диэдральные углы 168° и 174° соответственно) указывают на аксиальное положение H-7, H-8 (5H 3.56) и H-9. Эти относительные конфигурации были дополнительно подтверждены ROESY корреляциями H-7 с 8-OH (5H 4.64) и H-9. Абсолютные конфигурации хиральных центров соединения 29 были предложены такими же, как в претриходермамиде D (28) в соответствии с биогенетическими соображениями. Таким образом, соединение 29 было определено как эпимерпретриходермамида D по C-7 и названо претриходермамидом E.
Брутто-формула соединения 30 установлена как C21H24N2O9S2 (идентично соединениям 28 и 29) на основании данных HRESIMS и 13C ЯМР. Данные ЯМР для этого соединения были очень близки к таковым для претриходермамида C (31), за исключением протонных и углеродных сигналов при C-3-C-6 и C-9. HMBC взаимодействия в спектре 30 подтверждают «плоскую» структуру циклогексенового кольца с двойной связью между C-6 и C-7. Взаимные ROESY корреляции H-9 с 4-OH (SH 4.96), 5-OH (SH 5.19) и 8-OH (SH 5.15) указывают на а-ориентацию 5-OH и позволяют определить соединение 30 как С-5-эпимер претриходермамида C (31). Относительные конфигурации 1,2-оксазадекали-нового фрагмента были дополнительно подтверждены константой взаимодействия W-типа между H-9 (8H 3.97, дд, 7.3, 1.5) и H-3ß (8H 2.06, дд, 15.4, 1.5). Абсолютные конфигурации
в соединении 30 были предложены на основании биогенетического родства с соединениями 28, 29, 31 и 32. Соединение 30 названо претриходермамидом F.
Кроме новых претриходермамидов D-F (28-30) из гриба Pénicillium sp. КММ 4672 выделены также известные претриходермамид C (31) и Ж-метилпретриходермамид B (32).
Было исследовано действие соединений 28-32 на выживаемость и индукцию апоптоза в клетках рака простаты человека. В недавно опубликованной работе N-метилпретриходермамид B в концентрации до 10 мкМ не показал какого-либо цитото-ксического действия в отношении ряда различных раковых клеток. MTT метод выявил, что и Ж-метилпретриходермамид B (32) является высокоцитотоксичным для клеток 22Rv1, PC-3 и LNCaP с ИК50 0,51, 5,11 и 1,76 мкМ соответственно, при этом соответствующие значения ИК50 для доцетакселя (вещество сравнения) составляли 0,013, 0,015 и 0,004 мкМ. Стоит отметить, что соединение 32 индуцировало апоптоз в клетках простаты человека линии 22Rv1 (31,3 ± 8,2 % апоптоза после инкубирования с соединением в концентрации 1 мкМ в течение 48 ч), которые являются высокоустойчивыми к терапии, направленной на андрогеновый рецептор из-за потери лигандсвязывающего домена в этом рецепторе. Соединения 28-31 не проявили цитотоксической активности в отношении использованных клеток в концентрации до 100 мкМ. Также ни одно из исследованных соединений не оказало значительного эффекта на прогрессию клеточного цикла в той же концентрации. Стоит отметь, что N-метилпретриходермамид B (32), показывающий ингибирующую концентрацию (ИК50) в наномолярном диапазоне концентраций, был наиболее активен в отношении именно таких клеток, которые устойчивы к гормональной терапии. Кроме того, было исследовано действие соединений 28-32 на клетки мышиной карциномы Эрлиха и нетранс-формированные клетки мышей (спленоциты и эритроциты). Ж-метилпретриходермамид B не показал гемолитической активности в концентрации до 100 мкМ и был цитотоксичным для спленоцитов только в высоких концентрациях (ED50 62,1 мкМ).
Таким образом, из четырех морских изолятов грибов рода Penicillum, живущих на морских растениях, выделено несколько структурных серий новых вторичных метаболитов, включая декалиновые сесквитерпеноиды томимарины, соединения поликетидного происхождения - паллидопениллины, структурно близкие к ним зостеропениллины и 1,2-ок-сазадекалиновые эпидитиодикетипиперазины претриходермамиды D-F. Была изучена биологическая активность полученных метаболитов и показаны перспективные цитоток-сические свойства по отношению к опухолевым клеткам, а для некоторых из них - имму-номодулирующие и канцер-превентивные свойства.
ЛИТЕРАТУРА
1. Afiyatullov S.S., Leshchenko E.V., Sobolevskaya M.P., Denisenko V.A., Kirichuk N.N., Khudyakova Y.V., Hoai T.P.T., Dmitrenok P.S. Menchinskaya E.S., Pislyagin E.A., Berdyshev D.V. New eudesmane sesquiterpenes from the marine-derived fungus Pénicillium thomii // Phytochem. Lett. 2015. Vol. 14. P. 209-214.
2. Afiyatullov S.S., Leshchenko E.V., Berdyshev D.V., Sobolevskaya M.P., Antonov A.S., Denisenko V.A., Popov R.S., Pivkin M.V., Udovenko A.A., Pislyagin E.A., Von Amsberg G., Dyshlovoy S.A. Zosteropenillines: Polyketides from the marine-derived fungus Pénicillium thomii // Mar. Drugs. 2017. Vol. 15, N 2. P. 5020046.
3. Bhatnagar I., Se-Kwon Kim. Marine Antitumor Drugs: Status, Shortfalls and Strategies // Mar. Drugs. 2010. Vol. 8, N 10. P. 2702-2720.
4. Cueto M., Jensen P.R., Kauffman C., Fenical W., Lobkovsky E., Clardy J. Pestalone, a new antibiotic produced by a marine fungus in response to bacterial challenge // J. Nat. Prod. 2001. Vol. 64. P. 1444-1446.
5. Debbab A., Aly A.H., Lin W.H., Proksch P. Bioactive compounds from marine Bacteria and Fungi // Microbial Biotechnology. 2010. Vol. 3, N 5. P. 544-563.
6. Folmer F., Jaspars M., Diederich M. Photosynthetic marine organisms as a source of anticancer compounds // Phytochem. Rev. 2010. Vol. 9. P. 557-579.
7. Isaka M., Suyarnsestakorn C., Tanticharoen M., Kongsaeree P., Thebtaranonth Y. Aigialomycins A-E, new resor-cylic macrolides from the marine mangrove fungus Aigialus parvus // J. Org. Chem. 2002. Vol. 67. P. 1561-1566.
8. Itokawa H., Morita H., Watanabe K., Mihashi S., Iitaka Y. Agarofuran-type, eudessmane-type and eremophilane-type sesquiterpenoids from Alpinia-Japonica (Thunb.) // Chem. Pharm. Bull. 1985. Vol. 33 (3). P. 1148-1153.
9. Mathan S., Subramanian V., Nagamony S., Ganapathy K. Isolation of endophytic fungi from marine algae and its bioactivity // Int. J. Res. Pharm. Sci. 2013.Vol. 4, N 1. P. 45-49.
10. Orfali R.S., Aly A.H., Ebrahim W., Abdel-Aziz M.S., Müller W.E.G., Lin W., Daletos G., Proksch P. Pretricho-dermamide C and N-methylpretrichodermamide B, two new cytotoxic epidithiodiketopiperazines from hyper saline lake derived Penicillium sp. // Phytochem. Lett. 2015. Vol. 11. P. 168-172.
11. Osterhage C., Kaminsky R., Konig G.M., Wright A.D. Ascosalipyrrolidinone A, an antimicrobial alkaloid, from the obligate marine fungus Ascochyta salicorniae // J. Org. Chem. 2000. Vol. 65. P. 6412-6417.
12. Osterhage C., Konig G.M., Holler U., Wright A.D. Rare sesquiterpenes from the algicolous fungus Drechslera dematioidea // J. Nat. Prod. 2002. Vol. 65. P. 306-313.
13. Rateb M.E., Ebel R. Secondary metabolites of fungi from marine habitants // Nat. Prod. Rep. 2011. Vol. 28. P. 290-344.
14. Sobolevskaya M.P., Leshchenko E.V., Hoai T.P.T., Denisenko V.A., Dyshlovoy S.A., Kirichuk N.N., Khudya-kova Y.V., Kim N.Y., Berdyshev D.V., Pislyagin E.A., Kuzmich A.S., Popov R.S., Antonov A.S., Afiyatullov S.S. Palli-dopenillines: polyketides from the alga-derived fungus Penicillium thomii Maire KMM 4675 // J. Nat. Prod. 2016. Vol. 79. P. 3031-3038.
15. Sun R.R., Miao F.P., Zhang J., Wang G., Yin X.L., Ji N.Y. Three new xanthone derivatives from an algicolous isolate of Aspergillus wentii // Magn. Reson. Chem. 2012. Vol. 51. P. 65-68.
16. Yang G., Sandjo L., Yun K., Leutou A.S., Kim G.D., Choi H.D., Kang J.S., Hong J., Son B.W. Flavusides A and B, antibacterial cerebrosides from the marine-derived fungus Aspergillus flavus // Chem. Pharm. Bull. 2011. Vol. 59. P. 1174-1177.
17. Yurchenko A.N., Smetanina O.F., Ivanets E.V., Kalinovsky A.I., Khudyakova Y. V., Kirichuk N.N., Popov R.S., Bokemeyer C., Arnsberg G., Chingizova E.A., Afiyatullov S.S., Dyshlovoy S.A. Pretrichodermamides D-F from a marine algicolous fungus Penicillium sp. KMM 4672 // Mar. Drugs. 2016. Vol. 14, N 7. P. 122.
18. Zhuravleva O.I., Sobolevskaya M.P., Leshchenko E.V., Kirichuk N.N., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Dyshlovoy S.A., Zakharenko A.M., Kim N.Yu., Afiyatullov Sh.Sh. Meroterpenoids from the alga-derived fungi Penicillium thomii Maire and Penicillium lividum Westling // J. Nat. Prod. 2014. Vol. 77. P. 1390-1395.
19. Zhuravleva O.I., Sobolevskaya M.P., Afiyatullov Sh.Sh, Kirichuk N.N., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Yurchenko E.A., Dyshlovoy S.A. Sargassopenillines A-G, 6,6-spiroketals from the alga-derived fungi Penicillium thomii and Penicillium lividum // Mar. Drugs. 2014. Vol. 12, N 12. P. 5930-5943.
20. Zhuravleva O.I., Afiyatullov Sh.Sh., Denisenko V.A., Ermakova S.P., Slinkina N.N., Dmitrenok P.S., Kim N.Yu. Secondary metabolites from a marine-derived fungus Aspergillus carneus Blochwitz // Phytochemistry. 2012. Vol. 80. P. 123-131.
