Орипнальна стаття = Original article = Оригинальная статья
Ukr Neurosurg J. 2020;26(4):26-34 doi: 10.25305/unj.209837
Вплив збагаченого тромбоцитами фiбринового матриксу в комплекс 3i штучним матерiалом Nubiplant на експресiю хондрогенних маркерних гежв та морфогенез клiтин пульпозного ядра мiжхребцевих дискiв щурiв
Педаченко е.Г.1, Васильева 1.Г.2, Хижняк М.В.1, Чопик Н.Г.2, Олексенко Н.П.2, Шуба 1.М.2, Цюбко О.1.2, Галанта О.С.2, Дмитренко А.Б.2, Макарова Т.А.2
1 В^д^ния мaлоiнвaзивноï i лaзepноï cпiнaльноï иeйpоxipypгiï, ^титут иeйpоxipypгiï iм. aкaд. А.П. Ромодaиовa НАМН Укpaïии, Кш'в, Укpaïиa
2 Biддiл иeйpобiоxiмiï, ^титут иeйpоxipypгiï iм. aкaд.
А.П. Ромодaновa НАМН Укpaïии, Кш'в, Укpaïиa
Нaдiйшлa до peдaкцiï 12.08.2020 Пpийнятa до пyблiкaцiï 02.10.2020
Адреca для ли^ування:
Чопик Нaтaлiя Гpигоpiвнa, Вддл нeйpобiохiмiï, 1нститут нeйpохipypгiï ím. акад. А.П. Ромоданова, вул. Платона Maйбоpоди, 32, Ки/в, 04050, У^а/на, e-mail: natalia. chopyck@gmail.com
Мета: досл^ити бар'ерш та б^лопчш властивост збагаченого тромбоцитами фмбринового матриксу (ЗТФМ), штучного бiополiмеру Nubiplant та Тх сумiшi шляхом оцiнки життeздатностi та морфологiчних характеристик ^тин пульпозного ядра (ПЯ) мiжхребцевих дисюв щурiв, а також рiвня експреси хондрогенних маркерних генiв при культивуванш цих клiтин за наявностi зазначених матрикав.
Мaтерiaли i методи. ЗТФМ отримували зi збагаченоТ тромбоцитами плазми з використанням активатора згортання SiO2, суспенз^ клiтин ПЯ - iз хвостового вiддiлу хребта щурiв. Культивування здшснювали за наявностi одного з трьох матрикав - ЗТФМ, Nubiplan або Тх сумiшi протягом 3, 7 та 14 дiб за стандартних культуральних умов в iнкубаторi ЕС-160 (Nüve, Турцiя). Спостереження за живою культурою проводили в пограничнш з матриксами зош в межах одного поля зору з використанням швертованого м^роскопа (Nicon TS100, Япошя). Експресiю хондрогенних маркерних генiв у культурi клiтин ПЯ визначали методом полiмеразноТ ланцюговоТ реакцiТ зi зворотною транскрипцieю.
Результати. Дослiдження життeздатностi та морфолопчних характеристик клiтин ПЯ при Тх культивуванш продемонструвало зниження вм^ту живих ^тин у контрольних зразках. У культурах iз ЗТФМ та сумшшю ЗТФМ i Nubiplant кыьккть живих клiтин статистично значущо перевищувала контрольнi показники. Спостерiгали агрегацiю кл^ин у зонi безпосереднього межування з матриксами з боку нанесення. Виселення кл^ин на протилежний 6íк матриксу протягом 14 дiб у жодному з експериментальних зразюв не вщзначено. Таким чином, ЗТФМ, Nubiplant та Тх сумш можуть виконувати бар'ерш функци щодо утримання кл^инноТ популяцiТ в певнiй дiлянцi. Експреая генiв COL II, ACAN, GPC3, ANXA3, PTN, MGP та VIM ^тинами ПЯ при культивуваннi протягом 3 та 7 дiб за наявносп ЗТФМ i сумiшi ЗТФМ та Nubiplant зростала порiвняно з контрольними зразками.
Висновки. Застосування ЗТФМ, Nubiplant або сум^ ЗТФМ i Nubiplant при культивуванш ^тин ПЯ продемонструвало вщсутшсть виселення кл^ин на протилежний б^ зазначених матриксiв протягом усього перюду дослiдження (14 дiб). Використання ЗТФМ, Nubiplant або сумш ЗТФМ i Nubiplant сприяло формуванню колонiй клiтин хондроцитоподiбноТ морфологи у зош межування з матриксами та пщтримувало життездатшсть клiтин протягом усього дослщжуваного перiоду. Застосування ЗТФМ i сумш ЗТФМ та Nubiplant давало змогу тдтримувати експресiю хондрогенних гешв клiтинами ПЯ в пограничнiй з матриксами зош. Отримаш результати свщчать про позитивну дiю матриксiв на основi збагаченого тромбоцитами фiбрину на ^тини ПЯ та його бар'ерш функци, що е перспективним для застосування ЗТФМ з метою запоб^ання формуванню рубцево-спайкових процеав.
Ключовi слова: пульпозне ядро; збагачений тромбоцитами ф/бриновий матрикс; експреая ген:'в
Copyright © 2020 Eugene G. Pedachenko, Iryna G. Vasylieva, Mykhaylo V. Khyzhnyak, Natalia G. Chopyk, Natalia P. Oleksenko, Iryna M. Shuba, Olga I. Tsjubko, Olena S. Galanta, Anzhela B. Dmytrenko, Tetiana A. Makarova
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Effect of platelet-rich fibrin matrix in complex with artificial material Nubiplant on expression of chondrogenic marker genes and morphogenesis of the nucleus pulposus cells of intervertebral discs in rats
Eugene G. Pedachenko1, Iryna G. Vasylieva2, Mykhaylo V. Khyzhnyak1, Natalia G. Chopyk2, Natalia P. Oleksenko2, Iryna M. Shuba2, Olga I. Tsjubko2, Olena S. Galanta2, Anzhela B. Dmytrenko2, Tetiana A. Makarova2
1 Department of Miniinvasive and Laser Spinal Neurosurgery, Romodanov Neurosurgery Institute, Kyiv, Ukraine
2 Neurobiochemistry Department, Romodanov Neurosurgery Institute, Kyiv, Ukraine
Received: 12 August 2020 Accepted: 02 October 2020
Address for correspondence:
Natalia G. Chopyk, Neurobiochemistry Department, Romodanov Neurosurgery Institute, 32 Platona Mayborody st., Kyiv, 04050, Ukraine, e-mail: natalia. chopyck@gmail.com
The purpose was to study the barrier and biological properties of platelet-rich fibrin matrix (PRFM), an artificial biopolymer Nubiplant, and a mixture of PRFM / Nubiplant by assessing the viability and morphological characteristics of nucleus pulposus (NP) cells in rats, as well as the expression level of chondrogenic marker genes during cell cultivation in the presence of these matrices. Materials and methods. PRFM was obtained from platelet-rich plasma using a SiO2 coagulation activator. A suspension of nucleus pulposus cells was obtained from the caudal spine of rats. Cultivation was carried out in the presence of one of three matrices — PRFM, Nubiplant, or their mixture for 3, 7, and 14 days under standard culture conditions in an EC-160 incubator (Nuve, Turkey). Observation of the living culture was carried out in the area bordering with the matrix within one field of view using an inverted microscope (Nicon TS100, Japan). The expression of chondrogenic marker genes in the cell culture of the NP was determined by the method of PCR with reverse transcription.
Results. The study of the viability and morphological characteristics of NP cells during their cultivation for 3, 7, and 14 days in the presence of PRFM, PRFM / Nubiplant, or Nubiplant showed a decrease in the content of living cells in control samples; in cultures with PRFM and PRFM / Nubiplant, the number of living cells significantly exceeded the control values, aggregation of cells was observed in the area bordering with the matrices from the side of the application. None of the experimental samples showed the outflow of cells to the opposite side of the matrix after 14 days of cultivation; thus, PRFM, Nubiplant, and their mixture can perform barrier functions to keep the cell population in a certain location. Expression of the COL II, ACAN, GPC3, ANXA3, PTN, MGP, and VIM genes by the NP cells during cultivation for 3 and 7 days in the presence of PRFM and PRFM / Nubiplant increased as compared to the control samples. Conclusions. The use of PRFM, Nubiplant, or a mixture of PRFM / Nubiplant during the cultivation of NP cells demonstrated the absence of cell outflow to the opposite side of the studied matrices during the study period (14 days). The use of PRFM, Nubiplant, or a mixture of PRFM / Nubiplant promoted the formation of cell colonies with chondrocyte-like morphology in the zone bordering with the matrices and maintained cell viability throughout the study period. PRFM and PRFM / Nubiplant contributed to the maintenance of the expression of chondrogenic genes in the NP cells in the zone bordering the matrices. The results obtained indicate the positive effect of the matrix based on platelet-rich fibrin on the NP cells and its barrier functions, which is promising for the use of PRMF for preventing the formation of cicatricial adhesion. Keywords: nucleus pulposus; platelet-rich fibrin matrix; gene expression
Влияние обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса в комплексе с искусственным материалом Nubiplant на экспрессию хондрогенных маркерных генов и морфогенез клеток пульпозного ядра межпозвоночных дисков крыс
Педаченко Е.Г.1, Васильева И.Г.2, Хижняк М.В.1, Чопик Н.Г.2, Олексенко Н.П.2, Шуба И.Н.2, Цюбко О.И.2, Галанта Е.С.2, Дмитренко А.Б.2, Макарова Т.А.2
1 Отделение малоинвазивной и лазерной спинальной нейрохирургии, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины, Киев, Украина
2 Отдел нейробиохимии, Институт нейрохирургии им. акад.
А.П. Ромоданова НАМН Украины, Киев, Украина
Поступила в редакцию 12.08.2020 Принята к публикации 02.10.2020
Адрес для переписки:
Чопик Наталия Григорьевна, Отдел нейробиохимии, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова, ул. Платона Майбороды, 32, Киев, 04050, Украина, e-mail: natalia.chopyck@ gmail.com
Цель: исследовать барьерные и биологические свойства обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса (ОТФМ), искусственного биополимера Nubiplant и смеси ОТФМ и Nubiplant путем оценки жизнеспособности и морфологических характеристик клеток пульпозного ядра (ПЯ) межпозвоночных дисков крыс, а также уровня экспрессии хондрогенных маркерных генов при культивировании этих клеток при наличии указанных матриксов.
Материалы и методы. ОТФМ получали из обогащенной тромбоцитами плазмы с использованием активатора свертывания SiO2, суспензию клеток ПЯ - из хвостового отдела позвоночника крыс. Культивирование осуществляли при наличии одного из трех матриксов - ОТФМ, Nubiplant или их смеси в течение 3, 7 и 14 суток при стандартных культуральных условиях в инкубаторе ЕС-160 ^^е, Турция). Наблюдение за живой культурой проводили в пограничной с матриксом зоне в пределах одного поля зрения с использованием инвертированного микроскопа (Мсоп TS100, Япония). Экспрессию хондрогенных маркерных генов в культуре клеток ПЯ определяли методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.
Результаты. Иccлeдовaниe жизнecпоcобноcти и моpфологичecкиx xapaктepиcтик клeток ПЯ пpи иx кyльтивиpовaнии пpодeмонcтpиpовaло cнижeниe cодepжaния живыx клeток в контpольныx обpaзцax. B кyльтypax c ОТФМ и cмecью ОТФМ и Nubiplant количecтво живыx клeток cтaтиcтичecки знaчимо пpeвышaло контpольныe покaзaтeли. Haблюдaли aгpeгaцию клeток в погpaничной c мaтpикcaми зонe cо cтоpоны нaнeceния. Bыceлeния клeток нa пpотивоположнyю cтоpонy мaтpикca в тeчeниe 14 cyток ни в одном из экcпepимeнтaльныx обpaзцов нe отмeчeно. Тaким обpaзом, ОТФМ, Nubiplant и иx cмecь могут выполнять бapьepныe функции по yдepжaнию клeточной популяции в опpeдeлeнном yчacткe. Экcпpeccия гeнов COL II, ACAN, GPC3, ANXA3, PTN, MGP и VIM к^т^ми ПЯ пpи кyльтивиpовaнии в тeчeниe 3 и 7 cyток пpи нaличии ОТФМ и cмecи ОТФМ и Nubiplant возpacтaлa по cpaвнeнию c контpольными обpaзцaми. Выводы. Пpимeнeниe ОТФМ, Nubiplant или cмecи ОТФМ и Nubiplant пpи кyльтивиpовaнии клeток ПЯ пpодeмонcтpиpовaло отcyтcтвиe выceлeния клeток нa пpотивоположнyю cтоpонy упомянутые мaтpикcов в тeчeниe вceго пepиодa иccлeдовaния (14 днeй). Иcпользовaниe ОТФМ, Nubiplant или cмecи ОТФМ и Nubiplant cпоcобcтвовaло фоpмиpовaнию колоний клeток xондpоцитоподобной моpфологии в погpaничной c мaтpикcaми зонe и поддepживaло жизнecпоcобноcть клeток в тeчeниe вceго иccлeдyeмого пepиодa. Пpимeнeниe ОТФМ и ОТФМ и Nubiplant позволяло поддepживaть экcпpeccию xондpогeнныx гeнов клeткaми ПЯ в погpaничной c мaтpикcaми зонe. Полyчeнныe peзyльтaты cвидeтeльcтвyют о положитeльном дeйcтвии мaтpикca нa оcновe обогaщeнного тpомбоцитaми фибpинa нa клeтки ПЯ и enD бapьepныe функции, что являeтcя пepcпeктивным для пpимeнeния ОТФМ c цeлью пpeдотвpaщeния фоpмиpовaния pyбцово-cпaeчныx пpоцeccов. Ключевые cловa: пyльпозноe ядpо; обогaщeнный тpомбоцитaми фибpиновый мaтpикс; экспpeссия reнов
Вегуп
Baжливою пpоблeмою cyчacноï вepтeбpологiï e лiкyвaння дeгeнepaтивниx зaxвоpювaнь, зокpeмa гpиж мiжxpeбцeвиx диcкiв (МХД) з нeйpокомпpe-ciйним cиндpомом [1]. Б^ш^ть xвоpиx з цieю пaтологieю потpeбyють xipypгiчного лiкyвaння з викоpиcтaнням мeтодики cтaндapтноï м^оди^ кeктомiï, я^ можe cyпpоводжyвaтиcя peцидивaми, пов'язaними з фоpмyвaнням pyбцeво-cпaйкового пpоцecy в зош опepaцiï [2]. Цe зумовило нeобxiд-нicть виpiшeння ново!' cклaдноï мiждиcциплiнapноï пpоблeми - "'cиндpомy пpоопepовaного xpeбтa" (failed back surgery syndrome) [3]. Розвиток cиндpомy cпpи -чинeний cтpyктypними тa бiомexaнiчнимиi змiнaми в ткaнинax xpeбтового cтовпa, якi вини^ють пicля опepaцiï. Однieю з нaйбiльш чacтиx тa cклaдниx змiн e пicляопepaцiйний eпiдypaльний фiбpоз [4].
Розвиток eпiдypaльного фiбpозy зyмовлeний 6a^-тьмa чинникaми: поpyшeнням 6ap'epa мiж ^инним мозком, його оболонкaми тa нepвовими коpiнцями з оточуючими ткaнинaми, дypaльною компpecieю, локaльним pозлaдом кpово- тa лiквоpообiгy i, як нacлiдок, - pозвитком xpонiчного зaпaлeння тa зaмi-щeнням оpгaноcпeцифiчниx компонeнтiв фiбpозною тониною [5].
Hинi нe icнye aбcолютно eфeктивноï мeтодики зaпобiгaння pозвиткy eпiдypaльного фiбpозy пicля опepaцiï нa попepeковомy диcкy, нeзвaжaючи нa вeликy юльк^ть eкcпepимeнтaльниx тa клiнiчниx доcлiджeнь [6-8]. Зaпpопоновaно мeтоди зaбeзпe-чeння 6ap'epa мiж оголeними твepдою оболонкою тa нaвколишнiми ткaнинaми, однaк жодний з ниx нe дae ycпiшного тa/aбо тpивaлого клiнiчного eфeктy [9-12]. Тaким чином, aктyaльним e пошук мaтepiaлiв i мeтодiв, якi б одночacно з бap'epною фyнкцieю cпpияли peгeнepaтивним пpоцecaм тa вiдновлeнню
структурно-функцiональних властивостей уражених анатомiчних структур МХД.
Тривае вивчення можливостей використання бiологiчних методiв репарацiï МХД, зокрема методiв тканинно!' iнженерiï, iнструментом якоï е бюдеграду-вальнi матрикси. Перспективним вважають збага-чений тромбоцитами фiбриновий матрикс (ЗТФМ), а також ЗТФМ у поеднанш i3 синтетичними матриксами, що сприяе подовженню дiï фiбрину та позицюнуванню бiоматерiалу в потрiбному мiсцi [13-15].
Матрикс на основi збагаченого тромбоцитами фiбрину використовують для культивування кл^ин in vitro, а також для доставки in vivo стовбурових кл^ин [16,17]. Застосування ЗТФМ у регенеративнш медицин та тканиннiй iнженерiï зумовлено його адгезивними властивостями, що сприяе залученню потенцшних попередникiв хондроцитоподiбних кл^ин, а також здатнiстю переносити матриксш бiлки та фактори росту [18]. Перевагами ЗТФМ е автолопчшсть, неiмуногеннiсть, вiдсутнiсть хiмiчних та бiохiмiчних перетворень [19].
Численш властивостi ЗТФМ зумовлеш наявнiстю в його складi депо бюактивних молекул (тромбо-цитiв). Участь тромбоци^в у процесах репарацiï опосередковуеться факторами росту, як мiстяться в а-гранулах. Основнi з них: трансформувальний фактор росту ß (TGF-ß), фактор росту тромбоци^в (PDGF), iнсулiноподiбнi фактори росту (IGF) I та II типу, фактор росту фiбробластiв (FGF), фактор росту етдермюу (EGF), фактор росту ендотелт судин (VEGF), а також адгезивш протеши, фiбринолiтичнi фактори, протеази тощо [20]. Таким чином, комплекс бюактивних молекул робить ЗТФМ не лише пасивним матерiалом, який забезпечуе мехашчну тдтримку клiтин, а й шдуктором ïх життездатностi, пролiфе-рацп, регулятором функцiональноï активностi.
Для подовження активувальноТ дм ЗТФМ як один i3 методiв запропоновано використання його сумш 3i штучними матриксами на основi рiзних полiмерiв. Одним i3 таких матрикав е мaтерiaл Nubiplant, який отримують при полiмеризaцiТ акрилових мономерiв.
Мета: дослiдити бaр'ернi та бюлопчш влaстивостi збагаченого тромбоцитами фiбринового матриксу, штучного бiополiмеру Nubiplant та Тх сумiшi шляхом оцiнки життездaтностi та морфолопчних характеристик клiтин пульпозного ядра мiжхребцевих дискiв щурiв, а також рiвня експресiТ хондрогенних маркерних гешв при культивувaннi цих кл^ин за нaявностi зазначених мaтриксiв.
Матерiали i методи
Анaлiзувaли життездaтнiсть та морфолопчш характеристики клiтин ПЯ щурiв, а також рiвень експресiТ гешв хондрогенних мaркерiв у суспезiТ кл^ин на 3-тю, 7-му та 14-ту добу.
Дослiдження проведено вiдповiдно до принцитв бiоетики, регламентованих бвропейською конвен-цiею про захист хребетних тварин, яких використо-вують для дослщних та iнших наукових цiлей (1986), Директивою 2010/63/6С "Про захист тварин, що використовуються в наукових цтях" (2010), Законом УкраТни №3447-IV "Про захист тварин вщ жорстокого поводження" (2006). Проведення дослiдження затвер -джене комiсiею з питань етики та бюетики 1нституту нейрохiрургiТ iм. акад. А.П. Ромоданова НАМН УкраТни (протокол №3 вщ 4 травня 2018 р.).
У робот використовували: набори для видЬ лення рибонуклеТнових кислот (РНК) ("Рибо-сорб", "АмплiПрaйм"), проведення класичноТ полiмерaзноТ ланцюговоТ реaкцiТ (ПЛР) "PCR-core" (GENPAQ), зворотноТ трaнскрипцií "RevertAidTM First strand cDNA synthesis kit" (Fermentas), синтетичнi праймери для проведення ПЛР (Fermentas), агарозу (AMRESCO), Трилон-В (Riedel-de Haen), Трис (AMRESCO), етидiуму бромщ (Sigma), внутрiшньоткaнинний трансплантат Nubiplant™ (Intrernational Center for Medical Technology Implementation, УкраТна).
Дизайн дослдження
Отримання ЗТФМ
3i свiжоотримaних зрaзкiв кровi видiляли збага-чену тромбоцитами плазму (близько 1,0 ■ 10б/мкл) шляхом подвшного центрифугування, потiм отриму-вали ЗТФМ за допомогою активатора згортання SiO2.
Отримання суспензп кл/тин пульпозного ядра
Забш тварин здiйснювaли з використанням анестези кетaмiном та сибазоном. Хвостовий вщдт хребта щурiв звтьняли вiд шкiри та оболонок, промивали фiзiологiчним розчином з aнтибiотиком та антим^отиком у дозi 10 мкл/мл (PAA, Австрiя). В стерильних умовах видтяли пульпознi ядра, суспен-дували Тх у фiзiологiчному розчинi шляхом мехашч-ного пiпетувaння. Пiдрaховувaли чисельшсть живих клiтин iз застосуванням трипанового синього (Janssen Chemica, Бельгiя). Кл^ини ПЯ ресуспендували у поживному середовищ^ яке мiстило DMEM (Biowest, Франтя), збагаченому 5% сироваткою великоТ рогатоТ худоби (Biowest, Фрaнцiя). Одну сер^ зрaзкiв одразу крiоконсервувaли для визначення показниюв вихщ-ного контролю.
Культивування клтин пульпозного ядра
Для рiзних серш експерименту застосовували три види матрикав - ЗТФМ, Nubiplant або ix сумш у спiввiдношеннi 1:1. Смужку матриксу кожного виду po3MipoM 5x30 мм розмщали в чашц Петрi вщповщ-ного дiаметра таким чином, щоб утворилася пере-тинка по всш довжинi. Суспензiю кл^ин наносили на одну половину культуральноТ чашки вздовж матриксу i спостер^али за розселенням клiтинноТ популяцiТ. Зразки для культивування метили близько 1,4 ■ 10б клiтин ПЯ. Культивування проводили протягом 3, 7 та 14 дiб у стандартних культуральних умовах (t - 37°C, СО2 - 5%, вологiсть - 95%) в iнкубаторi ЕС-160 (Nüve, Туршя) без (контрольна група) або з додаванням ЗТФМ, пдрогелю Nubiplant або сумш ЗТФМ i Nubiplant (експериментальш групи). Замiну поживного середо-вища здiйснювали 1 раз на 3-4 доби.
Спостереження за живою культурою проводили в пограничнш з матриксом зош в межах одного поля зору з допомогою швертованого мкроскопа (Nicon TS100, Японiя). По заюнченш культивування кожноТ серiТ експерименту культуральний матерiал крюкон-сервували для подальших дослiджень (ПЛР), попе-редньо тдрахувавши вмiст живих клiтин.
Видлення РНК проводили стандартним методом з використанням набору "Рибо-сорб" (Amplisens) вщповщно до протоколу. Вихщ та чистоту препарату РНК оцшювали за поглинанням проби за довжини xвилi 260/280 нм.
Експре^ю reHiB колагену II (COL II), агре-кану (ACAN), гтткану (GPC3), анексину (ANXA3), плеотрофiну (PTN), матриксного протешу gla (MGP) та вiментину (VIM) в культурi ^тин ПЯ щурiв визначали методом ПЛР зi зворотною транскрипцieю (ЗТ-ПЛР). Реакшю зворотноТ транскрипцiТ проводили з використанням набору "RevertAidTM First strand cDNA synthesis kit" (Fermentas). Як контрольний ген використовували ген глщеральдепд-3-фосфат-депдроге-нази (GAPDH). Для проведення ПЛР використовували амплiфiкатор "Терцик" ("ДНК-технолопя") та набiр для проведення класичноТ ПЛР "PCR-core" (GENPAQ).
Для визначення експресм гешв застосовували таю праймери: для гена COL II -5'-caccgctaacgtccagatgac-3' та 5'-ggaaggcgtgaggtcttctgt-3', для гена ACAN - 5'-ccactggagaggactgcgtag-3' i 5'-ggtctgtgcaagtgattcgag-3' [21], для гена GPC3 -5'-ggccctgagccagtggtt-3' та 5'-tttacccttgggcacagacat-3', для гена PTN - 5'-ctcagagatgtaagatcccttgca-3' i 5'-caagcctggaactggtatttgc-3', для гена VIM -5'-gcaccctgcagtcattcaga-3' та 5'-gcaaggattccactttacgttca-3', для гена ANXA3 - 5'-gtggaagagacgaaagcctgaa-3' i 5'-atccgtgccccattttttct-3', для гена MGP -5'-gctccctctggccatcct-3' та 5'-ttccatgctttcgtgagattcata-3' [22], для гена GAPDH - 5'-gggggctctctgctcctccc-3' i 5'-caggcgtccgatacggccaa-3' [23]. Сорок ци^в амплiфi-кацп проведено за температури вщпалу 60°С.
Вiзуалiзацiю продуктiв амплiфiкацiТ проводили за допомогою електрофорезу в 2% агарозному гелк Рiвень експресм визначали за штенсившстю електро-форетичних сигналiв дослiджуваниx та контрольного гешв з використанням програмного забезпечення для аналiзу зображень "ViTran". Нормалiзацiю даних штенсивносп електрофоретичних сигналiв проводили щодо iнтенсивностi вiдповiдниx сигналiв GAPDH.
Статистичний аналiз
Для визначення статистичноТ значущосп рiзницi мiж показниками дослщжуваноТ та контрольноТ груп використовували ^критерш Стьюдента.
Результати та |'х обговорення
Дослдження життездатност кл'§тин пульпозного ядра та /х морфолопчних характеристик при культивуванн'§ за наявност збагаченого тромбоцитами фiбринового матриксу, Nubiplant або /х сум'1ш'1
Для порiвняння бар'ерних властивостей ЗТФМ, 1\1иЫр1а^ та Тх сумiшi, а також Тх толерантностi до клiтин ПЯ дослщжували життeздатнiсть (Табл. 1) та морфолопчш характеристики (Рис. 1-3) ПЯ при
Прим/'тка: * - порiвняно з контролем.
культивуванш протягом 3, 7 та 14 дiб за наявност зазначених матриксiв.
Суспензiя клiтин ПЯ, отримана iз хвостового вiддiлу хребта щурiв, мiстила (58,0±0,5) % живих кл^ин.
Пiсля культивування протягом 3 дiб вмiст живих клiтин у контрольних зразках знижувався (див. Табл. 1). Популя^я живих ^тин була однорщною i складалася iз окремо розташованих округлих бластоподiбних клiтин невеликого розмiру, якi iнколи групувалися по 2-3 (див. Рис. 1, А). В експеримен-тальних зразках вщбувалася агрега^я клiтин у зонi безпосереднього межування з матриксами з боку нанесення. Спостер^али агрегати з 10-15 ^тин (див. Рис. 1, Б-Г). У культурах iз ЗТФМ та сумшшю ЗТФМ i Nubiplant кшьюсть живих клiтин перевищувала таку в контрольних зразках у 2,1 разу (р=0,018) та 1,8 разу (р=0,011) вщповщно. В культурi клiтин з Nubiplant кiлькiсть живих клiтин перевищувала контрольний показник в 1,3 разу, але рiзниця не була статистично значущою.
На 7-му добу культивування юльюсть живих кл^ин у контрольних зразках зменшилася. В експе-риментальних зразках iз додаванням ЗТФМ та сум^ ЗТФМ i Nubiplant цей показник значно перевищував контрольнi значення: в 2,5 разу (р = 0,008) та 1,9 разу (р= 0,017) вщповщно. Кiлькiсть живих клiтин, якi культивували за наявност матриксу Nubiplant, також перевищувала контрольш показники. Клiтини в культуральних зразках мали морфолопчш ознаки хондроцитв: збтьшувався об'ем цитоплазми, набу-ваючи овально' та округлоТ форми, спостер^али велике, асиметрично розташоване ядро та вщсут-
Таблиця 1. Життездатшсть клiтин пульпозного ядра (%) при культивуванш за наявност ЗТФМ, Nubiplant або сумiшi ЗТФМ i Nubiplant
Матрикс Термш культивування, доба
3 7 14
Контроль 38,0±5,3 33,0±6,6 25,3±5,5
ЗТФМ р (t-test)* 79,0±10,1 0,018 83,0±9,8 0,008 77,0±12,5 0,016
ЗТФМ + Nubiplant р (t-test)* 67,0±6,1 0,011 64,0±9,6 0,017 58,0±7,5 0,013
Nubiplant р (t-test)* 49,7±5,52 0,029 54,3±9,3 0,029 52,0±12,5 0,057
\
ш
1 лЧ
Ш
п
К
Ы
л. t>
Oi
Рис. 1. Культура кл^ин пульпозного ядра. Живий незабарвлений препарат, зона безпосереднього контакту з матриксами, 3-тя доба культивування: А - контроль; Б - збагачений тромбоцитами фiбриновий матрикс; В - збагачений тромбоцитами фiбриновий матрикс i Nubiplant; Г - Nubiplant. х100
Рис. 2. Культура khî™h пульпозного ядра. Живий незабарвлений препарат, зона безпосереднього контакту з матриксами, 7-ма доба культивування: А - контроль, Б - збагачений тромбоцитами фнбриновий матрикс; В -збагачений тромбоцитами фнбриновий матрикс i Nubiplant; Г - Nubiplant. х100
Е
Рис. 3. Культура ^тин пульпозного ядра. Живий незабарвлений препарат, зона безпосереднього контакту з матриксами, 14-та доба культивування: А - контроль; Б - збагачений тромбоцитами фнбриновий матрикс; В -збагачений тромбоцитами фнбриновий матрикс i Nubiplant; Г - Nubiplant; протилежний б^ матрикав: Д - збагачений тромбоцитами фнбриновий матрикс; Е -збагачений тромбоцитами фнбриновий матрикс i Nubiplant; Ж - Nubiplant. х100
Д
теть вщростюв (див. Рис. 2). Кл^ини утворювали агрегати i3 10-15 клiтин, якi поеднувалися, утво-рюючи спiльний екстраклiтинний матрикс. Якщо в контрольних зразках ц агрегати розташовувалися рiвномiрно по культуральнш площинi (див. Рис. 2, А), то в експериментальних культурах вщзначено ïx тропнiсть до зовнiшнього шару матриксу, а у разi застосування Nubiplant - ïx проникнення всередину матриксу (див. Рис. 2, Б-Г). У культурах з Nubiplant та сумшшю ЗТФМ i Nubiplant ц ^тини морфологiчно вiдрiзнялись: вони мали видовжену форму цитоп-лазми та довп вiдростки, якi, проростаючи у матрикс, формували тяж^ тобто мали фiбробластоподiбну морфологiю.
На 14-ту добу культивування фракщя живих клiтин у контрольних зразках зменшилася, в експериментальних - перевищувала контрольш показ-ники. В контрольних зразках спостер^али часткову деградащю колонiй клiтин xондроцитоподiбноï морфологiï, клiтини втрачали адгезивнi властивосп, з'являлися зони некрозу (див. Рис. 3, А). На вщмшу вщ контрольних зразкiв, у зразках iз ЗТФМ колонiï клiтин формували щтьш контакти з матриксом (див. Рис. 3, Б). Всередиш матриксу спостер^али клiтини фiбробластоподiбноï морфологи. Зберiгалися велик колонiï xондроцитоподiбниx клiтин при застосуванш Nubiplant та сумiшi ЗТФМ i Nubiplant (див. Рис. 3, В, Г). Фiбрознi тяжi всерединi цих матрикав збiльшувaлися та розгалужувалися.
У цей термш у жодному з дослщжуваних мaтриксiв виселення клiтин на протилежний бк не спостерiгaли, тобто ЗТФМ, Nubiplant та ïx сумш можуть виконувати бар'ерш функцiï щодо утримання клiтинноï популяцiï в певнш дiлянцi (див. Рис. 3, Д-Ж).
Дослдження експресп ген'в хондрогенних
маркер'в у кл'§тинах пульпозного ядра in
vitro
Для дослщження впливу ЗТФМ та пдрогелю Nubiplant на функцюнальш властивосп ^тин пульпозного ядра проведено молекулярно-генетичш дослщження культурaльноï популяци клiтин експериментальних зрaзкiв (з додаванням ЗТФМ, пдрогелю Nubiplant або сумш ЗТФМ i Nubiplant) порiвняно з контрольними (без додавання матрикав). Визначали експреаю генiв - мaркерiв хондрогенних клiтин та хрящового екстра^тинного матриксу: COL II, ACAN, GPC3, ANXA3, PTN, MGP та VIM ^тинами ПЯ in vitro. Вибiр цих генiв зумовлений структурно-функцю-нальним значенням ïx продуктв для структур МХД - ПЯ та фiброзного юльця, а також даними щодо зниженого рiвня експресiï цих бшюв клiтинaми ПЯ, яке дегенеруе [24-28].
Отримаш результати свiдчaть, що експреая всix дослiджувaниx генiв у суспензи клiтин ПЯ на 3-тю добу культивування знижувалася порiвняно з експреаею клiтинaми виxiдноï суспензiï ПЯ або не визначалася взaгaлi (Табл. 2). На 7-му добу культивування спостер^али подальше зниження експресп: для гешв ANXA3 та PTN виявлено мЫмальний ïï рiвень, для гешв COL II, ACAN, GPC3 i МGP експреая не визначалася взагалк На 14-ту добу культивування в ^тинах ПЯ контрольно: групи вщзначено експресiю лише одного iз дослщжуваних генiв - VIM.
Установлено, що на 3-тю добу культивування в зразках зi смужкою ЗТФМ рiвень експреси всix дослЬ джуваних гешв зростав порiвняно з контролем. На 7-му добу культивування рiвень експреси генiв VIM, ANXA3, PTN, МGP був вищий за такий у контрольних зразках, а експреая гешв COL II, ACAN та GPC3 не визначалася. На 14-ту добу додавання ЗТФМ тдтри-мувало експреаю двох гешв - ANXA3 та МGP.
Уже на 3-тю добу вщзначено активувальний вплив бюактивних речовин ЗТФМ на метaболiчну актившсть xондроцитоподiбниx ^тин, яка забезпечуе сталють ïx екстракл^инного оточення. Про це св^чить високий рiвень експресiï генiв, зaдiяниx у хондроге-незi та секреци екстрaклiтинного матриксу xрящовоï тканини, зокрема колагену II типу, агрекану, глткану - основних мaркерiв функцiонувaння ^тин ПЯ, якi забезпечують осмотичну рiвновaгу структур МХД; гепаринзв'язувального бiлкa плеотрофшу, вiментину та анексину-3 - важливих мaркерiв, характерних для розвитку хондроцитв; матриксних бiлкiв родини Gla (кодуються геном MGP), котрi iнгiбують кальцифка^ю хряща [29-32].
У зразках, культивування яких проводили за наявносп сумш ЗТФМ i Nubiplant, у бшьшосп випaдкiв спостерiгaли подiбну до тако!' в зразках iз ЗТФМ дина -м^у експресiï генiв, але в деяких випадках рiвень експреси окремих гешв був дещо нижчим порiвняно зi зразками, в культуральне середовище яких додавали ЗТФМ без пдрогелю, але вплив ЗТФМ у поеднанш з Nubiplant щодо деяких мaркерiв був бтьш пролонго-ваний у чаа.
При культивувaннi ^тин ПЯ з додаванням пдро-гелю Nubiplant протягом 3, 7 та 14 дiб спостерiгaли пiдтримaння експресп лише гена VIM близько до рiвня контрольних значень. Експреаю шших гешв не визначено.
Отже, ЗТФМ мае активувальний вплив на експреаю кл^инами гешв хондрогенних мaркерiв, який можна пояснити наявшстю в цьому матрикс тромбоцитв - депо бiоaктивниx молекул, що робить ЗТФМ не лише мaтерiaлом з бар'ерною функшею, а й активатором ïx життездатносл та функцiонaльноï aктивностi.
Висновки
1. Застосування ЗТФМ, Nubiplant або сумш ЗТФМ i Nubiplant при культивуванш ^тин ПЯ продемонстру-вало вiдсутнiсть виселення ^тин на протилежний бiк зазначених матрикав протягом перюду дослiдження (14 дi б).
2. Використання ЗТФМ, Nubiplant або сумiшi ЗТФМ i Nubiplant сприяло формуванню колонш клiтин xондроцитоподiбноï морфологи у зош безпосереднього межування з матриксами та пщтримувало життездатшсть ^тин протягом усього дослщжуваного перiоду, тодi як у контрольних зразках на 14-ту добу культивування спостер^али некротичш процеси.
3. Застосування ЗТФМ та сумш ЗТФМ i Nubiplant сприяло тдтриманню експресiï хондрогенних гешв кл^инами ПЯ в пограничнш з матриксами зонi.
4. Отримаш результати свщчать про позитивну д^ ЗТФМ на клiтини ПЯ та його бар'ерш функци, що е перспективним для застосування ЗТФМ з метою запо -б^ання формуванню рубцево-спайкових процеав.
Таблиця 2. Експреая гешв у культурi кл^ин пульпозного ядра за наявносп ЗТФМ, Nubiplant або сумш ЗТФМ i Nubiplant
Термш культивування Контроль ЗТФМ ЗТФМ + Nubiplant Nubiplant
COL II
Нативна суспензiя ++ - - -
3-тя доба 0 + 0 0
7-ма доба 0 0 0 0
14-та доба 0 0 0 0
ACAN
Нативна суспензiя +++ - - -
3-тя доба + +++ +++ 0
7-ма доба 0 0 0 0
14-та доба 0 0 0 0
VIM
Нативна суспензiя +++ - - -
3-тя доба ++ +++ +++ ++
7-ма доба +++ +++ +++ +++
14-та доба +++ 0 0 ++
ANXA3
Нативна суспензiя +++ - - -
3-тя доба 0 ++ ++ 0
7-ма доба + ++ ++ 0
14-та доба 0 + 0 0
GPC3
Нативна суспензiя +++ - - -
3-тя доба + ++ ++ 0
7-ма доба 0 0 ++ 0
14-та доба 0 0 0 0
PTN
Нативна суспензiя +++ - - -
3-тя доба 0 ++ + 0
7-ма доба + ++ 0 0
14-та доба 0 0 0 0
MGP
Нативна суспензiя ++ - - -
3-тя доба + +++ + 0
7-ма доба 0 ++ + 0
14-та доба 0 + + 0
Розкриття шформацп
Конфликт ¡нтереав
Автори заявляють про вщсутшсть конфлiкту штереав.
Етичн/ норми
Дослiдження проведено вщповщно до принципiв бiоетики, регламентованих бвропейською конвен-цieю про захист хребетних тварин, яких використо-вують для дослщних та iнших наукових цтей (1986), Директивою 2010/63/6С "Про захист тварин, що використовуються в наукових цтях" (2010), Законом УкраТни №3447-1У "Про захист тварин вiд жорстокого поводження" (2006). Проведення дослiдження затвер -
джене комiсieю з питань етики та бюетики 1нституту нейрохiрургií iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН УкраТни (протокол №3 вщ 4 травня 2018 р.). Ф/нансування
Дослщження не мало спонсорськоТ пiдтримки. References
1. Khyzhnyak MV, Bodnarchuk YuA. [The instable thoracolumbar
spine fractures, modern methods of management]. Ukrainian Neurosurgical Journal. 2012;(4):6-10. Ukrainian. doi: 10.25305/unj.55640
2. Osterman H, Seitsalo S, Karppinen J, Malmivaara A. Effectiveness of microdiscectomy for lumbar disc herniation: a randomized controlled trial with 2 years of follow-up. Spine
(Phila Pa 1976). 2006 Oct 1;31(21):2409-14. doi: 10.1097/01. brs.0000239178.08796.52. PMID: 17023847.
3. Chan CW, Peng P. Failed back surgery syndrome. Pain Med. 2011 Apr;12(4):577-606. doi: 10.1111/j.1526-4637.2011.01089.x. PMID: 21463472.
4. Coskun E, Süzer T, Topuz O, Zencir M, Pakdemirli E, Tahta K.
Relationships between epidural fibrosis, pain, disability, and psychological factors after lumbar disc surgery. Eur Spine J. 2000 Jun;9(3):218-23. doi: 10.1007/s005860000144. PMID: 10905440; PMCID: PMC3611400.
5. Sae-Jung S, Jirarattanaphochai K, Sumananont C, Wittayapairoj K, Sukhonthamarn K. Interrater Reliability of the Postoperative Epidural Fibrosis Classification: A Histopathologic Study in the Rat Model. Asian Spine J. 2015 Aug;9(4):587-94. doi: 10.4184/asj.2015.9.4.587. PMID: 26240719; PMCID: PMC4522450.
6. Tural Emon S, Somay H, Orakdogen M, Uslu S, Somay A. Effects of hemostatic polysaccharide agent on epidural fibrosis formation after lumbar laminectomy in rats. Spine J. 2016 Mar;16(3):414-9. doi: 10.1016/j.spinee.2015.11.014. PMID: 26582488.
7. Gürer B, Kahveci R, Gökge EC, Ozevren H, Turkoglu E, Gökge A.
Evaluation of topical application and systemic administration of rosuvastatin in preventing epidural fibrosis in rats. Spine J. 2015 Mar 1;15(3):522-9. doi: 10.1016/j.spinee.2014.10.018. PMID: 25452015.
8. Karanci T, Kelten B, Karaoglan A, Cinar N, Midi A, Antar V, Akdemir H, Kara Z. Effects of 4% Icodextrin on Experimental Spinal Epidural Fibrosis. Turk Neurosurg. 2017;27(2):265-271. doi: 10.5137/1019-5149.JTN.15079-15.1. PMID: 27593771.
9. Mohi Eldin MM, Abdel Razek NM. Epidural Fibrosis after Lumbar Disc Surgery: Prevention and Outcome Evaluation. Asian Spine J. 2015 Jun;9(3):370-85. doi: 10.4184/ asj.2015.9.3.370. PMID: 26097652; PMCID: PMC4472585.
10. Zhang C, Kong X, Ning G, Liang Z, Qu T, Chen F, Cao D, Wang T, Sharma HS, Feng S. All-trans retinoic acid prevents epidural fibrosis through NF-kB signaling pathway in post-laminectomy rats. Neuropharmacology. 2014 Apr;79:275-81. doi: 10.1016/j.neuropharm.2013.11.010. Erratum in: Neuropharmacology. 2020 Aug 1;172:107927. PMID: 24316159.
11. Xu H, Liu C, Sun Z, Guo X, Zhang Y, Liu M, Li P. CCN5 attenuates profibrotic phenotypes of fibroblasts through the Smad6-CCN2 pathway: Potential role in epidural fibrosis. Int J Mol Med. 2015 Jul;36(1):123-9. doi: 10.3892/ ijmm.2015.2190. PMID: 25901787; PMCID: PMC4494601.
12. Chen F, Wang C, Sun J, Wang J, Wang L, Li J. Salvianolic acid B reduced the formation of epidural fibrosis in an experimental rat model. J Orthop Surg Res. 2016 Nov 16;11(1):141. doi: 10.1186/s13018-016-0475-x. PMID: 27852325; PMCID: PMC5112727.
13. Theys T, Van Hoylandt A, Broeckx CE, Van Gerven L, Jonkergouw J, Quirynen M, van Loon J. Plasma-rich fibrin in neurosurgery: a feasibility study. Acta Neurochir (Wien). 2018 Aug;160(8):1497-1503. doi: 10.1007/s00701-018-3579-8. PMID: 29872915.
14. Garcia M.C. Drug delivery systems based on nonimmunogenic biopolymers. In: Parambath A., editor. Engineering of Biomaterials for Drug Delivery Systems. Elsevier; 2018. p.317-344.
15. Kardos D, Hornyak I, Simon M, Hinsenkamp A, Marschall B, Vardai R, Kallay-Menyhard A, Pinke B, Meszaros L, Kuten O, Nehrer S, Lacza Z. Biological and Mechanical Properties of Platelet-Rich Fibrin Membranes after Thermal Manipulation and Preparation in a Single-Syringe Closed System. Int J Mol Sci. 2018 Nov 1;19(11):3433. doi: 10.3390/ijms19113433. PMID: 30388866; PMCID: PMC6274993.
16. Wu I, Elisseeff J. Biomaterials and Tissue Engineering for Soft Tissue Reconstruction. In: Laurencin C, Deng M, editors. Natural and synthetic biomedical polymers. Newnes; 2014 Jan 21. Elsevier; 2014;235-41. doi: 10.1016/b978-0-12-396983-5.00015-6
17. Oh JH, Kim HJ, Kim TI, Woo KM. Comparative evaluation of the biological properties of fibrin for bone regeneration. BMB Rep. 2014 Feb;47(2):110-4. doi: 10.5483/bmbrep.2014.47.2.156. PMID: 24257120; PMCID: PMC4163896.
18. Wang ZS, Feng ZH, Wu GF, Bai SZ, Dong Y, Chen FM, Zhao YM. The use of platelet-rich fibrin combined with periodontal ligament and jaw bone mesenchymal stem cell sheets for periodontal tissue engineering. Sci Rep. 2016 Jun 21;6:28126. doi: 10.1038/srep28126. PMID: 27324079; PMCID: PMC4914939.
19. Alston SM, Solen KA, Sukavaneshvar S, Mohammad SF. In vivo efficacy of a new autologous fibrin sealant. J Surg Res. 2008 May 1;146(1):143-8. doi: 10.1016/j.jss.2007.08.006. PMID: 18279893.
20. Bissell L, Tibrewal S, Sahni V, Khan WS. Growth factors and platelet rich plasma in anterior cruciate ligament reconstruction. Curr Stem Cell Res Ther. 2015;10(1):19-25. doi: 10.2174/1574888x09666140710102002. PMID: 25012741.
21. Peng L, Jia Z, Yin X, Zhang X, Liu Y, Chen P, Ma K, Zhou C. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, cartilage, and adipose tissue. Stem Cells Dev. 2008 Aug;17(4):761-73. doi: 10.1089/scd.2007.0217. PMID: 18393634.
22. Lee CR, Sakai D, Nakai T, Toyama K, Mochida J, Alini M, Grad S. A phenotypic comparison of intervertebral disc and articular cartilage cells in the rat. Eur Spine J. 2007 Dec;16(12):2174-85. doi: 10.1007/s00586-007-0475-y. PMID: 17786487; PMCID: PMC2140128.
23. Bertrand RL, Senadheera S, Tanoto A, Tan KL, Howitt L, Chen H, Murphy TV, Sandow SL, Liu L, Bertrand PP. Serotonin availability in rat colon is reduced during a Western diet model of obesity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2012 Aug 1;303(3):G424-34. doi: 10.1152/ajpgi.00048.2012. PMID: 22595993.
24. Chen S, Hu ZJ, Zhou ZJ, Lin XF, Zhao FD, Ma JJ, Zhang JF, Wang JY, Qin A, Fan SW. Evaluation of 12 Novel Molecular Markers for Degenerated Nucleus Pulposus in a Chinese Population. Spine (Phila Pa 1976). 2015 Aug 15;40(16):1252-60. doi: 10.1097/BRS.0000000000000929. PMID: 25893345.
25. Massey CJ, van Donkelaar CC, Vresilovic E, Zavaliangos A, Marcolongo M. Effects of aging and degeneration on the human intervertebral disc during the diurnal cycle: a finite element study. J Orthop Res. 2012 Jan;30(1):122-8. doi: 10.1002/jor.21475. PMID: 21710607.
26. Vo NV, Hartman RA, Patil PR, Risbud MV, Kletsas D, Iatridis JC, Hoyland JA, Le Maitre CL, Sowa GA, Kang JD. Molecular mechanisms of biological aging in intervertebral discs. J Orthop Res. 2016 Aug;34(8):1289-306. doi: 10.1002/ jor.23195. PMID: 26890203; PMCID: PMC4988945.
27. Vynios DH. Metabolism of cartilage proteoglycans in health and disease. Biomed Res Int. 2014;2014:452315. doi: 10.1155/2014/452315. PMID: 25105124; PMCID: PMC4106107.
28. Schloer S, Pajonczyk D, Rescher U. Annexins in Translational Research: Hidden Treasures to Be Found. Int J Mol Sci. 2018 Jun 15;19(6):1781. doi: 10.3390/ijms19061781. PMID: 29914106; PMCID: PMC6032224.
29. Xu C, Zhu S, Wu M, Han W, Yu Y. Functional receptors and intracellular signal pathways of midkine (MK) and pleiotrophin (PTN). Biol Pharm Bull. 2014;37(4):511-20. doi: 10.1248/bpb. b13-00845. PMID: 24694599.
30. Vo NV, Hartman RA, Patil PR, Risbud MV, Kletsas D, Iatridis JC, Hoyland JA, Le Maitre CL, Sowa GA, Kang JD. Molecular mechanisms of biological aging in intervertebral discs. J Orthop Res. 2016 Aug;34(8):1289-306. doi: 10.1002/ jor.23195. PMID: 26890203; PMCID: PMC4988945.
31. Vynios DH. Metabolism of cartilage proteoglycans in health and disease. Biomed Res Int. 2014;2014:452315. doi: 10.1155/2014/452315. PMID: 25105124; PMCID: PMC4106107.
32. Schloer S, Pajonczyk D, Rescher U. Annexins in Translational Research: Hidden Treasures to Be Found. Int J Mol Sci. 2018 Jun 15;19(6):1781. doi: 10.3390/ijms19061781. PMID: 29914106; PMCID: PMC6032224.