CC BY
136
© Андрюков Б.Г., Недашковская Е.П., 2018 г DOI: 10.5281/zenodo.1488026
Удк 577.182.82.03
Б.Г. Андрюков, Е.П. Недашковская
вступая в пост-антибиотиковую эру: перспективные стратегии поиска новых альтернативных стратегий борьбы с инфекционными заболеваниями
НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, Владивосток
Быстрое нарастание резистентности бактерий к антибактериальным препаратам ставить под угрозу эффективность антибиотикотерапии, а значит и жизнь многих пациентов. Спустя несколько десятилетий после «золотой эры» антибиотиков инфекционные заболевания и осложнения вновь стали смертельной угрозой. Кризис резистентности бактерий к антибиотикам связан с безосновательно широким использованием и злоупотреблением этими препаратами, а также отсутствием разработки и производства новых поколений антибактериальных средств вследствие снижения экономической эффективности и усложняющихся нормативных требований. Пути и поиски перспективных направлений разработок альтернативных антибактериальных стратегий борьбы возбудителями инфекций делают менее тревожными ожидание нступления пост-антибиотиковой эры.
Ключевые слова: антибиотики, резистентность, бактерии, фаги, антимикробные пептиды, вакцины, бак-териоцины, антибактериальные антитела.
Для цитирования: Андрюков Б.Г., Недашковская Е.П. Вступая в пост-антибиотиковую эру: перспективные стратегии поиска новых альтернативных стратегий борьбы с инфекционными заболеваниями // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2018; 3: 36-50. DOI: 10.5281/zenodo.1488026.
Для корреспонденции: Андрюков Борис Георгиевич - д.м.н., в.н.с. лаборатории молекулярной микробиологии НИИЭМ имени Г.П. Сомова; е-mail: andrukov_bg@ mail.ru.
Поступила 07.10.18
B.G. Andryukov, E.P. Nedashkovskaya ENTRYING INTO POST-ANTIBIOTIC ERA: PROSPECTIVE STRATEGIES FOR SEARCHING FOR NEW ALTERNATIVE STRATEGIES TO FIGHT INFECTIOUS DISEASES
G.P. Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia
The rapid increase in bacterial resistance to antibacterial drugs jeopardizes the effectiveness of antibiotic therapy, and thus the lives of many patients. A few decades after the «golden era» of antibiotics, infectious diseases and complications again became a mortal threat. The crisis of bacterial resistance to antibiotics is associated with the unjustifiably widespread use and abuse of these drugs, as well as the lack of development and production of new generations of antibacterial agents due to the reduction in economic efficiency and complicated regulatory requirements. Ways and searches for promising areas for the development of alternative antibacterial strategies to combat infectious pathogens make it less alarming to wait for the postantibiotic era to emerge.
Key words: antibiotics, resistance, bacteria, phages, antimicrobial peptides, vaccines, bacteriocins, antibacterial antibodies.
For citation: Andrukov B.G., Nedashkovskaya E.P. Entrying into post-antibiotic era: prospective strategies for searching for new alternative strategies to fight infectious diseases. Health. Medical ecology. Science. 2018; 3: 36-50 (in Russia). DOI: 10.5281/zenodo.1488026.
For correspondence: Boris G. Andryukov; MD., е-mail: andrukov_bg@mail.ru. Conflict of interests. The authors are declaring absence of conflict of interests. Financing. The study had no sponsor support.
Received 07.10.18 Accepted 25.10.18
«Решение проблемы устойчивости к антибиотикам требует инноваций в области антибактериальных средств. Это имеет важное значение для того, чтобы избежать наступления пост-антибиотической эры».
Йохан С. Баккен, Всемирная Организация Здравоохранения
Открытие в 1928 г. британским микробиологом Александром Флемингом антимикробных свойств плесени PeniciШum notatum завершилось в 1941 г. успешным созданием первого мощного препарата, пенициллина, ознаменовалось появлением нового класса лекарственных средств и наступлением антибиотической эпохи [1].
Производство в последующие годы целого ряда различных классов природных антибактериальных препаратов ознаменовало наступление «золотой эры» антибиотиков, которая продолжалась около 30 лет. Эти революционные открытия изменили подход к лечению бактериальных инфекций и значительно снизили смертность от них. Однако этот период продлился недолго. В последние десятилетия открытие и развитие новых антибиотиков резко замедлилось. Большую озабоченность вызывает тот факт, что почти все антибиотики, появившиеся на рынке в последние 20-30 лет, были производными существующих препаратов, обнаруженных во второй половине ХХ в.
Бесконтрольное и необоснованное применение антибактериальных средств в лечебных и профилактических целях в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве и в пищевой индустрии привело в начале 80-х годов прошлого столетия к наступлению устойчивости микроорганизмов к антибиотикам, которая сегодня является общемировой проблемой. По мнению экспертов ВОЗ, к середине XXI в. в результате сложных и многофакторных причин бактериальная устойчивость к антибиотикам достигнет такого уровня, который будет представлять глобальную угрозу здоровью населения, а человечество вступит в пост-антибиотиковую эру [2, 3].
В наши дни в клинической практике все чаще используются относительно новые антимикробные категории: «множественная лекарственная устойчивость» (MDR) и «широкая лекарственная устойчивость» (XDR), являющиеся отражением реально меняющейся микробной резистентности [1, 4, 5]. Проблема бактериальной устойчивости перестает быть исключительно медицинской, затрагивая все более широкий круг социально-экономических проблем. Известно, что пациенты, инфицированные резистентными бактериями, нуждаются в более длительном лечении и подвергаются повышенному риску смертности.
По сведениям Европейского центра по профилактике и контролю заболеваний (ECDC), в экономически развитых странах ежегодно миллио-
ны людей заражаются бактериями, устойчивыми к антибиотикам и, по меньшей мере, от 25000 до 65000 из них погибают [2, 6, 7]. Прогнозируется, что из-за отсутствия адекватной терапии к 2050 г. в мире десятки миллионов жизней в год будут подвергаться риску гибели от бактериальных инфекций, а экономические потери государств из-за роста лекарственно-устойчивых инфекций составят сотни триллионов долларов [3, 9].
В последние годы обнаружено, что некоторые бактерии, такие как Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae, которые еще несколько лет назад были восприимчивы к традиционным антибиотикам, начали приобретать устойчивость к цефалоспоринам третьего поколения [2, 8, 10]. Современные тенденции таковы, что разработки новых противомикроб-ных препаратов в последние 30 лет оказались не очень перспективны, а за этот же период бактерии выработали несколько различных механизмов резистентности к антибиотикам, а именно:
- защиту от внутриклеточного проникновения антибиотика [11, 12];
- производство гидролитических ферментов (например, ß-лактамаз, карбопеменаз), которые вызывают разрушение антибиотиков [5, 13, 14];
- модификацию рецепторов-мишеней противоми-кробных средств [8, 15];
- снижение концентрации антибиотика во внутриклеточной среде с помощью насосов, присутствующих в бактериальных мембранах [7, 16];
- модификация ферментативного пути, приводящая к уменьшению бактериальной восприимчивости к антибиотику [17, 18];
- потерю внутриклеточных ферментов, используемых для активации антибактериальных средств [10, 19].
В этих условиях необходимость разработки потенциально новых средств борьбы с лекарственно устойчивыми микробными штаммами имеет первостепенное значение [20].
Цель настоящего обзора - обсуждение и анализ современных инновационных антимикробных практик, которые являются потенциальными альтернативами традиционной антибиотикотерапии. Основное внимание уделяется стратегиям, с механизмами действия отличными от антибиотиков. Среди наиболее перспективных направлений - бактериофаги и фаготерапия, использование моноклональных антител (mAb), вакцин, бактериоцинов, биологически активных веществ и другие (рис. 1).
Терапия малыми молекулами узкого спектра действия подавление вирулентности и роста резистентности. Экспресс-диагностика
Молекулярная медицина
Бактериальные пептиды (бакгериоцины) и биологически активные вещества (БАВ) из морских и почвенных экосистем
Создание антибиотиков
двойного действия -гетеродимерных структур на основе препаратов разных классов
Биотехнология
Активация иммунной системы,
через иммунологические (вакцины, иммуномодуляторы) и иммунотерапевтические
механизмы (моно- и поликлонапьные антитела)
Использование природных хищников (фаги, лизины)
Поиск специфических мишеней, изучение антибактериальных
механизмов в целях применения комбинированной
терапии, предотвращения V устойчивости у
Рис. 1. Современные инновационные антибактериальные практики -потенциальные альтернативы традиционной антибиотикотерапии (рисунок авторов)
Бактериофаги и фаготерапия
В последние годы наблюдается возрастание интереса к бактериофагам и использованию их с лечебными целями, особенно для терапии инфекций, ассоциированных с антибиотико-резистентными штаммами бактерий.
Бактериофаги (фаги) представляют собой вирусы, которые инфицируют бактерии. Они стали известны, благодаря открытиям микробиологов Е Twort (1915 г.) и Е д'НегеПе (1917 г.), которые открыли и доказали терапевтическую эффективность «фильтрующихся вирусов», основанные на их антибактериальных свойствах. После этого, фаги стали достаточно широко применяться для лечения инфицированных ран и ряда кишечных инфекций [4, 21, 22].
Таким образом, бактериофаги известны уже более века, и фаготерапия, по сути, не является новой стратегией. Она уже в течение нескольких десятилетий используется в качестве альтернативы или дополнения традиционной антибиотикотерапии бактериальных инфекций [23].
К 30-м годам в мире был накоплен определенный опыт лечебного и профилактического использования фагов. Однако в этот же период стали появляться критические статьи, ставивших под сомнение эффективность фаготерапии, а открытие первых
антибиотиков вскоре показало их преимущества перед фагами. Тем не менее, у нас в стране и в Польше научный и практический интерес к бактериофагам был достаточно высок. Их изучение и лечебное применение не прекращались даже в годы Великой Отечественной войны. В послевоенные годы, эпоху активных открытий новых антибиотиков, интерес к фагам как терапевтическим и профилактическим агентам во всем мире заметно упал, чему способствовали сообщения о появлении фаго-стойких бактерий и недостаточная исследованность патогенетических основ фаготерапии [6, 24].
В 70-80-е годы прошлого века появились сообщения о случаях успешного применения фаготерапии при эпидемических вспышках холеры (Пакистан) и диареи у домашних животных в странах Западной Европы [25]. Эти работы положили начало возрождению в мире интереса к фаготерапии. Этому в немалой степени способствовал накопленный опыт отечественных и польских ученых, которые не прекращали исследования и в послевоенные годы. Они внесли решающий вклад в изучение строения, антимикробного действия фагов и реакций на них со стороны иммунной системы человека [25, 26-28].
Длительный мировой опыт применения показал, что фаговая терапия безопасна для организма человека
и свободна от неблагоприятных побочных эффектов. Безопасность фагов для эукариотических клеток связана с отсутствием у этих биологических объектов какого-либо метаболического механизма. Современный интерес к фагам связан с их высокой специфичностью и уникальными антибактериальными свойствами против штаммов, устойчивых к обычным антимикробным препаратам. Фаготерапия стала рассматриваться как реальный способ повышения эффективности лечения бактериальных инфекций [7, 29, 30].
К настоящему времени охарактеризовано более пяти тысяч бактериофагов. Показано, что практически все они имеют специфическое строение (ико-саэдрическая головка, капсид с генетическим материалом внутри, хвост). Эти биологические объекты полностью лишены какого-либо метаболического аппарата, и, следовательно, являются облигатными внутриклеточными паразитами, использующими генетический и биохимический механизмы бактериальных клеток-хозяев [3, 5, 8, 30] (рис. 2).
Рис. 2. Типичное строение бактериофагов (рис. авторов)
В общем виде процесс инфицирования начинается с сорбирования фагов на поверхности бактериальной клетки. Большинство фагов, обнаруженных к настоящему времени, распознает рецепторы одного (монофаги) или нескольких видов бактерий-хозяев (полифаги) [29, 31-33]. Сложный процесс сорбирования состоит из трех фаз: установление контакта, связывания с рецептором и репликации генетического материала фага внутрь бактериальной клетки.
Метаболизм бактерии-хозяина перестраивается на производство новых фаговых частиц. Это не только блокирует процесс транскрипции собственного генома клетки-хозяина, но и стимулирует репликацию экзогенного генетического материала, кодирующего экспрессию фаговых белков (холинов и лизинов) и ферментов, которые вызывают последующий лизис клеточной стенки и высвобождение новых вирионов [28, 30, 33, 34] (рис. 3).
Рис. 3. Процесс инфицирования бактериальной клетки фагами: А - сорбирование фагов на поверхности; Б - репликация генетического материала внутрь клетки; В - производство новых фаговых частиц; Г - лизис клеточной стенки; Д - высвобождение новых вирионов (рис. авторов)
В настоящее время фаготерапия - одна из возможных антибактериальных стратегий в качестве альтернативы или дополнения в лечении бактериальных инфекций. Особый интерес представляет использование с этой целью умеренных лизогенных фагов [35, 36]. При этой разновидности фаготерапии применяются генетически модифицированные ли-зины для встраивания в геном бактериальной клетки посредством лизогенизации специфических генов, увеличивая ее восприимчивость к определенному классу антибиотиков [29, 30, 35, 37].
В последние годы появилось много научных сообщений об использовании лизинов и лизиновой терапии. Лизины представляют собой ферменты (в зависимости от типа каталитического домена - му-рамидазы, глюкозамидазы, трансгликолидазы, эндо-пептидазы или амидазы), продуцируемые и накапливаемые бактериофагами в бактериальной цитоплазме на конечном этапе фаголитического цикла. Таким образом высвобождается профаг и обеспечиваются новые циклы инфицирования бактерий. Лизины были широко протестированы и применены на различных моделях животных для контроля и лечения бактериальных инфекций, устойчивых к терапии обычными химическими антибиотиками [30, 37, 38].
Небольшое количество очищенных рекомбинант-ных лизинов, экзогенно вводимых в грамположитель-ные бактерии, показали высокую терапевтическую эффективность и способствовали быстрому лизису бактериальной клетки. Несмотря на то, что вскоре была обнаружена, ограниченность антибактериальной способности лизинов [10, 29, 30, 38], эти аген-
Так, в ходе фаготерапии, в организме происходит индукция образования специфических антител (нейтрализующие антитела) против фагов, которые подавляют эффективность лизиса целевых бактерий в естественных условиях [43, 44].
Конечно, в процессе эволюции бактерии выработали ряд механизмов устойчивости к бактериофа-
ты показали высокую надежность, специфичность и быструю способность стимулировать лизис клеток в целевых бактериях в нанограммных концентрациях, значительно уменьшая количество микроорганизмов, через несколько секунд после добавления литиче-ского фермента [29, 39]. Другие исследования показали синергизм действия лизинов и Р-лактамного антибиотика против штаммов Staphylococcus aureus, устойчивых к метициллину [29, 30, 40]. Высокая антибактериальная активность лизинов позволяет рассматривать их в ближайшем будущем в качестве перспективных агентов для лечения различных бактериальных инфекций, вызванных Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Clostridium perfringens, Bacillus cereus и Bacillus anthracis [11, 30, 35, 41].
Лизиновая терапия в настоящее время признана инновационным антимикробным средством лечения инфекций, вызванных грамположительной флорой. Местное введение препаратов, содержащих несколько нанограмм очищенных рекомбинантных ли-зинов, вызывает немедленный лизис бактериальных клеток. Кроме того, эта терапия демонстрирует си-нергетический потенциал в сочетании с некоторыми химическими антибиотиками [42].
Казалось бы, опыт использования традиционной фаготерапии в совокупности с современными мо-лекулярно-генетическими технологиями позволит в будущем успешно бороться с MDR и XDR, а фаги станут эффективной альтернативой антибиотикам. Однако не все так просто, и у фаготерапии есть свои недостатки и условия использования, несоблюдение которых снижает ее эффективность (табл. 1).
гам. В первую очередь защитные стратегии связаны с нарушением процесса адсорбции фагов к поверхности бактериальных клеток. Мутации приводят к потере специфических поверхностных рецепторов бактериальных клеток, которые позволяют связывать бактерии с фагом. Бактерии могут также индуцировать образование на поверхности клеток сли-
Таблица 1
Фаги или антибиотики: преимущества, недостатки и условия применения фаготерапии
Преимущества Недостатки Условия применения
• Высокая специфичность фагов и избирательность антибактериального действия • Естественные (природные) хищники бактерий • Фаги повсеместно распространены, легко изолируются и хорошо изучены. Изоляция новых бактериофагов относительно проста и экономична • Обладают хорошей проникающей транскутанной способностью накапливаться в очаге инфекции (in situ) • Не действуют на аутомикрофлору организма • Не влияют на эукариотические клетки • Отсутствует необходимость в дробном введении фага в организм • Обладают высокой способностью проникать в бактериальные биопленки • Могут мутировать и преодолевать устойчивость бактерий • Способность проникать через гематоэнцефалический барьер (лечение инфекций ЦНС) • В фаготерапии могут использоваться только литические фаги • Фаги вызывают иммунный ответ, выработку антител, которые снижают эффективность терапии • Необходимость на первой стадии идентифицировать патогенный микроорганизм, а затем изолировать специфический фаг из окружающей среды • Бактерии развили много разных механизмов устойчивости к фагам • Необходимость учета первичной фармакодинамики фагов (антибактериальная вирулентность) • Обязательность учета вторичной фармакодинамики фагов (безопасность для организма) • Узость антибактериального действия фагов оставляет возможность использования их в комбинации с другими агентами, включая фаги (фаговые коктейли) • Для защиты от иммунной системы организма требуется предварительная инкапсуляция фагов с биомолекулами или наночастицами
зистой оболочки, затрудняющей связывание фага с рецептором [43, 45].
В дополнение к этим механизмам бактерии могут гидролизовать генетический материал фага рестрик-ционными эндонуклеазами, присутствующими в их цитоплазме, а также способны метилировать свою собственную ДНК, защищая ее от фагов. Кроме того, бактериальная резистентность также может быть вызвана мутациями в генах, кодирующих белки, которые необходимы для репликации фага или для сборки новых частиц вирионов [30, 36, 46].
Интересны сообщения о результатах современных фаговых технологий борьбы с бактериальными инфекциями (загрязнениями) в процессе производства продуктов питания (молочные продукты) [47, 48], ветеринарии [49, 50], а также в системах очистки сточной и питьевой воды [51, 52].
Таким образом, в настоящее время перспективы фаготерапии достаточно оптимистичны, а результаты модельных исследований и клинических испытаний позволяют надеяться на то, что устойчивый рост научного интереса к фагам перерастет в широкое клиническое использование. В странах Европейского союза ученые, врачи и биотехнологические компании работают над тем, чтобы внедрить эти агенты в основную медицинскую практику с целью диагностики и лечения бактериальных инфекций, а также в качестве альтернативного метода и дополнения к современной антибактериальной химиотерапии.
Бактериоцины
В процессе жизнедеятельности для защиты и конкурентной борьбы за пространство и питательные вещества с другими таксономически родственными бактериями одного и того же вида или рода микроорганизмы синтезируют специфические пептиды с антимикробной активностью. Эти вещества впоследствии были отнесены к классу АМР и получили название бактериоцинов [8, 17, 45, 47].
История открытия и применения этих пептидов и фагов имеет много общего. Эти природные антибактериальные агенты и безвредные для человеческого организма были открыты в первой половине ХХ в. Однако использование их приостановило последующее открытие пищевых консервантов и антибиотиков, по сравнению с широким спектром действия которых, высокая специфичность фагов и бактериоцинов рассматривался как существенный недостаток этих агентов. Но в наши дни, когда стали очевидны пагубные последствия антибиотиков широкого спектра действия для естественных микробных сообществ человека, существует настоятельная необходимость в разработке высокоспецифических альтернатив. В настоящее время считается, что побочный ущерб, наносимый антибиотиками широкого спектра действия на кишечную микробиоту может быть фактором многих заболеваний [17, 34,
35]. Напротив, бактериоцины, как и фаги своей избирательностью действия способствуют восстановлению нормального биоценоза.
Первый бактериоцин выделил А. Gratia в 1925 г. из вирулентного штамма Escherichia coli [33]. Было обнаружено, что новое вещество, получившее название колицин V, обладает ингибирующей активностью в отношении других штаммов кишечной палочки [25, 28]. В дальнейшем разнообразная группа бактериоцинов разных типов, структур и механизмов действия были выделены и из других микроорганизмов [29, 40].
Среди наиболее известных и изученных бактериоци-нов, активных в отношении грамотрицательной микрофлоры, являются колицины и микроцины (полученные из Escherichia coli). Они ингибируют рост представителей семейства Enterobacteriaceae - Aeromonas sp., Escherichia sp., Salmonella sp., Yersinia sp. и Pseudomonas sp. Однако они неактивны в отношении грам-положительной флоры. С другой стороны, грампо-ложительные бактерии синтезируют бактериоцины, например, субтилин и низин A, напротив, не активны в отношении грамотрицательной флоры, у которых имеется трехслойная клеточная мембрана [25, 38].
В настоящее время охарактеризованы сотни бак-териоцинов, продуцируемых многими бактериями. Все они собраны в доступные базы данных и в последние десятилетия используются как в пищевой (для консервации готовых продуктов), так и в фармацевтической промышленности (для разработки антибактериальных препаратов).
Одними из наиболее изученных и широко используемых являются лантибиотики - бактериоцины, которые синтезируются молочнокислыми бактериями. Эти бактериоцины имеют катионную и амфифильную структуру и низкий молекулярный вес (3-10 кДа). В зависимости от количества аминокислотных остатков они подразделяются на I и II классы [31, 34, 39, 40].
Все известные бактериоцины характеризуются структурным разнообразием. Однако в типичном виде большинство из них состоит из С-концевого домена, ответственного за образование пор в мембране бактериальных клеток, и N-терминального домена, который связывает бактериоцины с клеточным рецептором, присутствующим на поверхности бактерий.
Внутри бактериальной клетки-продуцента бакте-риоцины находятся в неактивном состоянии, благодаря присутствию на N-терминальном домене ведущего пептида. Их активация происходит путем расщепления ведущего пептида протеазами после секреции во внеклеточную среду с помощью специфических белков-транспортеров [29, 31, 32].
Механизмы антибактериального действия бактериоцинов также разнообразны. Кроме того, во многих случаях один тип этих пептидов может проявлять несколько тактических вариантов атак на бактерии-мишени. Это может быть повышение проницаемости
клеточной мембраны путем нейтрализации анионного заряда фосфолипидного бислоя с его последующим разрушением (низин А), ингибирование синтеза пептидогликана и образование пор в мембране бактериальных клеток (лактицин 3147), истощение протон-двигательной силы клеточной мембраны и АТФ с последующей гибелью клеток (педиоцин PA-1/ AcH), увеличение проницаемости клеточной мембраны и истощение катионов, необходимых для жизнеспособности клеток, таких как кальций и магний и фосфаты (лактококцины G и Q) и другие [39, 40, 43].
Однако в научной литературе уже появились многочисленные сообщения о том, что бактерии выработали ряд защитных стратегий против бактерио-цинов и приобрели устойчивость к ним. Механизм устойчивости бактерий к низину А и другим бакте-риоцинам связан с увеличением мембранной текучести, что снижает эффективность антимикробного действия пептидов. Нейтрализация заряда клеточной поверхности усиливает способность бактерий отражать катионные бактериоцины. Эти механизмы устойчивости, по-видимому, связаны с мутациями в бактериальной ДНК [32, 44].
Например, двухкомпонентная система VirR/VirS регулирует экспрессию оперонов dltA и mprF, кодирующих большой мембранный белок грамотрицатель-ных и грамположительных бактерий, который защищает некоторые из этих бактерий от бактериоцинов путем уменьшения отрицательного заряда клеточной мембраны посредством добавления аминокислоты l-лизина к фосфотидилглицерину [42, 45].
И тем не менее к настоящему времени накоплен большой опыт применения бактериоцинов в пищевой промышленности, медицине и ветеринарии. Наиболее используемые в пищевой индустрии в качестве биопрепаратов являются лантибиотики, синтезированные из молочнокислых бактерий и получившие в Американском управлении по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, FDA) и Европейском агентстве по лекарственным средствам (EMA) статус GRAS (безопасные). Как облигатные бактерии желудочно-кишечного тракта, они легко метаболизируются до аминокислот пищеварительными протеазами.
Лантибиотики не имеют вкуса и запаха, демонстрируют высокую стабильность и высокую специфичность для конкретных бактерий, что делает их перспективными антимикробными агентами для применения в пищевой промышленности 27, 39, 40, 43, 45]. Некоторые виды лантибиотиков обладают свойствами, которые позволяют применять их для лечения инфекций ЖКТ, вызванных Helicobacter pylori, Escherichia coli и Salmonella [43, 45, 46].
Бактериоцины низин А и педиоцин PA-1 уже более 10 лет используются в качестве консервантов в пищевой индустрии, благодаря своим свойствам ингибиро-
вать рост таких бактерий как C. botulinum, E. faecalis, L. monocytogenes, S. aureus и другие [8, 17, 35, 37]. Другой бактериоцин, энтероцин RM6, был выделен из E. faecalis, присутствующего в сыром молоке. Он оказался активным против грамположительных бактерий, включая L. monocytogenes, B. cereus и метициллинрези-стентных штаммов S. aureus, ингибируя размножение этих патогенных бактерий в пищевых продуктах [26, 45].
Высокая специфичность антибактериальных свойств и безопасность лантибиотиков для организма обусловили широкое использование некоторых из них (низин А и F, мерсацидин, мутацин 1140, лактацин 3147 и педиоцин AcH / PA-1) в качестве лечебных и профилактических биопрепаратов. Применение этих бактериоцинов для лечения бактериальных инфекций, ассоциированных с метициллин- и ванкомицинрези-стентными штаммами патогенных бактерий, хорошо зарекомендовало себя как потенциальная терапевтическая стратегия борьбы с множественной лекарственной устойчивостью [8, 17, 35, 37, 45, 47].
Например, результаты экспериментальных исследований [35] показали, что низин F (выпускается в настоящее время под торговыми марками Nisaplin в США и Nisin Vega в Китае) ингибировал рост S. aureus у инфицированных мышей в течение 15 мин после введения, а клинические испытания низина А [цит. по 8] при лечении мастита у восьми женщин показали значительное снижение количества S. aureus в грудном молоке и полное выздоровление спустя 14 дней. Кроме того, низин был одобрен в 1969 г. комиссией ВОЗ [17, 35, 45, 47] и в настоящее время залицензирован более чем в 50 странах как безопасная пищевая добавка [17, 37].
Бактериоцин лактоспорулин (IM-9), продуцируемый Brevibacillus sp., с молекулярной массой 5,6 кДа оказался устойчивым к высоким температурам (до 120°С), толерантным к изменениям рН (между 2 и 10) и действию протеаз. При этом изменения этих параметров окружающей среды не влияли на его широкую антибактериальную активность как против грамположи-тельных, так и грамотрицательных бактерий, таких как B. subtilis, S. aureus, E. coli, L. monocytogenes и P. aeruginosa. Таким образом, лактоспорулин является инновационным бактериоцином широкого спектра действия с потенциальными возможностями для лечения нескольких бактериальных инфекций [35, 37].
Таким образом, бактериоцины - очень перспективная альтернатива химическим антибиотикам, а их практическое использование в медицине, ветеринарии и пищевой индустрии - инновационная стратегия в профилактике и борьбе с бактериальными инфекциями. Однако, несмотря на многолетний успешный опыт применения, их промышленное производство недостаточно финансируется по ряду причин, связанных с низким выходом и нестабильностью свойств готовых препаратов, дорогостоящей и трудоемкой очисткой.
Решение этих проблем видится в использовании методов генной инженерии и генетическом конструировании бактериоцинов. Это сможет повысить их антибактериальную активность и спектр действия, стабильность свойств и условий применения [8, 17, 47]. Кроме того, в настоящее время исследователи пытаются разработать химерные бактерии, заменяя N-концевой домен определенного класса бактериоцинов с С-терминальным доменом другого класса. По их мнению, это может повлечь образование более мощных и активных бактериоцинов. Например, генетическая модификация педиоцина PA-1 привела к получению нескольких химерных педиоци-нов, которые имели равную или большую антимикробную активность [8, 26, 35].
В последние годы внимание исследователей все больше привлекают морские бактерии родов Vibrio, Pseudoalteromonas, Aeromonas, Alteromonas и др. в качестве неисчерпаемого источника новых бакте-риоцинов в связи с высоким биологическим разнообразием этой экосистемы и тем, что она еще не до конца изучена. Вполне возможно, что в ближайшем будущем именно у морских микроорганизмов будут обнаружены перспективные бактериоцины с более высоким и широким спектром антибактериальной активности. Они обогатят арсенал механизмов борьбы против мультирезистентных бактерий и, несомненно, повысят привлекательность бактериоцинов в качестве новой стратегии и возможной альтернативы антибиотикам [18, 24, 40, 42].
Антимикробные пептиды
На фоне стремительного повышения устойчивости бактерий к антибиотикам увеличивается вероятность в ближайшие годы потери терапевтической активности этой лекарственной группы при лечении бактериальных инфекций. В связи с этим повысился интерес ученых и фармакологов к антимикробным пептидам (AMP) и применению их в качестве антимикробных агентов [47, 48, 49].
AMP впервые открыты еще в 1922 г., когда Александром Флемингом был обнаружен лизоцим, фермент с антибактериальной активностью, который присутствует в слезах, секрете потовых желез и моче человека. В настоящее время известно более 1700 АМР [44, 46. 48, 50] и некоторые из них хорошо изучены и охарактеризованы.
Эта группа эндогенных полипептидов широко распространена в природе и состоит из 50-100 и более аминокислот, кодируемых одиночными генами. В зависимости от аминокислотного состава и вторичной структуры АМР подразделяются на четыре группы, отличающиеся по размерам и механизмам действия:
- пептиды с а-спиральной структурой;
- пептиды с ß-многожильной структурой;
- линейные пептиды, которые с неупорядоченной структурой;
- пептиды с петлевой структурой [48, 49, 50, 52].
В катионной (чаще) структуре АМР представляет интерес амфипатическая область, состоящая из гидрофобных и гидрофильных доменов и являющаяся ключевой для их механизма действия. Она участвует в образовании пор, последующем клеточном лизисе и разрушении мембраны бактериальных клеток. AMP имеют широкий спектр антимикробного действия в защитной стратегии животных и растений против нескольких типов бактерий, грибов и вирусов [49, 50].
Современные исследования позволили выявить целый ряд интересных функций АМР:
- антимикробная активность в отношении бактерий с множественной лекарственной устойчивостью;
- стимуляция накопления иммунных клеток (ней-трофилов, макрофагов и лимфоцитов) в месте очага инфекции;
- нейтрализация липополисахаридных эндотоксинов, продуцируемых грамотрицательными бактериями;
- ускорение грануляции ран;
- стимуляция ангиогенеза;
- модуляция защитных реакций иммунной системы;
- противовоспалительная активность.
Важным свойством АМР является отсутствие их токсического влияния на эукариотические клетки. Клеточная мембрана эукариотов состоит из фосфати-дилхолина, фосфатидилэтаноламина, сфингомиелина, холестерина и эргостерола с нейтральным сетевым зарядом, который отталкивает AMP и предотвращает их разрушительное воздействие. Напротив, бактериальные мембраны имеют отрицательный заряд, благодаря присутствию в их составе фосфатидилглицерина, кардиолипина и фосфатидилсерина. Это вызывает на первом этапе возникновение электростатического взаимодействия с положительно заряженными пептидами. В дальнейшем разрушение бактериальной мембраны происходит по четырем известным механизмам, которые в итоге приводят к образованию в мембране пор, ее дестабилизации и лизису [47, 48].
Важно отметить, что не все AMP действуют только путем лизиса клеточной мембраны. Некоторые из них способствуют гибели клеток бактерий, накапливаясь внутриклеточно. Такие пептиды могут влиять на жизненно важные процессы жизнеспособности клеток:
- активировать репликацию ДНК или синтез мРНК;
- вызывать перегруппировка и конформация внутриклеточных белков;
- снижать активности цитоплазматических ферментов;
- вызывать перекисное окисление липидов с последующим образованием свободных радикалов кислорода, повреждением ДНК, деполяризацией мембран митохондрий, апоптозом и в конечном итоге гибелью бактериальных клеток. [44, 46, 49, 50]. По-видимому, в контексте бактериальной инфекции, AMP используют одновременно несколько механизмов действия [44, 46].
Рассматривая пептиды в качестве возможной альтернативной стратегии традиционной антибио-тикотерапии при лечении местных и, возможно,
Выявленные многочисленные преимущества АМР позволяют рассматривать их в качестве потенциальной и инновационной альтернативной стратегии для существующей традиционной антибиотикотерапии. Они могут использоваться при микробных и вирусных инфекциях одновременно с несколькими обычными антибиотиками и противовирусными препаратами, проявляя синергические эффекты. Кроме того, пептиды могут применяться как иммуномодуляторы, стимулирующие иммунную систему, а также в качестве нейтрализаторов бактериальных эндотоксинов, предотвращая, например, септический шок [49, 50].
И все-таки на сегодняшний день практическое использование АМР ограничено. Это связано с тем, что в клинических испытаниях высокие концентрации, демонстрирующие терапевтический антимикробный эффект пептидов in situ оказались очень близки к токсическим дозам. Кроме того, выяснилось, что из-за небольшого размера AMP они фильтруются в почках, что резко сокращает период их полураспада [13, 21, 50].
В настоящее время несколько предложенных AMP находятся на разных этапах доклинических и клинических испытаний, демонстрируя различную терапевтическую активность. Омиганан (MBI-226, синтетический аналог индолидидина) с расширенным спектром активности против микроорганизмов, в том числе грам-положительных и грамотрицательных бактерий, а также грибов (Candida sp.); XOMA 629 и Migenix MX-226, активные против Propionibacterium acnes, используются для лечения угревой сыпи (акне); Iseganan (IB-367), синтетический катионный AMP с широким спектром активности против бактерий и грибов, применяется для лечения респираторных инфекций, кистозного фиброза и язв в полости рта; катионный пептид P113, с высокой терапевтической активностью in vitro против Candida
генерализованных бактериальных инфекциях, следует резюмировать их преимущества и недостатки [32, 54] (табл. 2).
albicans, с потенциалом, который может рассматриваться в качестве альтернативного препарата для лечения кандидоза полости рта у людей, инфицированных ВИЧ; пептид DPK-600, который находится в клинических испытаниях для лечения атопического дерматита; Плекта-зин, первый AMP, полученный из гриба Pseudoplectania nigrella с высокой активностью против Streptococcus pneumoniae [43, 47, 49, 51].
Ряд пептидов уже более 10 лет достаточно активно используются в клинической практике и признаны в качестве антибактериальных и антифунгицидных средств. На фармацевтическом рынке на сегодняшний день АМР представлены в виде группы новых антибиотиков. Наиболее широкую известность получили полимиксины B и E (колистин) и даптомицин (инъекционный вариант - Cubicin®). Даптомицин представляет собой продуцируемый Streptomyces roseosporus циклический анионный липопептид, который демонстрирует бактерицидную активность в отношении чувствительных грамположительных микроорганизмов (стафилококков - S. aureus, S. haemolyticus, стрептококков - S. agalactiae, S. pyogenes, группы G, Cl. perfringens, Peptostreptococcus spp). Он используется для лечения инфекций, вызванных в том числе резистентными к метициллину, ванкомицину и лине-золиду штаммами [49, 50, 52].
Полимиксины B, М и E представляют собой циклические катионные липопептиды, выделенные в 40-50-х гг., из Bacillus polymyxia. Эти АМР характеризуются узким спектром активности и высокой токсичностью. Поли-миксин В, предназначенный для парентерального введения, в течение многих лет рассматривался как резервный препарат, используемый при лечении синегнойной инфекции. Полимиксин М назначался внутрь при кишечных инфекциях. В настоящее время применяются
Таблица 2
Преимущества и недостатки использования AMP в качестве возможной альтернативной стратегии традиционной антибиотикотерапии [по 44, 46, 49, 50]
Преимущества Недостатки
• Механизм действия AMP направлен на ключевые морфофункциональ-ные компоненты бактериальных клеток, нарушая их жизнеспособность; • несколько AMP проявляют одновременную антибактериальную, противогрибковую и противовирусную терапевтическую активность; • AMP демонстрируют терапевтическую антимикробную активность в чрезвычайно малых количествах (микрограммы и нанограммы); • AMP имеют более широкий спектр антимикробного действия; • пептиды способны создавать высокие концентрации в месте очага инфекционного заражения; • сложность и многовекторность повреждающего действия пептидов на бактериальные клетки снижает вероятность развития резистентности; • AMP действуют очень быстро; • AMP ингибируют образование биопленок; • AMP взаимодействуют с бактериальными клетками, находящимся в разных фазах деления; • AMP продемонстрировали синергизм при введении в сочетании с антибиотиками • АМР восприимчивы к действию протеаз, легко теряют активность, что ограничивает их широкое использование; • при введении в высоких дозах могут оказывать дестабилизирующее действие на мембраны клетки эукариот; • на активность AMP влияют изменения рН среды и возможное взаимодействие с белками плазмы крови; • сравнительно высокие затраты на производство и очистку AMP; • низкая стабильность AMP и более высокая подверженность протеолизу • фармакокинетика, фармакодинамика и токсикологическое действие AMP пока еще недостаточно изучены; • существует теоретическая возможность развития микробной резистености к АМР Предполагаемые механизмы связаны с изменениями поверхностного заряда бактериальной мембраны (нейтрализация или уменьшение отрицательного заряда) и другими метаболическими путями.
ограниченно, чаще в виде «местных» лекарственных форм [47, 50]. Полимиксин Е (колистин), зарекомендовал себя в лечении септицемии при кистозном фиброзе, кожных, мочевых и респираторных инфекциях, вызванных Pseudomonas aeruginosa [12, 22, 14, 49].
Несомненный интерес представляет сравнительно недавно открытый (R. Yan et al., 2011) a-спиральный пептид Hp1090 из яда скорпиона Heterometrus petersii, показавший на доклинических испытаниях активность против вируса гепатита С (HCV). Механизм антивирусного действия связан с ингибированием репликации РНК HCV и тем самым предотвращением инфекции. Таким образом, Hp1090 можно рассматривать в качестве перспективного потенциального агента для терапевтической стратегии против хронического вирусного гепатита С, ассоциированного с циррозом печени и гепатоцеллюлярной карциномой [11, 16, 50].
Наконец, среди перспективных АМР следует упомянуть пептид Kn2-7, выделенный из яда скорпиона Mesobuthus martensii. В испытаниях на мышинных моделях этот пептид показал широкую антибактериальную (S. aureus, B. subtilis, B. thuringiensis и M. luteus, E. coli и P aeruginosa и мультирезистент-ные штаммы) [52] и антивирусную активность (выявил наибольшую тропность к вирусу ВИЧ-1, эффективно ингибируя его репликацию). Кроме того, есть несколько интересных результатов научных исследований, демонстрирующих in vitro наличие у пептидов противоопухолевую и антипролиферативную активность в опухолевых клетках мочевого пузыря, молочной железы, моноцитарного лейкоза (cecropin B, LL-37, MDA MB 435) [43, 50], способность инги-бировать образование биопленок [50, 52].
Важно отметить и установленный эффект синер-гетического взаимодействия пептидов с традиционными антибиотиками. Этот эффект связан с тем, что АМР нарушают структуру мембраны бактериальных клеток, что увеличивает их проницаемость для антибиотиков и способствует их проникновению и интрацеллюлярному накоплению. Например, введение пептидов магаинина II (выделенного из лягушки Xenopus laevis) и кекропина А (изолированного из гемолимфы Hyalophora cecropia) совместно с ри-фампицином, выявило существенное снижение количества Pseudomonas aeruginosa не только in vitro, но и в клинических испытаниях in vivo [51, 52].
В настоящее время для преодоления недостатков использования AMP в качестве возможной альтернативной стратегии традиционной антибиотикотерапии предлагается несколько решений, в том числе: введение новых аминогрупп в концевую область AMP с целью повышения стабильности пептидов действию протеаз; инкапсуляцию пептидов в липосомах для накопления их in situ и уменьшая их токсичности; синтез с помощью генной инженерии недорогих пептидов активных против мультирезистентных бактерий и грибов [50, 52].
Антибактериальные антитела
Попытки использовать антитела для лечения инфекционных заболеваний (проводить пассивную иммунизацию) делались еще в XIX в. Однако серьезное изучение механизмов действия и исследование фармакокинетики стали проводиться в последние десятилетия. В наши дни лечение микробных инфекций с помощью антибактериальных антител пока еще не стало реальностью, так как большинство уже обнаруженных антител все еще находится на разных стадиях клинических испытаний.
Технология получения антител начинается с иммунизации животных (крысы, мыши). Для стандартизации процесса была разработана Г. Келлером и Ц. Мильштейном в 1975 г. методика получения клеточных гибридом. В ответ на введение антигена в организме животного плазматические клетки продуцируют антитела (иммуноглобулины). Для сохранения жизнеспособности в течение неограниченно долгого времени плазмоциты соединяют с клеточной культурой опухолевых клеток. Образуется ги-бридома, а гибридные клетки годами жить и размножаться в искусственных культуральных средах, образуя популяцию родственных клеток (клоны), которые в течение длительного времени сохраняют способность синтезировать однородные по структуре и специфичности моноклональные антитела в неограниченных количествах (рис. 4).
Механизмы действия антител разнообразны и зависят от целевой бактерии и мишени. Например, ре-комбинантные антитела pagibaximab (BSYX-A110) при трехкратном системном введении оказывали специфическое действие на липотейхоевые кислоты Staphylococcus aureus, необходимые для стимулирования экспрессии TLR2. При связывании с липотейхоевыми кислотами антитела этого типа стимулировали фагоцитоз и ингибировали выделение провоспалительных цитокинов. Таким образом, антитела BSYX-A110 зарекомендовали себя хорошо переносимыми, безопасными и эффективными при лечении и профилактике инфекций, вызванных Staphylococcus aureus [41, 50].
Иные механизмы повреждающего действия используют антитела 2E9IgA1, специфичные для Mycobacterium tuberculosis. Выявлено, что они обладают высокой тропностью для а-кристаллического рецептора микобактерии, а также для рецептора CD89 макрофагов и нейтро-филов. Эти связывания либо стимулировали фагоцитоз бактерий, либо активировали бактерицидное действие нейтрофилов. Применение этих антител может в ближайшем будущем способствовать сокращению времени химиотерапии у пациентов с туберкулезом, снижать вирулентность микобак-терий и появление штаммов с множественной лекарственной устойчивостью [59].
Таблица 3
Примеры антибактериальных антител, находящихся в настоящее время в стадии клинических испытаний
Антитела Целевые бактерии Компании-производители
Anthim (ETI-204) Raxibacumab Valortim (MDX-1303) CDA1/CDB1 ShigamAbs Urtoxazumab Anti-Pseudomonas IgY KB001 Panobacumab (KBPA101) Pagibaximab Bacillus anthracis Bacillus anthracis Bacillus anthracis Clostridium difficile Shiga toxin-producing Escherichia coli Shiga toxin-producing Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Elusys Therapeutics Human Genome Sciences PharmAthene/Medarex Medarex/MassBiologics/Merck Thallion Pharmaceuticals Teijin Immunsystem KaloBios Pharmaceuticals/Sanofi Pasteur Kenta Biotech Biosynexus
Среди других перспективных препаратов следует отметить антитела, направленные на борьбу с лекарственно-устойчивыми штаммами бактерий и нейтрализацию их токсинов (табл. 3): Bacillus anthracis (мишень - защитный антиген), Clostridium botulinum (ботулинический токсин), Escherichia coli (шига-токсин и эндотоксин), Clostridium difficile (токсины A и B), Staphylococcus aureus (липотейхоевая кислота, коллагенты A, GrfA, поли-К-ацетилглюкозамин, альфа-токсин и HlgAB, HlgCB, LukSF, LukED, LukGH лейкоцидиновые токсины), коагулазо-отри-цательные стафилококки (липотейхоевая кислота), Staphylococcus epdermidis (связывающий фибриноген белок SdrG), Pseudomonas aerugininosa (PcrV, O-антиген, экзотоксин A), Vibrio cholera (эндотоксин), Yersiniapestis (капсид Fl Белок, V-белок), Chlamydia trachomatis (основной белок наружной мембраны).
Кроме того, эта альтернативная стратегия используется в настоящее время для лечения вирусных инфекций (пример - заболевания, ассоциируемые с
респираторно-синцитиальным вирусом) и при лечении рака [52, 60]. Моно- и поликлональные антитела были протестированы при лечении гепатита В и С, ВИЧ, бешенства, гриппа А, лихорадках Денге, Эбо-ла, Нипа и Западного Нила.
Антифунгицидный эффект моноклональных антител был изучен на следующих грибах (мишенях): Paracoccidioides brasiliensis (белок gp43), Cryptococcus neoformans (капсульный полисахарид), Aspergillus fumigatus (поверхность клеточной стенки гиф), Candida spp (белок теплового шока 90) и Pneumocystis jiroveci (поверхностные антигены) [60, 61]. В ближайшем будущем антитела, возможно, будут использоваться в профилактике и лечении бактериальных инфекций у животных.
Таким образом, накопленный опыт использования моноклональных антител в клинической практике показал их высокую активность в борьбе против бактериальных, вирусных и грибковых инфекций. Чрезвычайная избирательность в сочетании с без-
опасностью и эффективностью делает их перспективными терапевтическими стратегиями.
Однако использование антител имеет некоторые недостатки, связанные с дорогостоящими технологиями их синтеза и очистки, что с учетом небольшого спроса отражается на стоимости конечного продукта. Кроме того, необходимость системного использования антител и потеря со временем клинической эффективности из-за антигенной вариации бактерий ограничивают их практическое применение [54, 55, 61].
Вакцины
Современные вакцины представляют собой рекомби-нантные антигены, которые при введении в организм с помощью адъюванта или плазмиды индуцируют иммунный ответ против конкретного возбудителя. Кроме того, антимикробные вакцины могут содержать живые реком-бинантные микроорганизмы, такие как Mycobacterium bovis, Listeria monocytogenes, Salmonellae spp. и Shigellae spp., в геном которого был вставлен ген, кодирующий желаемый антиген(ы). Такого рода ДНК-вакцины уже нашли практическое применение. При конструировании таких вакцин гены вводятся в плазмиду и кодируют несколько антигенов. Таким образом, при введении, они могут индуцировать выработку специфических антител против нескольких возбудителей [62, 63].
Среди перспективных препаратов, находящихся в настоящее время на клиническом испытании, следует выделить вакцину IC43, состоящую из двух рекомбинантных антигенов и предназначенную для профилактического применения против инфекций, ассоциированных с Pseudomonas aeruginosa; вакцины GSK2392105A и SA3Ag, содержащие по 3-4 антигена, которые иммунизируют против Staphylococcus aureus; вакцины, защищающие от Neisseria meningitidis, Burkholderia pseudomallei и Escherichia coli; а также препарат HlaH35L, содержащий генетически инактивированный а-токсин и вызывающий иммунизацию мышей при инфицировании Staphylococcus aureus [12, 46, 63].
В странах, регулярно проводящих антипневмококковую вакцинацию, например, в Великобритании, наблюдалось снижение случаев инфекций верхних дыхательных путей, ассоциированной с этим возбудителем (отиты, фарингиты и синуситы) на 20% [64].
Иные источники потенциальных новых антимикробных агентов
Необходимость поиска новых антибиотиков с иными механизмами антибактериального действия привела к чрезвычайно интересной идее - вернуться к изучению натуральных продуктов путем скрининга почвенных микроорганизмов, но на этот раз с использованием новых современных технологий. Поиск и открытие источников новых антимикробных соединений из почвенных микроорганизмов активно проводился в 60-70-е гг. прошлого столетия, однако он довольно быстро завершился в связи с труд-
ностями с их лабораторным культивированием и идентификацией. Около 99% этих бактерий не культивировались в лабораторных условиях [32, 65, 66]. К идее выращивать, дифференцировать и изучать антимикробную активность микроорганизмов из почвы вернулись в последние годы, когда Nikols et al. (2010) разработала для этих целей многоканальную систему, состоящую из сотен наноразмерных диффузионных камер под названием iChip. Эта система позволяет одновременно изолировать и выращивать некультивируемые бактерии [цит. по 20].
Новый подход вскоре начал давать свои результаты. Совсем недавно J.-H. Lui et al. (2016), используя такую систему и специфические Х факторы роста, изолировали пептид тейксобактин, из нового вида, грамотрицательных ß-протеабактерий, получивших условное название Eleftheria terrae [31]. Выявлено, что этот пептид в очень низких концентрациях проявлял высокую активность против мультире-зистентных штаммов Staphylococcus aureus, а также ингибировал рост Mycobacterium tuberculosis, Clostridium diffycile и Bacillus anthracis. Механизм его антимикробного действия, по-видимому, связан с ингибированием начальных стадий синтеза молекул бактериальной клеточной стенки.
Другие исследования для выявления новых антибактериальных агентов использовали против Streptococcus pneumoniae протеиново-липидный комплекс HAMLET, в состав которого входит человеческое грудное молоко и а-лактальбумин, смертельно опасный для опухолевых клеток. Этот природный комплекс убивал Streptococcus pneumoniae и не вызывал развитие резистентности [54]. Эти, несомненно, успешные и интересные результаты дают основания надеяться, что современные инновационные стратегии поиска новых антимикробных молекул откроют широкие перспективы для синтеза новых природных антибиотиков.
Выводы
Мы живем на планете, где одновременно существуют сотни миллионов видов живых организмов, между которыми постоянно идет непримиримая борьба за жизненные пространства и питательные ресурсы. В процессе жизнедеятельности человечество столкнулось с поразительным свойством бактерий повышать свою устойчивость к химическим антибиотикам, широко используемым последние десятилетия для лечения и профилактики инфекционных заболеваний людей и домашних животных. В виду опасности полной потери их терапевтической эффективности в течение последующих 5 лет и возникновения реальной угрозы существованию человеческой популяции возрастает необходимость разработать альтернативные антимикробные стратегии, чтобы решить эту серьезную проблему, с которой столкнулось современное общество.
В настоящее время разрабатываются несколько перспективных стратегий поиска новых средств борьбы с инфекционными заболеваниями, альтернативных традиционной антибиотикотерапии: бактериофаги и фаготерапия, антимикробные пептиды и бактерио-цины, моноклональные антитела, вакцины, пробио-тики, биологические активные вещества. Внедрены или проходят клинические испытания сотни агентов, относящиеся к этим классам, которые обладают высоким антибактериальным потенциалом, специфическими механизмами активности и широким спектром действия, не подавляя при этом комменсальную флору организма-хозяина. Однако, несмотря на очевидные преимущества перед традиционными антибиотиками, отсутствие необходимых данных о фармакокинетике и фармакодинамике этих терапевтических веществ in vivo, высокие издержки производства и нестабильность конечных продуктов ограничивают их продвижение и использование в клинической практике.
Углубление современных знаний об этих инновационных терапевтических стратегиях имеет первостепенное значение. Возможно, что в ближайшем будущем они окажутся незаменимыми антибактериальными средствами последней надежды и спасут миллионы жизней.
В феврале 2016 г. J.-H. Lui et al. были опубликованы сведения об обнаружении плазмидного гена mcr-1 в США и Китае, ответственного за приобретенную резистентность у патогенных штаммов Escherichia coli к колистину - бактериоцину из группы полимик-синов, антибиотику «последней надежды» против мультирезистеной микрофлоры с которым связывали свои надежды многие исследователи. Опасность состоит в передаче этого гена другим бактериям.
Это открытие подтверждает актуальность поиска новых перспективных антимикробных стратегий, а пост-антибиотиковая эра стала еще ближе.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке Комплексной программы фундаментальных исследований Дальневосточного отделения РАН «Дальний Восток», проект № 18-5-099
ЛИТЕРАТУРА
1. Schmelcher M., Powell A.M., Becker S.C. et al. Chimeric phage lysins act synergistically with lyso-staphin to kill mastitis-causing Staphylococcus aureus in murine mammary glands. Appl Environ Microbiol 2012; 78 (7): 2297-2305.
2. Aarestrup F.M. The livestock reservoir for antimicrobial resistance: a personal view on changing patterns of risks, effects of interventions and the way forward. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2015; 370 (1670): 20140085. doi: 10.1098/rstb.2014.0085.
3. Rouveix B. Clinical implications of multiple drug resistance efflux pumps of pathogenic bacteria. J Anti-microb Chemother 2007; 59 (6): 1208-1209.
4. Abedon S.T., Kuhl S.J., Blasdel B.G. et al. Phage treatment of human infections. Bacteriophage 2011; 1 (2): 66-85. doi: 10.1016/j.tibtech.2010.08.001.
5. Baltzer S.A., Brown M.H. Antimicrobial peptides-promising alternatives to conventional antibiotics. J Mol Microbiol Biotechnol 2011; 20 (4): 228-235. doi: 10.1159/000331009.
6. Balu S., Reljic R., Lewis M.J. et al. A novel human IgA monoclonal antibody protects against tuberculosis. J Immunol 2011; 186 (5): 3113-3119. doi: 10.4049/jim-munol.1003189.
7. Bebbington C., Yarranton G. Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects. Curr Opin Biotechnol 2008; 19 (6): 613-619. doi: 10.1016/j.copbio.2008.10.002
8. Андрюков Б.Г., Запорожец Т.С. Беседнова Н.Н., Перспективные стратегии поиска новых средств борьбы с инфекционными заболеваниями. Антибиотики и химиотерапия 2018; 63(1-2): 44-55.
9. Berry J.D., Gaudet R.G. Antibodies in infectious diseases: polyclonals, monoclonals and niche biotechnology. N Biotechnol 2011; 28 (5): 489-501.
10. Borysowski J., Weber-Dabrowska B., Gorski A. Bacteriophage endolysins as a novel class of antibacterial agents. Exp Biol Med 2006: 231 (4): 366-377.
11. Bruhn O., Grotzinger J., Cascorbi I. et al. Antimicrobial peptides and proteins of the horse - insights into a well-armed organism. Vet Res 2011; 42 (1): 98-119.
12. Carlet J., Mainardi J.L. Antibacterial agents: back to the future. Can we live with only colistin, co-trimox-azole and fosfomycin? Clin Microbiol Infect 2012; 18
(1): 1-3.
13. Balogh B., Jones J.B., Iriarte F.B. et al. Phage therapy for plant disease control. Curr Pharm Biotechnol 2010; 11 (1): 48-57.
14. Chanishvili N. Phage Therapy-History from Twort and d'Herelle Through Soviet Experience to Current Approaches. Literature Review 2012; 778: doi: 10.1016/B978-0-12-394438-2.00001-3.
15. Ojala V., Laitalainen J., Jalasvuori M. Fight evolution with evolution: plasmid-dependent phages with a wide host range prevent the spread of antibiotic resistance. Evol Appl 2013; 6 (6): 925-932.
16. Cho J., Hwang I.S., Choi H. et al. The novel biological action of antimicrobial peptides via apoptosis induction. J Microbiol Biotechnol 2012; 22 (11): 1457-1466.
17. Андрюков Б.Г., Беседнова Н.Н., Запорожец Т.С., Бынина М.П. Бактериальные токсин-антиток-синовые системы и новые стратегии создания антибактериальных препаратов. Антибиотики и химиотерапия 2018; 63(3-4): 50-58.
18. Daniel A., Euler C., Collin M. et al. Synergism between a novel chimerical lysin and oxacillin protects against
infection by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 2010; 54 (4): 1603-1612.
19. Edgar R., Friedman N., Molshanski-Mor S. et al. Reversing bacterial resistance to antibiotics by phage-mediated delivery of dominant sensitive genes. Appl Environ Microbiol 2012; 78 (3): 744-751.
20. Chan B.K., Abedon S.T. Phage therapy pharmacology phage cocktails. In: Laskin, A.I., Sariaslani, S., Gadd, G.M. (Eds.), Advances in Applied Microbiology, vol. 78. Elsevier Academic Press Inc., San Diego, 2012; pp. 1-23.
21. Fernebro J. Fighting bacterial infections - future treatment options. Drug Resist Updat 2011; 14 (2): 125-139.
22. Кристофер Д. Фьелл , Ян А. Хисс , Роберт Э.В. Хэнкок и Гисберт ШнайдерFjell C.D., Hiss J.A., Hancock R.E.W. et al. Существует ошибка (1 февраля 2012 года), связанная с этой статьей.Designing antimicrobial peptides: form follows function. Nature Reviews Drug Discovery 2012; 11: 37-51. doi: 10.1038/nrd3591.
23. Björn C., Hakansson J., Myhrman E. et al. Anti-infectious and anti-inflammatory effects of peptide fragments sequentially derived from the antimicrobial peptide centrocin 1 isolated from the green sea urchin, Strongylo-centrotus droebachiensis. AMB Express 2012. 2 (1), 67-78.
24. Ianiro G., Tilg H. Gasbarrini A. Antibiotics as deep modulators of gut microbiota: between good and evil. Gut 2016; 65(11): 1906-1915. doi: 10.1136/ gutjnl-2016-312297.
25. Hagens S., Loessner M.J. Bacteriophage for bio-control of foodborne pathogens: calculations and considerations. Curr. Pharm. Biotechnol. 2010; 11 (1): 58-68.
26. Kawada-Matsuo M., Yoshida Y., Zendo T. et al. Three distinct two-component systems are involved in resistance to the class I bacteriocins, nukacin ISK-1 and nisin A in Staphylococcus aureus. PLoS One 2013; 8 (7): e69455.
27. Kutateladze M. Experience of the Eliava Institute in bacteriophage therapy. Virol Sin 2015; 30: 80-81. doi: 10.1007/s12250-014-3557-0.
28. Lee H., Kim H.Y. Lantibiotics, class I bactiriocins from the genus Bacillus J Microbiol Biotechnol 2011; 21 (3): 229-235.
29. Balcäo V.M., Vila D.C. Structural and functional stabilization of protein entities: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 2015; 93: 25-41.
30. Aminov R.I. A brief history of the antibiotic era: lessons learned and challenges for the future. Front Microbiol 2010; 1 (134): 1-7. doi: 10.3389/ fmicb.2010.00134.
31. Liu J.-H., Shen J. Emergence of plasmid-medi-ated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study. Lancet Infect Dis 2016; 16 (2): 161-168.
32. Maura D., Debarbieux L. Bacteriophages as twenty-first century antibacterial tools for food and medicine. Appl. Microbiol. Biotechnol 2011. 90 (3), 851-859.
33. McGowan S., Buckle A.M., Mitchell M.S. et al. X-ray crystal structure of the streptococcal specific phage lysin PlyC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2012. 109 (31), 12752-12757.
34. Livermore D.M. Future directions with daptomy-cin. J Antimicrob Chemother 2008: 62 (3); 41-49.
35. Mills S., Ross R.P., Hill C. Bacteriocins and bac-teriophage; a narrow-minded approach to food and gut microbiology. FEMS Microbiol Rev 2017; 41: S129-S153. doi: 10.1093/femsre/fux022.
36. Nakatsuji T., Gallo R.L. Antimicrobial peptides: old molecules with new ideas. J Invest Dermatol 2012; 132 (3): 887-895.
37. Nishie M., Nagao J., Sonomoto K. Antibacterial peptides «bacteriocins»: an overview of their diverse characteristics and applications. Biocontrol Sci 2012; 17 (1): 1-16.
38. Oldfield E., Feng X. Resistance-resistant antibiotics. Trends Pharmacol Sci 2014; 35 (12): 664-674.
39. Pirnay J., Verbeken G., Rose T. et al. Introducing yesterday's phage therapy in today's medicine. Future Virol 2012; 7 (4): 379-390.
40. Sao-José C. Phage endolysins with broad antimicrobial activity against Enterococcus faecalis clinical strains. Microbial Drug Resist 2012; 18 (3): 322-332.
41. Yan R., Wu L., Cai D. et al. A new natural a-helical peptide from the venom of the scorpion Heterometrus petersii kills HCV. Peptides 2011; 1(32): 11-19. doi: 10.1016 /j.peptides.2010.10.008.
42. Rang H P., Dale M.M., Ritter J.M. et al. Rang & Dale's Pharmacology, 7th ed. Elsevier, Churchill Livingstone. 2012.
43. Nitsch-Osuch A., Gyrczuk E., Wardyn A. et al. Antibiotic prescription practices among children with influenza. Adv. Exp. Med. Biol. 2016. 905, 25-31.
44. Rodríguez-Rubio L., Martínez B., Rodríguez A. et al. The phage lytic proteins from the Staphylococcus aureus bacteriophage vB SauS-phiIPLA88 display multiple active catalytic domains and do not trigger staphy-lococcal resistance. PLoS One 2013; 8 (5): e64671, doi: 10.1371/journal.pone.0064671.
45. Alvarez-Sieiro P., Montalban-Lopez M., Mu D. et al. Bacteriocins of lactic acid bacteria: extending the family. Appl Microbiol Biot 2016; 100: 2939-2951. doi: 10.1007/s00253-016-7343-9.
46. Marks L.R., Clementi E.A., Hakansson A.P. et al. The human milk protein-lipid complex HAMLET sensitizes bacterial pathogens to traditional antimicrobial agents. PLoS One. 2012; 7(8): e43514.
47. Mathur H., Field D., Rea M.C. et al. Bacterio-cin-Antimicrobial Synergy: A Medical and Food Perspective. Front Microbiol 2017; 8: 1205. doi: 10.3389/ fmicb.2017.01205.
48. Kutter E., De Vos D., Gvasalia G. et al. Phage therapy in clinical practice: treatment of human infections. Curr Pharm Biotechnol 2010; 11 (1): 69-86.
49. Potera C. Phage renaissance: new hope against antibiotic resistance. Environ Health Perspect 2013; 121 (2): 48-53.
50. Romanelli R.M., Clemente W.T., Lima S.S. et al. MRSA outbreak at a transplantation unit. Braz J Infect Dis 2010; 14 (1): 54-59.
51. Laverty G., Gorman S.P., Gilmore B.F. The potential of antimicrobial peptides as biocides. Int J Mol Sci 2011; 12 (10): 6566-6596.
52. Hyman P., Abedon S.T. Bacteriophage host range and bacterial resistance. In: Laskin, A.I., Sariaslani, S., Gadd, G.M. (Eds.), Advances in Applied Microbiology, vol. 70. Elsevier Academic Press Inc., San Diego, 2010. pp. 217-248.
53. Schuch R., Pelzek A.J., Raz A. et al. Use of a bac-teriophage lysin to identify a novel target for antimicrobial development. PLoS One 2013; 8 (4): e60754.
54. Seo M., Won H., Kim J. et al. Antimicrobial pep-tides for therapeutic applications: a review. Molecules 2012; 17 (10): 12276-12286.
55. Stavri M., Piddock L.J., Gibbons S. Bacterial efflux pumps from natural sources. J Antimicrob Chemother 2007; 59 (6): 1247-1260.
56. Wittebole X., de Roock S., Opal S.M. A historical overview of bacteriophage therapy as an alternative to antibiotics for the treatment of bacterial pathogens. Virulence 2013; 4 (8): 1-10.
57. Xu T., Ying J., Yao X. et al. Identification and characterization of two novel bla (KLUC) resistance genes through large-scale resistance plasmids sequencing. PLoS One 2012; 7 (10): e47197.
58. Summers W.C. The strange history of phage therapy. Bacteriophage 2012; 2 (2): 130-133.
59. Tamaki H., Zhang R., Angly F.E. et al. Metage-nomic analysis of DNA viruses in a wastewater treatment plant in tropical climate. Environ Microbiol 2012; 14 (2): 441-452.
60. Ter Meulen J. Monoclonal antibodies in infectious diseases: clinical pipeline in 2011. Infect Dis Clin North Am 2011; 25(4): 789-802.
61. Ferrer M., Mendez-Garcia C., Rojo D. et al. Antibiotic use and microbiome function. Biochem Pharmacol 2016; doi: 10.1016/j.bcp.2016.09.007.
62. Tsang K.Y., Luk S., Lo J.Y. et al. Hong Kong experiences the «Ultimate superbug»: NDM-1 Enterobac-teriaceae. Hong Kong Med J 2012; 18 (5): 439-441.
63. Viertel T.M., Ritter K., Horz H.-P. Viruses versus bacteria - novel approaches to phage therapy as a tool against multidrug-resistant pathogens. J Antimicrob Chemother 2014; 69 (9): 2326-2336.
64. WHO. Antimicrobial Resistance. 2015, Available online at www.who.int.
65. Martinez-Julvez M., Rojas A.L., Olekhnovich I. et al. Structure of RdxA: an oxygen insensitive nitrore-ductase essential for metronidazole activation in Helico-bacter pylori. J. Fed. Eur. Biochem. Soc 2012. 279 (23), 4306-4317.
66. Fenton M., Ross P., McAuliffe O. et al. Recombinant bacteriophage lysins as antibacterial. Bioeng Bugs 2010: 1 (1); 9-16.
67. Escobar-Paramo P., Gougat-Barbera C., Hochberg M.E. Evolutionary dynamics of separate and combined exposure of Pseudomonas fluorescens SBW25 to antibiotics and bacteriophage. Evol Appl 2012; 5 (6): 583-592.
Сведения об авторах
Андрюков Борис Георгиевич - заслуженный врач РФ, д.м.н., в.н.с. лаборатории молекулярной микробиологии НИИЭМ имени Г.П. Сомова; е-mail: andrukov_bg@ mail.ru;
Недашковская Елена Петровна - к.б.н., ученый секретарь НИИЭМ имени Г.П. Сомова; е-mail: secr_niiem@ mail.ru.
© Коллектив авторов, 2018 г. DOI: 10.5281/zenodo.1488030
УДК 614.3/.4:579.842.14:579.252.55].083.1(Дальний Восток, Сибирь)
Н.А. Кузнецова, А.С. Соловьева, А.В. Раков
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К АНТИБИОТИКАМ У ШТАММОВ SALMONELLA ENTERITIDIS, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ СИБИРИ И ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА, ПО ДАННЫМ МНОГОЛЕТНЕГО МОНИТОРИНГА
НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, Владивосток
Цель исследования - дать сравнительную оценку антибиотикочувствительности популяциям S. Enteritidis, формирующим эпидемиологическую ситуацию в различных регионах Сибири и Дальнего Востока, в зависимости от географии их плазмидных характеристик и периода выделения. Материалы и методы. Исследовано 345 штаммов S. Enteritidis (при спорадической заболеваемости - 255 штаммов, при вспышечной - 41 штамм, из проб продуктов - 46 штаммов, из проб внешней среды - 3), изолированных из различных экологических источников и при разной эпидемиологической ситуации за период 1990-2017 гг. Чувствительность штаммов микроба к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом на агаре Мюллера-Хинтон. Результаты. Установлено, что на каждой из выделенных территорий все штаммы чувствительны к имипенему, резистентны
