CC BY
29
УДК 616.98:579.881.11:595.421
ISSN 2221-7711 Национальные приоритеты России. 2014. № 3 (13)
ВСТРЕЧАЕМОСТЬ И ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ РИККЕТСИЙ В ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ КОМИ
М.Ю. Карташов1, Т.П. Микрюкова1,4, И.В. Корабельников2, Ю.И. Егорова3, Н.Л. Тупота1,
В.А. Терновой1,4, Е.В. Протопопова1,4, В.Б. Локтев1,4 1ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Кольцово Россия, р.п. Кольцово Новосибирского района Новосибирской области, 630559; support@ruzakaz.com.
2ФГУП «Дезинфекция», Сыктывкар Республика Коми, 167000, г. Сыктывкар, ул. Димитрова, д. 3/3; gigprof@list.ru 3Сыктывкарский государственный университет Республика Коми, 167001, г. Сыктывкар, Октябрьский пр., 55; тел. (8212) 255-109 4Томский государственный университет Россия, 34050, Томская область, г. Томск, ул. Ленина, д. 36; rector@tsu.ru
На наличие ДНК риккетсий методом ПЦР исследовано 676 таежных клещей I. persulcatus, отловленных на территории Республики Коми. ДНК Rickettsia spp. была выявлена в 51 образце, уровень инфицированности клещей составил 7,5 %. Генотипирование риккетсий путем определения и сравнения нуклеотидной последовательности фрагмента гена gltA показало, что 32 образца (62,7 %) принадлежат к R. helvetica и 19 образцов (37,3 %) относятся к Candidatus R. tarasevichiae. Для изоля-тов R. helvetica была определена нуклеотидная последовательность фрагмента гена ompB. Уровень гомологии по фрагменту гена gltA Candidatus R. tarasevichiae, распространенных в Республике Коми, составил 100 % с ранее описанными изолятами; для R. helvetica - 99,9 % (gltA) и 99,8 % (ompB).
Ключевые слова: риккетсии, R. helvetica, Candidatus R. tarasevichiae, Республика Коми.
OCCURRENCE AND GENETIC DIVERSITY IN NATURAL POPULATIONS OF RIKKETSIAS
OF TICKS IN KOMI REPUBLIC
M.Y. Kartashov1, T.P. Mikryukova1,4,1.V. Korabelnikov2, Y.I. Egorova3, N.L. Tupota1, V.A. Ternovoy1,4,
E.V. Protopopova14, V.B. Loktev1,4 TBSI State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo 630559, Koltsovo, Novosibirsk region , Russia 2SFUC "Disinfection", Syktyvkar 3Syktyvkar State University, Syktyvkar "Tomsk State University, Tomsk
We studied 676 ticks I. persulcatus, caught in taiga in the Komi Republic, for the presence of rickettsial DNA with PCR. DNA of Rickettsia spp. was found in 51 samples, the infection rate of ticks was 7.5%. Genotyping rickettsiae by determining and comparing the nucleotide sequence of the gltA gene fragment revealed that 32 samples (62.7%) belonged to R. helvetica and 19 samples (37.3%) were Candidatus R. tarasevichiae. For isolates of R. helvetica the nucleotide sequence of the gene ompB was determined. Candidatus R. tarasevichiae homology to a fragment of the gene gltA, common in the Komi Republic, was 100% in the previously described isolates; for R. helvetica - 99,9% (gltA) and 99,8% (ompB). Keywords: Rickettsia, R. helvetica, Candidatus R. tarasevichiae, Komi Republic.
Общая ситуация по природно-очаговым инфекциям, передающимися иксодовыми клещами, неуклонно усложняется год от года. Наиболее
значимой причиной такого развития событий является открытие неизвестных ранее патогенных для человека микроорганизмов, существующих
Молекулярно-генетические исследования
в естественных экосистемах, и, следовательно, новых для здравоохранения и науки природно-очаговых инфекций, а также усиливающиеся процессы урбанизации, которые интенсифицируют контакты людей с природными очагами. Наряду с вирусом клещевого энцефалита и боррелиями, риккетсии являются значимыми патогенами, инфицирующими человека при укусе клеща. Перечень новых патогенов растет год от года, так как внедрение современных молекулярно-биологи-ческих методов исследования приводит к открытию новых видов и подвидов риккетсий, а также описанию новых риккетсиозных синдромов.
В настоящее время в России регистрируют заболевания только двумя риккетсиозами из группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ): сибирский клещевой риккетсиоз, вызываемый R. sibirica и распространенный преимущественно в азиатской части России, и астраханская пятнистая лихорадка, встречающаяся в Астраханской области и вызываемая R. conori subsp. caspiensis. Однако научные исследования, проводимые с использованием моле-кулярно-биологических методов, позволяют обнаруживать в клещах, собранных на территории России, генетический материал и других патогенных для человека видов риккетсий (R. heilongjiangensis, R. slovaca, R. aeschlimannii, R. helvetica), а так же риккетсий с неустановленной патогенностью (например, Candidatus R. tarasevichiae). Эти данные свидетельствуют о высокой актуальности исследований по изучению генетического разнообразия риккетсий, циркулирующих на территории России и необходимости уточнения вопроса о роли рикке-тсий новых генотипов в инфекционной патологии. Уточнение спектра циркулирующих в регионах риккетсий и их возможных переносчиков имеет огромное значение для совершенствования диагностики клещевых риккетсиозов и выбора наиболее оптимальной тактики их лечения.
В последние годы регистрируется рост случаев укуса иксодовыми клещами, а также заболеваемости клещевым энцефалитом и клещевым бор-релиозом в Республике Коми, располагающейся на северо-востоке Европейской части России. На территории Республики Коми точные границы ареала клещей I. persulcatus четко не определены, однако известно, что в последние десятилетия произошло резкое продвижение границы ареала на Север, что вероятно связано с изменением климата, интенсивной вырубкой лесов и другими антропогенными воздействиями на природные ландшафты этого региона.
Цель исследования состояла в выявлении риккетсий в природных популяциях клещей I. persulcatus на территории Республики Коми и изучение их видового разнообразия.
Материалы и методы. В исследование было взято 676 взрослых особей клещей I. persulcatus, которые были собраны в течение весенне-летних периодов 2011-2013 гг. в южных и центральных районах Республики Коми, где наиболее часто регистрируются случаи присасывания клещей. Участки для сбора подбирались в типичных местах обитания клещей: лиственные и смешанные леса с хорошо развитым травянистым покровом, лесные вырубки, на лугах, обочинах дорог. Суммарные нуклеиновые кислоты были экстрагированы из клещей с помощью набора для выделения РНК/ДНК НПО «Литех» (Москва). С целью контроля этапа выделения нуклеиновых кислот, а так же её сохранности при хранении, со всеми изучаемыми образцами была проведена ПЦР на выявление участка гена цитохромокидазы, локализованного в митохондриальном геноме I. persulcatus. Первичный скрининг клещей на наличие генетических маркеров риккетсий проводили с помощью ПЦР в режиме реального времени с использованием пары праймеров и зонда, специально разработанных нами для этой цели. Положительные образцы использовали для генетического типирования риккетсий по фрагменту гена gltA (760 н.). Для образцов, генотипированных по gltA как R. helvetica, дополнительно был амплифицирован фрагмента гена белка наружной мембраны B (ompB) длиной 1500 н. Определение нуклеотидных последовательностей полученных фрагментов проводили на автоматическом секвенаторе ABI 3130x1 Genetic Analyzer (США). Все последовательности были определены дважды в независимых экспериментах. При проведении филогенетического анализа для сравнения использовали последовательности прототипных изолятов, опубликованных в международной базе данных GenBank. Сравнение и анализ полученных нуклеотидных последовательностей выполнены с использованием пакета программ MEGA 6. Полученные в работе нуклеотидные последовательности задепонированы в базу данных GenBank под номерами KF859949-KF8599565 и KJ572322-KJ572333 для gltA Candidatus R. tarasevichiae; KF859937-KF8599548 и KJ572334-KJ572350 для gltA R. helvetica; KJ572351-KJ572382 для ompB R. helvetica.
результаты и обсуждение. Методом ПЦР в режиме реального времени ДНК Rickettsia spp. была выявлена в 51 образце, уровень инфициро-ванности составил 7,5±1,1 %. Генотипирование риккетсий проводили путем определения и сравнения нуклеотидной последовательности фрагмента гена цитратсинтазы gltA, который по литературным данным наиболее часто используеется
ISSN 2221-7711 Национальные приоритеты России. 2014. № 3 (13)
для филогенетического анализа риккетсий. С помощью филогенетического анализа установлено, что 32 образца риккетсий из Республики Коми (62,7 %) принадлежат к R. helvetica и 19 образцов (37,3 %) относятся к Candidatus Rickettsia tarasevichiae. Для изолятов R. helvetica, обнаруженных на территории Республики Коми, также были определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена ompB (длиной 1500 н.). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена ompB подтвердил результаты генотипирования, полученные по фрагменту гену gltA.
Уровень гомологии по фрагменту гена gltA Candidatus R. tarasevichiae, распространенных в Республике Коми, составил 100 % с изолята-ми, раннее обнаруженными в Западной Сибири (R. tarasevichiae strain Ust'-Tarka, DQ168981) и Восточной Сибири (R. tarasevichiae strain Stolby, DQ168982), а также в Китае (Candidatus Rickettsia tarasevichiae isolate MDJ13, JX996054). Образцы R. helvetica из Коми имеют уровень сходства с другими риккетсиями этого вида 99,9 %. Все выделенные нами изоляты R. helvetica характеризуются синонимичной транзицией CTC^CTT в третьей позиции кодона, кодирующего Leu344 цитратсинтазы по сравнению с известными прототипами (R. helvetica C9P9, U59723; R. helvetica Ip-4, DQ131912; R. helvetica 20-2, EU359285). Гомология изучаемых образцов R. helvetica по фрагменту гена ompB составила 99,8 % с другими прототипами, выделенными в Швейцарии (R. helvetica C9P9, AF123725), в Германии (R. helvetica Mue29, HQ232251) и в Румынии (R. helvetica I28, JX683116). По сравнению с перечисленными изолятами у образцов из Коми имеется одна синонимичная транзиция (AAT^ AAC) в третьем положении кодона, кодирующего Asn773 белка наружной мембраны В и две несинонимичные транзиции. Транзиция в первом положении кодона GTT^ATT приводит к заме-
щению Val926 на Ile926, а GGT^AGT приводит к замещению Gly1219^Ser1219.
R. helvetica впервые была выделена из клеща I. ricinus в 1979 году в Швейцарии, впоследствии риккетсии этого вида были обнаружены в клещах I. ricinus во многих европейских странах. Недавние исследования продемонстрировали, что ареал распространения R. helvetica выходит далеко за пределы Европы. Риккетсии, идентичные или близкородственные R. helvetica были выявлены в клещах I. ovatus, I. persulcatus и I. monospinosus, собранных на территории Японии.
Candidatus R. tarasevichiae имеет широкое географическое распространение на территории России от Уральских гор до Приморья. Candidatus Rickettsia tarasevichiae близкородственна R. canadensis (98 % гомологии по гену 16S рибосомальной РНК и 96 % по гену gltA) и входит в так называемую «предковую» группу риккетсий. На основании того, что R. canadensis является ответственной за случаи острого церебрального васкулита в странах Северной Америки, делались предположения, что и Candidatus Rickettsia tarasevichiae может быть потенциально патогенной для человека. Подтверждением этой догадки может служить работа китайских ученых, опубликованная в 2013 году. Так в образцах крови от 5 пациентов, госпитализированных на северо-востоке Китая после укуса клеща, методом ПЦР была выявлена ДНК этой риккетсии. У больных наблюдалась лихорадка, головная боль, высыпания, тошнота, лимфаденопатия, астения и потеря аппетита.
Таким образом, полученные данные подтверждают широкое распространение риккетсий, переносимых клещами I. persulcatus и возможность полиэтиологического характера риккетсио-зов на территории Республики Коми. Это следует учитывать врачам-инфекционистам при дифференциальной диагностике заболеваний, передающихся иксодовыми клещами.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Глушкова Л.И., Корабельников И.В., Егорова Ю.И., Терновой В.А., Протопопова Е.В., Микрюкова Т.П., Кононова Ю.В., Коновалова С.Н., Тупота Н.Л., Карташов М.Ю., Чаусов Е.В., Локтев В.Б. // Возбудители инфекционных заболеваний в таежном клеще на территории Республики Коми // Дезинфекционное дело. - 2012. - № 1. - С. 52-56.
2. Коренберг Э.И., Помелова В.Г., Осин Н.С. При-родноочаговые инфекции, передающиеся иксодовыми клещами. - Москва: 2013. - 463 с.
3. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., Ястребов В.К., Леонова Г.Н., Хазова Т.Г., Егорова Н.В., Борисова О.Н., Прейдер В.П., Безруков Г.В., Федоров Е.Г., Фе-дянин А.П., Шерстнева М.Б., Турышев А.Г., Гаврилов
А.П., Танкибаев М.А., Тарасевич И.В., Fournier Р.Е., Raoult D. // Выявление новых генотипов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки на юге Урала, в Сибири, на Дальнем Востоке и в Казахстане // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2005. - № 1. - С. 23-27.
4. Fournier, P. et al., 2002. Genetic Identification of Rickettsiae Isolated from Ticks in Japan. 40(6), pp. 2176-2181.
5. Jia, N. et al., 2013. Rickettsia sibirica subspecies sibirica BJ-90 as a cause of human disease. The New England journal of medicine, 369(12), pp.1176-8.
6. Oteo, J. et al., 2012. Tick-borne rickettsioses in Europe. Ticks and tick-borne diseases, 3(5-6), pp.271-8.
Молекулярно-генетические исследования
7. Parola, Philippe, Paddock, C.D. & Raoult, Didier, 2005. Tick-Borne Rickettsioses around the World: Emerging Diseases Challenging Old Concepts. , 18(4), pp.719-756.
8. Roux, V. et al., 1997. Citrate synthase gene comparison, a new tool for phylogenetic analysis, and its
application for the rickettsiae. International journal of systematic bacteriology, 47(2), pp.252-61.
9. Shpynov S., Rudakov N., Fournier P.-E., Raoult D. 2003. «Candidatus Rickettsia Tarasevichiae» in Ixodes Persulcatus ticks collected in Russia. Annals of the New York Academy of Sciences, 990. p. 162-172.
Карташов Михаил Юрьевич - м.н.с. отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово.
Микрюкова тамара Петровна - канд. биол. наук, с.н.с., отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово.
Корабельников игорь Васильевич - генеральный директор, д.м.н. ФГУП «Дезинфекция», г. Сыктывкар. Егорова Юлия игоревна - н.с. Сыктывкарский государственный университет, г. Сыктывкар.
тупота наталья Леонидовна - канд. биол. наук, н.с. отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово.
терновой Владимир Александрович - канд. биол. наук, зав. лаб. отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово.
Протопопова елена Викторовна - канд. биол. наук, в.н.с. отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово.
Локтев Валерий Борисович - д-р биол. наук, зав. отделом молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово.
© Коллектив апвторов, 2014 Статья поступила в редакцию 14 октября 2014 г.
УДК 616.98:578.833.6
ПРОИСХОЖДЕНИЕ СУБТИПОВ ВКЭ КАК РЕЗУЛЬТАТ АДАПТАЦИИ К НОВОМУ ВИДУ ПЕРЕНОСЧИКА
С.Ю. Ковалев, Т.А. Мухачева Уральский федеральный университет им. первого Президента РФ Б.Н. Ельцина, г. Екатеринбург Россия, 620002, Екатеринбург, ул. Мира, 19. Тел.: +7 (343) 375-45-07; 375-46-09
В настоящее время существует несколько противоречащих друг другу гипотез эволюции ВКЭ, основанных на представлении о равномерном ходе молекулярных часов. В настоящей работе рассматривается альтернативная гипотеза, предполагающая формирование субтипов вируса в результате адаптивного скачка при смене ВКЭ вида основного переносчика - клеща. Анализ включал более тысячи последовательностей фрагмента гена Е и проводился на основе кластеронного подхода. Эволюция ВКЭ представляется как процесс последовательного возникновения одного субтипа из другого в результате чередования градуального и скачкообразного этапов и насчитывает не более 700 лет.
Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, эволюция, гипотеза.
