Научная статья на тему 'Врожденная дисфункция коры надпочечников: поиск мутаций в гене CYP21A2'

Врожденная дисфункция коры надпочечников: поиск мутаций в гене CYP21A2 Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

CC BY
4692
203
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ГЕН / 21-ГИДРОКСИЛАЗА / ВРОЖДЕННАЯ ДИСФУНКЦИЯ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ / МУТАЦИЯ / GENE / 21-HYDROXYLASE / CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA / MUTATION

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Рахимкулова А. А., Ахметова В. Л., Малиевский О. А., Хуснутдинова Э. К.

Мутации в гене CYP21A2, кодирующем фермент 21-гидроксилаза, являются причиной развития одного из наиболее распространенных наследственных заболеваний, врожденной дисфункции коры надпочечников (ВДКН). Более 90% случаев данного заболевания связано с нарушениями функционирования данного фермента. Уровень остаточной активности 21-гидроксилазы определят клиническую форму и тяжесть течения заболевания. Нами проведен анализ гена CYP21A2 у 120 больных ВДКН, проживающих на территории Республики Башкортостан (РБ), в результате которого определен спектр мутаций, характерный для данного региона, и установлено соответствие выявленных мутаций клиническим формам, что в некоторой степени позволяет расширить представление о молекулярно-генетических механизмах развития такого гетерогенного заболевания как ВДКН.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по клинической медицине , автор научной работы — Рахимкулова А. А., Ахметова В. Л., Малиевский О. А., Хуснутдинова Э. К.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA: IDENTIFICATION OF CYP21A2 MUTANT ALLELES

Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is common hereditary disorder consisting of a group of autosomal recessive diseases caused by congenital defects of corticosteroid biosynthesis enzymes. More than 90% of all CAH cases are caused by 21-hydroxylase deficiency, which is characterized by considerable heterogeneity of clinical manifestations and diagnostic complexity. Because of the high deficiency and relevance of medical and social problems of CAH, it was included in the program of neonatal screening in many countries around the world. We analyzed CYP21A2 gene, which encodes the enzyme steroid 21-hydroxylase, in 120 unrelated CAH patients from Bashkortostan Republic (RB). Mutations of the CYP21A2 gene were revealed in 73% of the studied CAH-chromosomes. Here, we report mutations specific for the population of RB. The mutations delA2orLGC, p.R356W, I2splice, p.I172N, p.Q318X, p.V281L, p.P30L, p.P453S, p.R426C, p.Ile384del, p.L307fs were described in this report. Moreover, the analysis of CYP21A2 gene detected many polymorphic variants (rs6449, rs6463, rs2075561, rs6462, S374S, rs6474, rs6455, rs6463, rs6472). Our data are useful for understanding of molecular-genetic base of CAH. This article provides a brief overview of the current state of knowledge of the pathogenesis and molecular genetic basis of CAH. Thus, studying of molecular-genetic nature of CAH represents the doubtless scientific and practical importance in respect of use of the received data for differential diagnostics of its various forms, medical and genetic consultation and prenatal diagnostics.

Текст научной работы на тему «Врожденная дисфункция коры надпочечников: поиск мутаций в гене CYP21A2»

УДК 61:575

ВРОЖДЕННАЯ ДИСФУНКЦИЯ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ: ПОИСК МУТАЦИЙ В ГЕНЕ CYP21A2

© А. А. Рахимкулова1*, В. Л. Ахметова1, О. А. Малиевский2, Э. К. Хуснутдинова1'3

1 Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.

Тел.: +7 (347) 235 60 88. 2Башкирский государственный медицинский университет Россия, Республика Башкортостан, 450000 г. Уфа, ул. Ленина, 3.

Тел.: +7 (347) 272 11 60.

3Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

Тел.: +7 (34 7) 272 63 70.

E-mail: rahimkulova.aigul@mail.ru

Мутации в гене CYP21A2, кодирующем фермент 21-гидроксилаза, являются причиной развития одного из наиболее распространенных наследственных заболеваний, врожденной дисфункции коры надпочечников (ВДКН). Более 90% случаев данного заболевания связано с нарушениями функционирования данного фермента. Уровень остаточной активности 21-гидроксилазы определят клиническую форму и тяжесть течения заболевания. Нами проведен анализ гена CYP21A2 у 120 больных ВДКН, проживающих на территории Республики Башкортостан (РБ), в результате которого определен спектр мутаций, характерный для данного региона, и установлено соответствие выявленных мутаций клиническим формам, что в некоторой степени позволяет расширить представление о молекулярно-генетических механизмах развития такого гетерогенного заболевания как ВДКН.

Ключевые слова: ген, 21-гидроксилаза, врожденная дисфункция коры надпочечников, мутация.

Введение

Врожденная дисфункция коры надпочечников — группа заболеваний с аутосомно-рецессивным типом наследования, обусловленных врожденным дефектом ферментов биосинтеза кортикостероидов [1, 2]. Более 90% случаев ВДКН связано с возникновением мутаций в гене CYP21A2, кодирующем 21-гидроксилазу. Классическая форма ВДКН характеризуется полной или частичной потерей функциональной активности данного фермента, что в первом случае приводит к развитию сольтеряю-щей формы (СТФ), а во втором — простой вириль-ной (ПФ). Частота встречаемости классической формы ВДКН в мире составляет в среднем 1:15000—16000 новорожденных, в России — 1:8662, в Республике Башкортостан — 1:8974 [3, 4]. При неклассической форме (НФ) остаточная активность 21-гидроксилазы составляет 20—60%, а частота в среднем составляет 1:1000 новорожденных [1].

Ген CYP21A2 локализован на коротком плече 6 хромосомы на расстоянии в 30 кЬ от высокогомологичной ему последовательности псевдогена CYP21A1P, неактивного вследствие присутствия в нем 15 мутаций. На сегодняшний день в гене CYP21A2 идентифицировано около 200 мутаций, более 90% из которых являются результатом межгенных рекомбинаций между функциональным геном CYP21A2 и псевдогеном CYP121A1P, при этом список описываемых нарушений гена 21-гидроксилазы непрерывно обновляется [5].

В связи с этим цель настоящей работы заключалась в анализе гена CYP21A2 у больных ВДКН из Республики Башкортостан, определение спектра мутаций, характерных для данного региона и сопоставление идентифицированных мутаций с клиническими формами заболевания.

Материалы и методы

Молекулярно-генетический анализ гена CYP21A2 был проведен у 120 больных ВДКН, состоящих на учете в отделении эндокринологии Республиканской детской клинической больницы г. Уфы и проживающих на территории Республики Башкортостан. Из них 63 больных имели сольтеряющую форму (52.5%), 46 - простую вирильную форму (37.5%), 12 - неклассическую форму ВДКН (10%).

Геномная ДНК больных ВДКН и членов их семей была выделена из лейкоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции [6].

Наиболее распространенные мутации гена CYP21A2: delA2/LGC, p.Pro30Leu, трЫсе, p.Ile172Asn, ClusterE6, p.Val281Leu, p.Gln318X, p.Arg356Trp и Pro453Ser, идентифицировались путем проведения ПЦР различной модификации с последующим, при необходимости, ПДРФ- анализом. В случае отсутствия у больного распространенных и легко диагностируемых мутаций проводился анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP-анализ), по результатам которого осуществлялось секвенирование. Высокая гомология CYP21A2 и CYP21A1P и присутствие в

* автор, ответственный за переписку

1040

БИОЛОГИЯ

псевдогене исследуемых в активном гене точковых мутаций препятствует проведению анализа гена CYP21A2 путем прямого использования геномной ДНК больных с диагнозом ВДКН и соответствующих праймеров. Однако существующие различия в последовательностях псевдогена и активного гена позволяют получить фрагмент последнего с помощью ПЦР с использованием CYP21A2 специфичных праймеров: BF1 CCCAGGTGGGGGCGGACACTA) и 21BR AATTAAGCCTCAATCCTCTGCAGCG) [7]. Дальнейший анализ осуществлялся с использованием амплификата активного гена.

Результаты и обсуждение

В результате проведенного анализа выявлено 11 мутаций гена CYP21A2. Наиболее распространенной мутацией оказалась делеция/конверсия delA2/LGC, обнаруженная на 29.16% хромосом. Частота данных мутаций в РБ соответствует таковой в европейских странах. Так, во Франции она составляет 25%, Германии — 27.4%, Италии — 26, Нидерландах - 31.9% [8]. Нами данная мутация обнаружена у 35 больных с СТФ, из них у 18 в гомозиготном состоянии, и 14 больных с ПФ заболевания, но только в компаунд-гетерозиготном состоянии с другой мутацией.

Вторая по частоте мутация сплайсинга I2splice (а293-А/0^) гена CYP21A2 определена на 14.58% хромосом, что несколько ниже, чем в популяциях Европы [8]. Согласно данным литературы большинство гомозиготных носителей данной мутации имеют СТФ ВДКН [5], что соответствует полученным нами данным: все 7 больных с мутацией сплайсинга в гомозиготном состоянии имеют СТФ заболевания.

Замена аргинина на триптофан в 356 положении (р.А^356Тгр) выявлена у 22 больных с СТФ, 5 больных с ПФ и 1 больного с НФ ВДКН, что составляет 11.7% и превышает среднюю частоту данной мутации в странах Европы в 1.5-2 раза [8].

Мутация p.Ile172Asn гена CYP21A2 идентифицирована у 1 больного с СТФ заболевания, но в кластере с мутацией p.Gln318X и 12 больных (5%) с ПФ ВДКН, что соответствует литературным данным, согласно которым данная мутации ассоциирована с ПФ заболевания.

У 7 больных с СТФ и 1 больного с НФ ВДКН и только в компануд-гетерозиготном состоянии с другими мутациями нами обнаружена мутация p.Gln318X. В целом, частота данной мутации в РБ (3.3%) сопоставима с европейской, которая варьирует от 2 до 5.9% [8].

Мутация р. Уа128^еи гена CYP21A2 ассоциирована, как правило, с НФ ВДКН. В РБ данная мутация определена только у больных с НФ заболевания с частотой 2.1%.

Также у больных с НФ ВДКН встречается мутация p.Pro30Leu гена CYP21A2. Нами данная му-

тация была обнаружена у 3 больных с ПФ заболевания (1.7%), причем у одного в гомозиготном состоянии.

Кроме того, посредством SSCP-анализа и последующего секвенирования образцов с измененной подвижностью однонитевых фрагментов у 4 больных идентифицировано 4 мутации: deШe384, F307+1nt, pArgR426Cys и p.Pro453Ser. Ранее неописанная мутация deШe384 идентифицирована у 1 больного с СТФ 21-гидроксилазной недостаточности в компаунд-гетерозиготном состоянии с delA2/LGC. Инсерция тимина в 1762 положении F307+1nt также обнаружена у одного больного (0.4%), но в сочетании с мутацией 1172Ы, что привело к развитию ПФ ВДКН. Мутация p.ArgR426Cys гена CYP21A2 была выявлена у одного больного с СТФ заболевания в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией I2splice (0.4%). Замена пролина на серин в 453 положении, p.Pro453Ser, обнаружена у 1 больного с ПФ ВДКН в кластере с мутацией I2splice (P453S+I2splice (0.4%)). Помимо описанного кластера, в гене CYP21A2 выявлено присутствие двух мутаций на одной хромосоме еще у 7 больных: p.Arg356Trp+p.Gln318X (2.1%), de-lA2/LGC+p. Val281Leu (0.4%), p.Ile172Asn+ p.Gln318X (0.4%). Такое сцепление мутаций или кластер унаследован больным либо от матери, либо от отца. Кластеризация мутаций на одной хромосоме внутри нуклеотидной последовательности гена характерна для гена CYP21A2, что возможно, связано с большими генными конверсиями или многократными мутационными событиями.

Анализ распределения частот мутаций в гене CYP21A2 в трех группах пациентов с разными формами заболевания показал статистически значимые отличия. Так, у больных с СТФ делеция/конверсия delA2/LGC гена CYP21A2 выявлена с частотой в 2.4 раза большей, чем у больных с ПФ (41.3% и 17.2%, соответственно, х = 13.7, р = 0.002) и с НФ недостаточности 21-гидроксилазы (41.3% и 17.5%, соответственно, X2 = 6.0, р = 0.007). Мутации I2splice, R356W и Q318X также встречались с более высокой частотой в группе больных с СТФ, чем с ПФ и НФ (23.0%, 9.4% и 0.0%, соответственно, X = 6.4, р = 0.006; 18.3%, 8.3% и 4.2%, соответственно, X = 2.9, р = 0.047 и х2 = 1.6, р = 0.101; 7.5%, 0.6% и 4.2%, соответственно, X = 18, р = 0.091 и X = 0.05, р = 0.414, соответственно). Напротив, мутация П72Ы была характерна для группы больных с ПФ, тогда как в группе с СТФ заболевания она определена в кластере с делецией/конверсией delA2/LGC, а у больных с НФ не идентифицирована (13.3%, 0.4% и 0.0%, соответственно, X = 12.07, р = 0.001). Мутация V281L гена CYP21A2 выявлена только у больных с НФ (20.8%), за исключением одного больного с ПФ, у которого она обнаружена в кластере с делецией/конверсией delA2/LGC (0.6%). Мутация P30L гена CYP21A2 идентифицирована

только у больных с ПФ (3.3%). Таким образом, для сольтеряющей, простой вирильной и неклассической форм недостаточности 21-гидроксилазы показан свой спектр диагностически значимых мутаций.

Помимо мутаций, приводящих к развитию тех или иных форм ВДКН, в гене CYP21A2 выявлено множество полиморфных вариантов, несущих нейтральный характер и фенотипически не проявляющихся (га6449, ^6463, ^2075561, ^6462, S374S, rs6474, rs6455, rs6463, rs6472). С наибольшей частотой определены полиморфные варианты rs6449 (38.7%), га6462 (65.3%), га6474 (56.7%), S374S (17.7%).

Проведенное нами молекулярно-генетическое обследование 120 семей с ВДКН, проживающих в Республике Башкортостан, показало, что 66% изученных ВДКН семей оказались полностью информативными для ДНК-диагностики прямым методом, 14% - частично информативными. 20% семей с ВДКН из РБ - абсолютно неинформативными. Во всех семьях при использовании прямых методов молекулярной диагностики были определены носители мутантных хромосом.

Таким образом, полученные данные представляют научную и практическую значимость для медико-генетического консультирования с целью повышения эффективности молекулярно-генетичес-

кой диагностики ВДКН в РБ в связи с ее высокой

распространенностью в данном регионе и профилактики рождения больных детей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Haider S. et al. Structure-phenotype correlations of human CYP21A2 mutations in congenital adrenal hyperplasia // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2013. Т. 110. №7. С. 2605-2610.

2. Lee H. H. CYP21 mutations and congenital adrenal hyperplasia // Clinical genetics. 2001. Т. 59. №5. С. 293-301.

3. Nimkarn S., Lin-Su K., New M. I. Steroid 21 hydroxylase deficiency congenital adrenal hyperplasia // Endocrinology & Metabolism Clinics of North America. 2009. Т. 38. №4. С. 699-718.

4. Рамова З. Ф. Распространенность и клинико-диагностическая характеристика гипокортицизма у детей в Республике Башкортостан //Автореф. дисс. канд. мед. наук. Уфа. 2010.

5. White P. C., Speiser P. W. Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency // Endocrine reviews. 2000. Т. 21. №3. С. 245-291.

6. Mathew C. G. The isolation of high molecular weight euka-ryotic DNA // Methods in molecular biology / Ed. Walker J. M. N. Y.; Humana press. 1984. P. 31-34.

7. Charfeddine I. B. et al. Steroid 21-hydroxylase gene mutational spectrum in 50 Tunisian patients: Characterization of three novel polymorphisms // Gene. 2012.

8. Ba§ F. et al. CYP21A2 Gene Mutations in Congenital Adrenal Hyperplasia: Genotype-phenotype correlation in Turkish children // Journal of clinical research in pediatric endocrinology. 2009. Т. 1. №3. С. 116.

Поступила в редакцию 10.09.2013 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.