CC BY
475
АКТУАЛЬНАЯ ТЕМА
УДК: 636.2.082.453
Вспомогательные репродуктивные технологии в воспроизводстве крупного рогатого скота
Г.П. Дюльгер1, доктор ветеринарных наук ([email protected]), В.В. Храмцов1, доктор сельскохозяйственных наук, А.Г. Нежданов2, доктор ветеринарных наук ([email protected])
1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева» (Москва).
2 Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт патологии, фармакологии и терапии» (Воронеж).
В статье даны научные обоснования современных вспомогательных репродуктивных технологий, достижения и перспективы их применения в практике воспроизводства крупного рогатого скота. Эти технологии включают в себя сексирование спермы, преимплантационное определение «ядерного» пола зародыша, клонирование животных, получение химер и трансгенных животных.
Рис. 1. Схема сексирования спермы животных с применением метода проточной цитометрии и системы электростатической сепарации половых клеток (по P.J.H. Ball, A.R. Peters, 2004, в модификации авторов)
Ключевые слова: вспомогательные репродуктивные технологии, ВТР, клонирование животных, преимплантационное определение пола зародыша, сексиро-ванная сперма, трансгенные животные, химеры Сокращения: ДНК—дезоксирибонуклеиновая кислота, КРС — крупный рогатый скот, ПЦР — полимеразная цепная реакция, УФ — ультрафиолетовый, ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение
Успехи в области искусственного осеменения и трансплантации зародышей животных создали условия для развития и внедрения в клиническую практику новых вспомогательных репродуктивных технологий, таких как сексирование спермы, преимплантационное определение пола зародышей, репродуктивное клонирование, создание химер и трансгенных животных.
Сексирование спермы
Сексированная сперма—это сперма производителей, разделенная по «ядерному» полу (носительству Х или Y хромосомы). Начиная с 2000 г. сексированную сперму достаточно широко используют в практике воспроизводства КРС. Впервые теленок с применением свежеполученной сексиро-ванной спермы был получен 1997 г. [22], замороженно-от-таянной — в 1999 г., а теленок с использованием сексиро-ванных спермиев в процедуре ЭКО родился в 2006 г. [20].
Для сексирования спермы применяют лазерные высокоскоростные проточные цитометры, оборудованные системой для электростатической сортировки клеток.
Принцип метода проточной цитометрии основан на регистрации флюоресценции и светорассеивания от каждого отдельного спермия, предварительно окрашенного ДНК-специфическим витальным красителем (рис. 1). В проточной кварцевой кювете, за счет разницы давлений между анализируемым образцом спермы и обтекающей жидкостью, спер-мии вводятся в ламинарный поток (выстраиваются в цепочку один за другим) и пересекают сфокусированный лазерный луч. Высокочувствительные детекторы регистрируют флюоресценцию и рассеянное излучение (боковое и прямое) каждой половой клетки. Световые сигналы передаются в компьютер, где они усиливаются и преобразуются в электрические импульсы фотоумножительным устройством. Далее информация обрабатывается в цифровом режиме в виде гистограмм. По разности в интенсивности ДНК-флюоресценции (спермии быка, несущие У-хромосому, содержат на 3,8 % меньше ДНК, чем спер-
мии, несущие Х-хромосому) компьютер в режиме реального времени идентифицирует гоносому анализируемой половой клетки. Проходя сквозь заряжающее кольцо, капли, содержащие спермии с идентифицированными Х- или У- хромосомами, заряжаются положительно или отрицательно; капли, содержащие неи-дентифицированные по гоносомам спермии, дебрис, клетки крови или покровного эпителия мочеполовых путей, — остаются нейтральными (этот процесс контролируется компьютером). Проанализированные спермии пропускают через биметаллические пластины с разной полярностью (электростатический сепаратор). При прохождении между двумя электродами заряженные капли со спермиями (соответственно их заряду) отклоняются в правую или левую стороны и попадают в разные пробирки-коллекторы. Дрейф незаряженных капелек жидкости не меняется и, таким образом, не-идентифицированные половые и неполовые клетки также собираются в отдельную (среднюю) пробирку (коллектор отходов).
Сексирование спермы — процесс лицензированный и очень медленный. От быка-производителя получают два эякулята. После всесторонней и тщательной оценки качества полученного эякулята сперму разбавляют патентованной трисбуферной средой без желтка, содержащей антибиотики, добавляют ДНК-специфический витальный краситель и инкубируют при температуре 30 °С в течение 30.. .45 мин и более. Фотоцитометрический анализ спермы проводят при температуре 18 °С. Скорость сортировки половых клеток составляет примерно 10 млн живых спермиев в час (каждого пола). Суммарный выход сексированных спермиев из эякулята достигает 36 %, при чистоте отсортированной фракции 90 % [24].
Проходя через системы прибора, половые клетки подвергаются неблагоприятным воздействиям (лазерное излучение, перепады давления, витальное окрашивание и др.), что несколько снижает их жизнеспособность и оплодотворяющую эффективность на выходе, по сравнению с исходным материалом и несексированной спермой (примерно на 20%).
Просортированную сперму отмывают и центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, а концентрат спер-миев разбавляют искусственной средой. Состав искусственной среды зависит от способа и срока хранения спермы.
Просексированную сперму после разбавления и кратковременного хранения используют для искусственного осеменения самок КРС, ЭКО яйцеклеток, созревших в условиях in vivo или in vitro, либо замораживают в красных соломинках объемом 0,25 мл и кодируют. При кратковременном хранении сексированной спермы в одной спермодозе должно содержаться не менее 1 млн, при замораживании — 2 млн жизнеспособных спермиев.
Сексированную сперму рекомендуют использовать для осеменения клинически здоровых, физиологически зрелых телок. Эффективность искусственного осеменения при использовании отсортированной спермы у телок достигает примерно 45 %, у лактирующих молочных коров — 28 % [8]. При этом выход потомства желаемого пола при использовании Х-фракции сексированной спермы составляет 87,8 %, Y-фракции — 92,1 % [24].
Преимплантационная диагностика пола зародышей
Преимплантационное определение пола зародышей имеет важное практическое значение для репродукции как человека, так и животных [1, 2].
В практическом животноводстве, и в частности, мясном и молочном скотоводстве, селекция зародышей по полу в рамках коммерческих программ по трансплантации эмбрионов позволяет получать приплод предетермини-рованного пола. Например, в мясном скотоводстве экономически выгодно получать и откармливать на мясо бычков, а в молочном скотоводстве, наоборот, — избирательно получать и выращивать для ремонта молочного стада племенных телочек. Благодаря селекции эмбриона по «ядерному» полу удается почти в два раза сократить потребность в дорогостоящих реципиентах и тем самым существенно удешевить программы по пересадке эмбрионов [2].
В коммерческих программах по трансплантации зародышей КРС их селекцию по полу проводят посредством ПЦР, заключающейся в амплификации (многомиллионном увеличении числа копий) определенного
Биопсия эмбрионов (посредством микросекции или аспирации бластомеров)
, I \
Получение вытяжки ДНК из биопсированных бластомеров
I
Коамплификация сегмента ДНК, специфичного только для Y-хромосомы, и фрагмента ДНК контрольной аутосомальной хромосомы
I
Сепарация и идентификация полученных ПЦР-продуктов без применения
или с применением электорофореза в агарозном геле с бромидом этидия
Рис. 2. Основные этапы преимплантационной диагностики пола зародышей
участка ДНК в условиях in vitro с помощью ферментативного синтеза [21]. Технику ПЦР открыл в 1983 г. Кэрри Мюллис (Kary Mullis), за что был удостоен Нобелевской премии в области химии за 1993 г.
Определение пола основано на амплификации и идентификации фрагмента ДНК Y-хромосомы. Процедура исследования достаточно сложна, трудоемка и включает в себя следующие процессы: биопсию эмбриона; получение вытяжки ДНК; коамплификацию сегмента ДНК, специфичного только для Y-хромосомы и фрагмента ДНК контрольной аутосомальной хромосомы; сепарацию и идентификацию полученных ПЦР-продуктов на электрофорезе в агарозном геле с бромидом этидия (рис. 2).
Преимплантационную диагностику пола бычьих эмбрионов проводят на стадии морулы или бластоцисты. Для ПЦР-анализа достаточно получить методом микросекции или аспирации 2...10 бластомеров. Биопсия преимплан-тационных зародышей осуществляется под контролем инверсионного или стереомикроскопа с помощью одного или двух микроманипуляторов. Аспирация менее травматична, но технически более сложна и трудоемка, чем микросекция. К тому же при аспирации легче утратить клеточный материал для анализа. При наличии достаточного опыта посредством микросекции за один час можно провести биопсию примерно 15 зародышей [5].
В отличие от дисекции биопсия зародышей на стадии морулы и бластоцисты существенно не влияет на параметры их выживаемости в культуре клеток in vitro. Показатель выживаемости для интактных, биопсиро-ванных и разделенных на половинки эмбрионов при их культивировании в условиях in vitro в течение 24 ч составляет, соответственно, 92,3 %, 86,3 % и 77,5 % [15].
Для экстракции ДНК биопсированные бластомеры инкубируют в специальной среде, обладающей цитолитичес-кой активностью (например, содержащей протеинкина-зу К). Полученные экстракты ДНК переносят в реакционные пробирки. ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °С.
Реакция амплификации ДНК in vitro основана на способности молекул нуклеотидтрифосфатов в присутствии ДНК-полимеразы при соответствующих условиях (рН, ионная сила раствора, температура) образовывать на матрице (одноцепочной ДНК) комплементарную цепь. Избирательное копирование требуемых участков ДНК (Y-хромосомы и контрольной аутосомальной хромосомы) обеспечивается двумя парами праймеров. Каждый из пары праймеров комплементарен одной из цепей двухцепочной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка. После гибридизации матрицы с праймером, последний служит затравкой для ДНК полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.
Результаты ПЦР учитывают при помощи стандартного УФ-трансиллюминатора с использованием электрофореза в агарозном геле с бромидом этидия (элек-трофоретический метод) или непосредственно в реакционной пробирке (метод флюоресцентной детекции).
Продолжительность ПЦР-анализа составляет всего 1,5...2 ч [4, 23].
Успешность определения пола эмбрионов с помощью ПЦР зависит от техники биопсии и количества взятого для анализа клеточного материала, способа экстракции ДНК и методики исследования. Информативность метода (эффективность распознавания пола эмбрионов от числа исследованных образцов) достигает 90.95 % [4, 17], а точность определения пола — 92.100 % [15, 17, 23, 25]. При использовании для ПЦР-анализа цельных эмбрионов и полуэмбрионов эффективность и точность определения пола достигает 100 % [15, 25].
Для коммерческого определения пола бычьих эмбрионов на основе ПЦР и электрофореза разработаны тест-системы, например, с использованием двух пар праймеров для амплификации участка ДНК Y-хромо-сомы, состоящего из 1б5 пар оснований и фрагмента ДНК аутосомальной хромосомы размером 210 пар оснований (Alta Genetics Inc., Calgary, AB).
Хорошую перспективу для коммерциализации при определении «ядерного» пола преимплантационных зародышей имеет также тест-система Ampli-YTM, позволяющая учитывать результаты ПЦР непосредственно в реакционной пробирке при помощи ДНК-специфического красителя бромида этидия. Для регистрации реакции также применяют стандартный УФ-трансиллюминатор. При положительном результате — амплификации сегмента Y-хро-мосомы — в реакционной пробирке отмечают эффект розового свечения, при отрицательном флюоресценция отсутствует. Недостаток тест-системы: анализ проводится без контрольной аутосомальной хромосомы. Тем не менее, на большом материале показано, что точность определения пола при использовании данной тест-системы составляет 95 % [13]. Эмбрионы с гетерогенным (мужским) «ядерным» полом диагностируются точнее, чем зародыши с гомогенным (женским): 98,7 % против 94,4 % [13].
Приживляемость биопсированных эмбрионов при нехирургическом способе их пересадки достигает 53.71 % [5, 13, 23]. При комбинации биопсии с замораживанием и оттаиванием эмбрионов она в среднем составляет 49,8 % [13] с колебаниями от 37 до бб % [23].
Репродуктивное клонирование
В современной биотехнологии и репродуктологии термин «клонирование» обозначает процесс получения биологической копии другого организма, обладающей абсолютно идентичной наследственностью. Разработаны две технологии клонирования организмов млекопитающих: а) путем переноса ядра неполовых (соматических) клеток донора (взрослого животного или зародыша) в лишенную ядра (энуклеированную) яйцеклетку реципиента; б) посредством разделения, или сплиттинга, эмбриона на две половинки.
Эру репродуктивного клонирования открыли работы Роберта Бриггса (Rober Briggs) и Томаса Кинга (Thomas J. King), которым в 1952 г. удалось методом переноса ядра недифференцированной эмбриональной клетки в энук-леированную (лишенную ядра) зрелую яйцеклетку клонировать 27 головастиков северной лягушки леопард.
Основные достижения в области клонирования эмбрионов и взрослых сельскохозяйственных и домашних животных
1984 г. — Steen Willadsen из ядра бластомера 8-клеточного зародыша клонировал овцу;
1987 г. — Neal First, Randal Prather и Willard Eyestone из эмбриональных клеток клонировали двух телят (по кличке Fusion and Copy);
1996 г. — Ian Wilmut и Keith Campbell впервые из донорской соматической клетки взрослого животного клонировали всемирно известную овцу Долли;
2000 г. — Julie Grisham сообщил о клонировании 5 поросят (по кличке Millie, Christa, Alexis, Carrel, Dotcom) из соматической клетки взрослой свиньи;
2001 г. — Mark Westhusin, Taeyoung Shin впервые клонировали кошку; в 2004 г. в США по коммерческому заказу получили клон 19-летней кошки породы мейнкун (по кличке Litlle Nicky); 2003 г. — C. Galli et al. впервые получили клон мула и лошади; 2005 г. — B.C. Lee et al. получили клон собаки по кличке Snappy от кобеля породы афган;
2009 г. — Richard Spencer сообщил о клонировании в Саудовской Аравии верблюда;
2012 г. — Riaz Ahmad Shah et al. клонировали в Индии козу пуховой породы.
Прикладное значение технологии клонирования заключается в возможности получения многочисленных генетически идентичных копий высокопродуктивных и трансгенных сельскохозяйственных животных.
Технология клонирования организмов млекопитающих сложна, трудо- и наукоемка и включает в себя проведение следующих деликатных манипуляций: получение, культивирование и отбор донорских соматических клеток и синхронизация их клеточного цикла (G0); получение, культивирование и отбор созревших в условиях in vitro (лучше in vivo) донорских ооцитов в фазе MII мейоза; удаление из ооцита полярного тельца и метафазной пластинки (энуклеация), окрашенных витальными красителями; подсадка ядра соматической клетки в ооплазму ооцита; слияние ооцита и соматической клетки с помощью электропорации (электрослияния) либо путем прямой микроинъекции ядра в ооплазму ооцита; химическая активация дробления яйцеклетки в среде, содержащей иономицин/циклогекси-мид или иономицин/6-диметиламинопурин; культивирование эмбриона in vitro до стадии бластоцисты; подсадка клонированного эмбриона гормонально синхронизированному реципиенту (рис. 3).
Источником соматических клеток могут служить эпителиоциты молочных желез, яйценосного бугорка, маточных труб и матки, клетки (в основном фиб-робласты) кожи взрослых и новорожденных животных, дифференцированные и недифференцированные эмбриональные клетки; незрелых ооцитов — яичники коров, полученные вскоре после их убоя.
Приживляемость, или эффективность пересадки, клонированных эмбрионов КРС составляет примерно 50 %. Репродуктивные потери при вынашивании клонированных эмбрионов и плодов очень велики. После успешной подсадки клонированных эмбрионов вынашивается и заканчивается физиологическими родами только 5,6 % беременностей. Тем не менее, с использованием технологии переноса ядра соматической клет-
Животное — донор ядер соматических клеток
3 G
Животное — донор яйцеклеток
Получение клеток, их отбор культивирование и выравнивание клеточного цикла
, Получение,отбор,
ние культивирование
и энуклеация ооцитов
Перенос ядра соматической клетки в лишенный ядра ооцит (электропортация)
, г t
Химическая активация дробления реконструированного зародыша
, г ^
Культивирование зародыша в условиях in vitro до стадии морулы/бластоцисты
I -
Пересадка зародыша самке-реципиенту
( Роды )
Рис. 3. Схема репродуктивного клонирования животных посредством переноса ядра соматической клетки в лишенную ядра зрелую яйцеклетку
ки в лишенную ядра зрелую яйцеклетку уже клонировано около 1,5 тыс. телят [18].
Итоговая эффективность метода — от этапа реконструирования ооцитов до рождения клона — составляет примерно 1...2 %.
Эмбриональный сплиттинг, или разделение зародышей
Эмбриональный сплиттинг на ранних стадиях развития (с помощью микрохирургии) впервые был разработан и успешно апробирован на овцах датчанином Сти-ном Вилладсеном (Steen Willadsen) в 1979 r.
Сущность метода заключается в следующем. Зародыша на стадии развития в 60 клеток с помощью микроманипулятора и микроножа делят на две половинки, которые помещают для дальнейшего развития в половые органы животного-реципиента. В результате данной операции получают двух генетически идентичных животных. Этот метод позволяет получить не только идентичных близнецов, но и преимплантационно определять пол зародышей.
В середине 80-х гг. прошлого столетия началось коммерческое применение этого метода в скотоводстве. Приживляемость «полуэмбрионов» составляет 50,2 %. В период с 1982 по 2006 гг. с применением метода эмбрионального сплиттинга только в США было получено 2664 теленка [14].
Создание химер
В современной биотехнологии термином «химеры» обозначают организмы, состоящие из генетически разнородных тканей, принадлежащих разным индивидуумам. Впервые термин ввел в 1907 г. немецкий ботаник Ганс Винклер (Hans Winkler, 1877.1945), назвав химерами растения, полученные в результате прививки паслена на черенок томата.
Технология получения межвидовых химерных организмов млекопитающих разработали в 1984 г. ученые Кэмбриджского университета — C.B. Fehilly, S.M. Willadsen, E.M. Tucker. Для создания химерного существа (особи) на 6-е и 7-е сутки после оплодотворения от овец и коз авторы хирургическим путем вымывали бластоцисты. После ферментативного удаления прозрачной оболочки внутреннюю клеточную массу из бластоцист коз при помощи микроманипулятора они
вводили в бластоцисты овец. После подсадки 22 блас-тоцист 12 овцам-донорам от 9 из них получили приплод: 9 ягнят, одного козленка и два межвидовых химера. Химерные овце-козы на разных участках тела имели разный шерстный покров.
Получать химерные зародыши, пригодные для пересадки, можно также путем агрегации (слияния) под одной прозрачной оболочкой двух полуэмбрионов от разных родителей. По этой технологии созданы межпородные и межвидовые химеры КРС. В работе T.J. Williams et al. (1990) после пересадки 112 химерных эмбрионов (Bos indicus х Bos taurus) развитие беременности диагностировали у 29 реципиентов, или 26 %. У 24, или 83 %, из них беременность закончилась физиологическими родами, у 5, или 17 %, — абортом. При этом две коровы принесли по два теленка, 22 — по одному. При родах одним плодом в 15 случаях родились химеры.
В 1997 г. в экспериментальном хозяйстве ВИЖ родился бычок Ералаш, родителями которого стали 4 донора: две коровы айрширской и черно-пестрой породы и два быка красной голштино-фризской и голландской черно-пестрой пород. Вымытые из двух стельных коров эмбрионы были разделены на половинки, после чего пересажены в эмбрион, из которого удалили все содержимое. После пересадки эмбриона родился бычок- химер бело-красно-чёрной окраски.
Получение трансгенных животных
Трансгенные животные — это экспериментально полученные животные, содержащие во всех клетках своего организма дополнительную, интегрированную с хромосомами и экспрессирующуюся чужеродную ДНК (транс-ген), которая передается по наследству по законам Менделя. Искусственный перенос генов из одной биологической системы в другую с целью получения трансгенных организмов называют трансгенозом.
Первые трансгенные животные были получены в 1974 г. Рудольфом Янишем (Rudolf Jaenisch) в результате инъекции в эмбрион мыши ДНК вируса обезьяны SV40. В России в 1987 г. академик Л.К. Эрнст и соавторы сообщили о рождении трансгенных кроликов, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека.
В настоящее время для переноса и встраивания генов одних организмов в клетки организмов других видов применяют следующие методики: опосредованный ретровирусами перенос генов; метод микроинъекции ДНК; перенос трансформированных ядер генеративных и соматических клеток; использование спермиев и спер-миогониев как переносчиков ДНК.
Метод микроинъекций ДНК в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки является основным. Его разработали американские исследователи — J.W. Gordon et al. (1980). Первые трансгенные кролики, овцы и свиньи с применением данной методики были получены в 1985 г. [12], коровы — в 1998 г. [7].
Технология получения трансгенных животных с использованием метода микроинъекции ДНК в пронук-леус зиготы включает в себя следующие процессы: конструирование трансгена; отбор, подбор и спаривание родительских пар; получение и отбор зигот, содержащих пронуклеусы; микроинъекцию ДНК (транс-
гена) в мужской пронуклеус (по размеру он больше и поэтому легче визуализируется, чем женский); культивирование реконструированных зигот в условиях in vitro до стадии преимплантационных зародышей; подсадку зародышей в половые органы самок-реципиентов для их дальнейшего вынашивания; диагностику беременности и мониторинг ее течения; роды, получение приплода, идентификацию особей, экспресирующих транс-ген, и их выращивание (рис. 4).
В своей работе W.H. Eyestone (1999) сообщает, что после процедуры микроинъекции ДНК в мужской пронуклеус только 6,3 % зигот КРС (2300/36500) при культивировании в лабораторных условиях развились до стадии бластоцисты. После нехирургической пересадки 1472 преимплантационных зародышей 1324 самкам-реципиентам автор диагностировал развитие беременности у 28 % из них. Сохранность развившейся стельности составила 60 %. От коров с выношенной беременностью в общей сложности было получено 226 телят, из которых только 18, или 7,96 % экспрессировали трансген (ген человеческого альфа-лактальбумина).
Итоговая эффективность трансгеноза очень низка: от этапа микроинъекции ДНК в пронуклеус зиготы до получения жизнеспособной особи, экспрессирую-щей трансген, она не превышает 1 %.
Трансгеноз — одна из самых дорогостоящих вспомогательных репродуктивных технологий. Подсчитано, что расходы на получение одной трансгенной мыши достигают в среднем 121 доллара США, одной свиньи — 25 тыс., овцы — 60 тыс., коровы — 546 тыс. долларов США [26].
Приведенная характеристика существующих методов вспомогательной репродуктивной технологии свидетельствует о достаточно высокой эффективности и перспективности применения в практике воспроизводства КРС сексированной спермы и эмбрионов, а также необходимости дальнейшего изучения и совершенствования таких технологий, как репродуктивное клонирование, получение трансгенных животных.
Библиография
1. Дюльгер, Г.П. Преимплантационная диагностика пола эмбрионов крупного рогатого скота: учеб. пособие /. М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2010. — 22 с.
2. Дюльгер, Г.П. Преимплантационная диагностика пола эмбрионов крупного рогатого скота. Определение пола зародышей методом ПЦР- и FISH-анализов / Г.П. Дюльгер, П.Г. Дюльгер // Ветеринария сельскохозяйственных животных. — 2010. — №5. — С. 43-47.
3. Эрнст, Л.К. Получение трансгенных кроликов, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита B человека / Л.К. Эрнст, Г.П. Георгиев, Г.Н. Ениколопов, М.И. Прокофьев, В.И. Захарченко, Г.Г. Секирина // Вестник с.-х. науки. — 1987. — №9. — С. 68-73.
4. Bredbacka, P. Recent developments in embryo sexing and its feld application / P. Bredbacka // Reprod. Nutr. Dev. — 1998. — V. 38. — P. 605-613.
5. Bredbaska P. Progress on methods of gene detection in preimplantation embryos / P. Bredbacka // Theriogenology. — 2001. — V.55. — P. 23-34.
6. Briggs, R. Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frog's eggs / R. Briggs, T.J. King // Zoology. — 1952. — V. 38. — P. 455-463.
7. Cibelli, J.B. Transgenic bovine chimeric offspring produced from somatic cell-derived stem like cells / J.B. Cibelli, S.L. Stice, P.L. Golueke et al. // Nat. Biotechnol. — 1998. — V.16. — P. 642-646.
8. De Vries A. Exploring the impact of sexed semen on the structure of the dairy industry/ De A.Vries, M. Overton, J. Fetrow J. et al. // J. Dairy Sci. — 2008. — V. 91. — P. 847-856.
9. Eyestone, W.H. Production and breeding of transgenic cattle using in vitro embryo production technology / W.H. Eyestone // Theriogenology. — 1999. — V. 51. — P. 509-517.
10. Fehilly, C.B. Interspesific chimerism between sheep and goat / C.B. Fehilly, S.M. Willadsen, E.M. Turcker // Nature. — 1984. — V. 307. — P. 16-22.
11. Gordon, J.W. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of puried DNA / J.W. Gordon, G.A. Scangos, D.J. Plotkin et al. // Proc . Natl. Acad. Sci. USA. — 1980. — V. 77. — P. 7380-7384.
12. Hammer, R.E. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection/ R.E. Hammer, V.G. Pursel, C.E. Rexroad et al. // Nature. — 1985. — V. 315. — P. 680-683.
Конструирование трансгена
Отбор, подбор и спаривание родительских пар
, Т
Получение и отбор зигот с пронуклеусами
, г n
Микроинъекция ДНК (трансгена) в мужской пронуклеус
Г '
Культивирование реконструированных зигот в условиях in vitro до стадии преимплантационных зародышей
I
Подсадка зародышей в половые органы самок-реципиентов для их дальнейшего вынашивания
, i / Диагностика беременности, роды, получение приплода
, I ^
Идентификация особей, экспрессирующих трансген и их выращивание
Рис. 4. Схема получения трансгенных животных посредством микроинъекции ДНК в пронуклеус зиготы
13. Hasler, J.F. Non-electrophoretlc PCR-sexing of bovine embryos in a commercial environment / J.F. Hasler, E. Cardey, J.E. Stokes, P. Bredbaska // Theriogenology. — 2002. — V. 58. — P. 1457-1469.
14. Hasler J.F. Embryo Transfer and In Vitro Fertilization. In Comparative Reproductive Biology / J.F. Hasler. — Ed. by H. Schatten, Gh. M. Constantinescu, 2007. — P. 171-211.
15. Itagaki, Y. Sexing of bovine embryos with malt-specific repetetives DNA by polymerase chain reaction sexing of bovine embryos and the production of calves with predicted sex/ Y. Itagaki, S. Sato, Y. Shitanaka et al. // J. Reprod. Devel. — 1993. — V. 39. — P. 65-72.
16. Jaenisch, R. Infection of mouse blastocysts with SV 40 DNA: normal development of infected embryos and persistence SV 40-specific DNA sequences in the adult animals / R. Jaenisch // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. — 1974. — V. 39. — P. 375-380.
17. Kameyama, K. Direct transfer of bovine frozen-thawed embryos sexed with a rapid Y-chromosome detection assay/ K. Kameyama, T. Numabe, F. Sekizawa et al. // Theriogenology. —
1996. — V. 45. — P. 227.
18. Lai, L. Animal Cloning. In Comparative Reproductive Biology. / L. Lai, R.S. Prather. — Ed. by H. Schatten, Gh. M. Constantinescu, 2007. — P. 237-262.
19. Puglisi, R. In vitro fertilization with frozen-thawed bovine sperm sexed by flow cytometry and validated for accuracy by realtime PCR / R. Puglisi, R. Vanni, A. Galli et al. // Reproduction. — 2006. — V. 132. — P. 519-526.
20. Saiki, R.K. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase / R.K. Saiki, D.H. Gelfand, S. Stoffel et al. // Science. — 1988. — V. 239. — P. 487-491.
21. Seidel, G.E.Jr. Uterine horn insemination of heifers with very low numbers of nonfrozen and sexed spermatozoa / G.E.Jr. Seidel, Allen C.H., Johnson L.A. et al. // Theriogenology. —
1997. — V. 48. — P. 1255-1264.
22. Shea, B.F. Determining the sex of bovine embryos using polymerase chain reaction results: a six-year retrospective study / B.F. Shea // Theriogenology. — 1999. — V. 51. — P. 841-854.
23. Tubman, L.M. Characteristics of calves produced with sperm sexed by flow cytometry cell sorting / L.M. Tubman, Z. Brink, Suh T.K., Seidel, G.E. // J. Anim. Sci. — 2004. — V. 82. — P. 1029-1036.
24. Utsumi, K. Sexing of bovine embryos by polymerase chain reaction using Y-specific DNA as primer / K. Utsumi, T. Kawamoto, J.H. Kim, H. Takeda, A. Iritani // Proc. 12th Intern. Congr. on Anim. Reprod., 1992. — P. 757-759.
25. Wall, R.J. Making transgenic livestock: genetic engineering on a large scale / R.J. Wall, H.W. Hawk, N. Nel // J. Cell. Biochem. — 1992. — V. 49. — P.113-120.
26. Willadsen S.M. Nuclear transplantation in sheep embryos / S.M. Willadsen // Nature. — 1986. — V. 320. — P. 63-65.
27. Willadsen, S.M. A method for culture of micromanipulated sheep embryos and its use to produce monozygotic twins / S.M. Willadsen // Nature. — 1979. — V. 277. — P. 298-300.
28. Williams, T.J. Production of interspecies chimeric calves by aggregation of Bos taurus and Bos indicus demi-embryos / T.J. Williams, R.K. Munro, J.N. Shelton // Reprod. Fertil. Dev. — 1990. — V. 2. — N.4. — P. 385.
SUMMARY
G.P. Dyulger1, V.V. Khramtsov1, A.G. Nezhdanov2
1 Russian State University of Agriculture — MAA named after K.A. Timiryazev (Moscow).
2 All-Russian Research Veterinary Institute of Pathology, Pharmacology and Therapy
(Voronezh).
Assisted Reproductive Techniques in Breeding of Cattle.
The scientific basis, achievements and perspective to use of assisted reproductive techniques in cattle breeding are described in this article. These include using sexed sperm and embryos, animal cloning, creating chimeras and transgenic animals.
