CC BY
82
SBA- положительных альвеолярних макрофагов и LABA -положительных дендритных клеток, ассоциированных с BALT -системой.
Ключевые слова: гипотироз, лектиногистохимия,
легкие, крыса.
Стаття надійшла 3.04.2012 р.
process activation that results in increased number of the SBA- positive alveolar macrophages and BALT-associated LABA positive dendritic cells.
Key words: hypothyroidism, lectinhistchemistry,
lungs, rat.
УДК: 614.777:543.39:547.42
ВПЛИВ ПОЛІОЛІВ НА ОСНОВІ ГЛІЦЕРОЛУ, ЕТИЛЕН- І ПРОПІЛЕНГЛІКОЛЮ НА ПРОЦЕСИ ВІЛЬНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕННЯ В ОРГАНІЗМІ ЩУРІВ
У роботі досліджена активність процесів окислювальної модифікації білків і перекисного окислення ліпідів в умовах тривалої дії промислових хімічних забрудників довкілля - поліолів в дозах 1/10 і 1/100 ЬБ50, що є необхідним для розкриття механізмів їх біологічної дії. Поліоли на основі глицерола (П-1103К, П- 3003), етилен- і пропіленгліколю (П-1601Б, П- 3502) на 30-у добу пероральної дії в сироватці крові щурів підвищують зміст аліфатичних кетон-динітрофенілгидразонів нейтрального і основного характеру, диєнових кон’югатів, ТБК-активних продуктів і шифових основ. Найбільш виражені зміни спостерігаються при дії 1/10 ЬБ50. Виявлені порушення необхідно враховувати при складанні прогнозу несприятливого впливу на здоров'ї населення.
Ключові слова: поліоли, теплокровні тварини, окислювальна модифікація білків, перекисне окислення ліпідів.
Робота виконана у рамках науково-дослідної роботи Харківського національного медичного університету «Вивчення механізмів біологічної дії простих поліефірів у зв ’язку з проблемою охорони навколишнього середовища» (номер держреєстрації 01100001812).
Проблема захисту та оздоровлення довкілля від негативного впливу хімічних речовин займає особливе місце серед важливіших задач сучасної екологічної медицини. Бурхливий розвиток хімічної промисловості призвів до його глобального забруднення [3, 11]. До поширених промислових хімічних забруднювачів відносяться поліоли, які знайшли широкого використання у багатьох галузях промисловості та побуту як емульгатори, флотореагенти, охолоджувальні та гідравлічні рідини, антикорозійні препарати тощо [5]. Проте, механізми біологічної дії цих сполук вивчені недостатньо, а саме їхнє урахування є підставою для адекватної регламентації та обґрунтування медико-біологічних і профілактичних заходів щодо захисту здоров’я населення та довкілля.
Останнім часом в якості неспецифічного патогенетичного ланцюга формування багатьох патологічних процесів в організмі розглядається активація системи неферментативного вільнорадикального окислення та його окремого прояву - перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) [1]. Доведено, що активні форми кисню, крім стимуляції ПОЛ, сприяють також окислювальній модифікації білків (ОМБ), що призводить до втрати їх функціональної активності [2]. Вважається, що ОМБ є більш надійним маркером окислювальних пошкоджень тканин, ніж ПОЛ. Продукти ОМБ стабільніші, порівняно з пероксидами ліпідів, швидко метаболізуються під дією пероксидаз та низькомолекулярних антиоксидантів, є джерелом вільних радикалів, які виснажують запаси клітинних антиоксидантів [7]. ОМБ розглядають не тільки як пусковий механізм патологічних процесів, а ще як найбільш ранній маркер оксидативного стресу [15]. Результати оцінки активності вільнорадикального окислення у біологічних субстратах вважають об'єктивними показниками загального стану організму та його регуляторних систем, зокрема за дії факторів хімічного походження.
Метою роботи була оцінка тривалого впливу поліолів на основі гліцеролу (П-1103К, П-3003), етилен- і пропіленгліколю (П-1601Б, П-3502) у дозах 1/10, 1/100 ЬБ50 на стан процесів окислювальної модифікації білків та перекисного окислення ліпідів за вмістом 2,4-динітрофенілгідразонів, дієнових кон’югатів, ТБК-активних продуктів, шифових основ у сироватці крові щурів.
Матеріал та методи дослідження. У роботі використано зразки речовин з регламентованими фізико-хімічними характеристиками: бутилаліловий ефір поліоксипропіленоксиетиленгліколя - П-1601Б,
поліоксипропілентриол - П-1103К, поліоксиетиленоксипропілентриол - П-3003, поліоксиетиленоксипропілен-гліколь - П-3502. Експерименти проведено на статевозрілих білих щурах-самцях лінії Вістар масою (180-220) г. Проведення процедур з експериментальними тваринами здійснено згідно з вимогами Державного комітету з етики. Тварини утримувалися у стаціонарних умовах віварію за постійної температури та природного освітлення у пластикових клітках на збалансованому харчовому раціоні [8, 10]. Їх піддавали пероральній затравці за допомогою зонда водними розчинами поліолів щоденно одноразово протягом 30 діб у дозах 1/10 і 1/100 ЬБ50. Це відповідно складало для П-1601Б - 0,385 і 0,0385 г/кг; П-1103К - 0,12 і 0,012 г/кг; П-3003 - 0,32 і 0,032 г/кг; П-3502 - 0,39 і 0,039 г/кг маси тварин. Тваринам контрольної групи вводили відповідні об’єми води. Дослідження біохімічних параметрів сироватки крові здійснювали на 30-ту добу після початку експерименту. Забій тварин проводили шляхом декапітації, попередньо анестезуючи тіопенталом натрію.
Оцінку інтенсивності спонтанної ОМБ сироватки крові проводили за допомогою модифікованого методу [4], який базується на реакції взаємодії карбонільних похідних білків і шифових основ з 2,4-динітрофенілгідразином з утворенням 2,4-динітрофенілгідразонів (2,4-ДНФГ). Останні реєстрували при 356 нм, 370 нм і 430 нм. Об’єм сироватки крові складав 0,05 мл, білки осаджували 20% розчином трихлороцтової кислоти. Кількість утворення 2,4-ДНФГ розраховували, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції, що дорівнював 21-10"3 моль"1см"1. Концентрацію дієнів у сироватці крові визначали спектрофотометричним методом [6]. Екстракцію ліпідів проводили гептан-ізопропаноловою сумішшю, вміст дієнів розраховували за допомогою коефіцієнта молярної екстинкції, що складав 2,2-105 М-см-1. Вміст ТБК-активних продуктів визначали за методом [12], що базується на реакції між малоновим діальдегідом й тіобарбітуровою кислотою, яка за умов високої температури та кислого середовища відбувається з утворенням забарвленого триметинового комплексу з максимумом поглинання при 532 нм. Шифові основи як продукти взаємодії карбонільних сполук та аміногруп білків, амінокислот і нуклеїнових кислот екстрагували сумішшю Фолча (хлороформ-метанол) з наступним спектрофлюориметричним визначенням їхнього вмісту в хлороформному екстракті при довжині хвилі збудження 360 нм та довжині хвилі емісії 430 нм [14]. Для перевірки гіпотез щодо рівності генеральних середніх двох незалежних, незв’язаних вибірок використовували 1> критерій Стьюдента з попередньою перевіркою нормальності розподілу варіант [9].
Результати дослідження та їх обговорення. Тривалий вплив поліолів супроводжувався збільшенням у сироватці крові щурів за умов впливу 1/10 і 1/100 ЬБ50 вмісту 2,4-ДНФГ (табл. 1).
Таблиця 1
Вміст 2,4-динітрофенілгідразонів у сироватці крові щурів на 30-ту добу впливу поліолів (од. опт.
щільності/г білка, М±ш, п=10)
Поліол Доза, ЬБ50 356 нм 370 нм 430 нм
П-1601Б 1/10 55,3±4,9* 53,8±4,7* 5,6±0,52*
1/100 42,5±3,8* 45,5±4,6* 4,5±0,40*
П-1103К 1/10 60,4±5,8* 67,9±6,8* 6,0±0,57*
1/100 54,7±4,4* 57,1±5,2* 4,9±0,50*
П-3003 1/10 58,2±5,4* 60,3±5,5* 5,8±0,59*
1/100 47,6±4,3* 54,4±4,8* 4,2±0,51*
П-3502 1/10 50,7±4,4* 59,1±6,2* 5,8±0,61*
1/100 42,5±3,7* 44,8±3,6* 4,4±0,39*
Контроль 28,4±2,2 32,9±3,1 3,1±0,3 5
Примітка: * - р<0,05 відносно контролю
Слід зазначити, що вивчення карбонільних продуктів окислення білків сироватки крові контрольних тварин виявило наявність аліфатичних кетон-ДНФГ нейтрального (при 356 нм і 370 нм) та основного (430 нм) характеру, що свідчить про перебіг цих процесів за фізіологічних умов. Виявлений вміст аліфатичних кетон-ДНФГ нейтрального характеру в 9-11 разів перевищував вміст ДНФГ основного характеру, що збігається з даними літератури [4]. Достовірно значуще підвищення вмісту нейтральних кетон-ДНФГ при 356 нм за умов дії 1/10 ЬБ50 складало, порівняно з контролем, 95%, 113%, 105% і 79% відповідно для 1601Б, 1103К, 3003 і 3502. При дозі 1/100 ЬБ50 ці зміни були менш виразними й дорівнювали відповідно 50%, 93%, 68% і 50%. Вміст аліфатичних кетон-ДНФГ нейтрального характеру при 370 нм зазнавав таку ж динаміку змін у дозах 1/10 і 1/100 ЬБ50, а саме достовірне збільшення в середньому на 84% і 53%, порівняно з контролем. Найбільш сильну дію чинив поліол 1103К, найменш - поліол 1601Б. Рівень кетон-ДНФГ основного характеру при 430 нм також достовірно збільшувався в сироватці крові тварин за дії поліолів у дозах 1/10 і 1/100 ЬБ50 в середньому на 87% і 45% порівняно з контролем. Суттєві зсуви рівня основних кетон-ДНФГ можуть бути пов’язані з посиленим глікозилуванням білків, що є характерним для стресових станів, у тому числі й хімічного походження. Доведено, що цей процес тісно пов’язаний з вільнорадикальними реакціями. При цьому вміст продуктів неферментативного глікозилування білків за умов оксидативного стресу, як правило, збільшується [13].
Т аблиця 2
Вміст продуктів перекисного окислення ліпідів у сироватці крові щурів на 30-ту добу впливу поліолів (п=10)
Поліол Доза, ЬБ50 Дієнові кон’югати ТБК-активні продукти Шифові основи, од.флюоресценції/мл
П-1601Б 1/10 5,9±0,61* 2,5±0,23* 2,4±0,23*
1/100 4,8±0,44* 1,8±0,16* 0,95±0,11*
П-1103К 1/10 6,3±0,57* 2,7±0,30* 2,9±0,31*
1/100 5,0±0,42* 1,8±0,15* 0,98±0,092*
П-3003 1/10 6,8±0,70* 1,9±0,14* 3,1±0,28*
1/100 5,4±0,48* 1,6±0,08* 1,02±0,096*
П-3502 1/10 5,5±0,46* 2,2±0,17* 2,6±0,20*
1/100 4,1±0,36* 1,7±0,13* 0,97±0,095*
Контроль 2,7±0,25 1,1±0,09 0,78±0,081
Примітка: * - р<0,05 відносно контролю
Основними продуктами ПОЛ є первинні - дієнові кон’югати (ДК), вторинні - ТБК-активні продукти та кінцеві - шифови основи (ОШ). У сироватці крові щурів на 30-ту добі дії речовин у дозі 1/10 ЬБ50 спостерігалося суттєве збільшення ДК, особливо у випадку поліолу 1103К і 3003 - на 133% і 152% порівняно з контролем. Доза 1/100 ЬБ50 чинила менш виразний ефект, а саме достовірне підвищення ДК на 78%, 85%, 100% і 52% відповідно для 1601Б, 1103К, 3003 і 3502. Така ж динаміка простежувалася й для вмісту ТБК-активних продуктів: в середньому на
111% при впливі 1/10 ЬБ50 і 57% при 1/100 ЬБ50. Цікавими є результати щодо вмісту ОШ у сироватці крові експериментальних тварин. Так, за дії 1/10 ЬБ50 виявлялося їх суттєве підвищення: в 3,1 рази для 1601Б, в 3,7 разів для 1103К, в 3,9 разів для 3003 - 32% і в 3,3 рази для 3502, порівняно з контролем. Вплив дозою 1/100 ЬБ50 був статистично значущим для всіх досліджуваних поліолів. Збільшення рівня ОШ при цьому складало в середньому 26% (табл. 2). Коефіцієнт співвідношення ОШ/ДК+ТБК-активні продукти для поліолів у дозі 1/10 ЬБ50 в середньому дорівнював 0,325±0,040 ум.од на фоні контролю 0,205±0,019 ум.од., а для дози 1/100 ЬБ50 - 0,150±0,018 ум.од. Тобто, збільшення коефіцієнту за умов впливу 1/10 ЬБ50 переконливо свідчить про направленість процесів у бік утворення токсичних сполук - ОШ, а його зменшення у дозі 1/100 ЬБ50 - про активацію ПОЛ на рівні утворення первинних і вторинних продуктів.
1. Тривала дія поліолів на основі гліцеролу (П-1103К, П-3003), етилен- і пропіленгліколю (П-1601, П-3502) призводить до посилення процесів вільнорадикального окислення в організмі теплокровних тварин.
2. Посилення процесів вільнорадикального окислення підтверджується збільшенням у сироватці крові вмісту
продуктів окислювальної модифікації білків і перекисного окислення ліпідів - 2,4-динітрофенілгідразонів, дієнів, ТБК-активних продуктів, шифових основ.
3. Наслідками посилення вільнорадикального окислення в організмі є зміни конформації ліпідів і білків, що призводять до порушення структурних і функціональних властивостей біомембран, підвищення їхньої лабільності й проникності, розбалансування ферментних систем мембран та електротранспортних ланцюгів мітохондрій.
4. Досліджувані речовини мають подібний вплив на організм щурів, виразність якого залежить від дози.
Перспективи подальших досліджень. У подальшому планується провести комплекс досліджень, спрямованих на обґрунтування механізмів біологічної дії поліолів, зокрема оцінки стану біологічних мембран, з метою визначення їх потенційної небезпеки та нормування.
1. Барабой В.А. Окислительно-антиоксидантный гомеостаз в норме и патологи / Барабой В.А., Сутковой Д.А.. - К.: Наукова думка, 1997. - 420 с.
2. Вьюшина А.В. Перекисное окисление белков сыворотки крови у крыс, селектированных по скорости выработки условного рефлекса активного избегания, в норме и при патологии / Вьюшина А.В., Герасимова И.Г., Флеров М. А. // Бюлл. экспер. биологии и медицины. - 2002. - Т. 133, № 3. - С. 286-289.
3. Деревянко Я.Я. Пути снижения негативного влияния окружающей природной среды на здоровье населения / Деревянко Я.Я., Рахімова Т.Б. // Экология и здоровье человека. Охрана водного и воздушного бассейнов. - Бердянск. - 2008. - Т. 1. - С. 3-6.
4. Дубинина Е.Е. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения / Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А. [и др.] // Вопросы медицинской химии.-1995.- Т. 41, № 1. - С. 24-26.
5. Жуков В.І., Попова Л.Д., Зайцева О.В., Кратенко Р.І. Простые и макроциклические эфиры: научные основы охраны
водных объектов. - Х.: Торнадо, 2000. - 438 с.
6. Каухин А.Б. Экстракция липидов смесью гептан-изопропанол для определения диеновых конъюгатов / Каухин А.Б., Ахметова Б.С. // Лаб. дело. - 1987 . - № 6. - С. 335-337.
7. Кличханов Н.К. Интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови при гипотермии и на фоне введения даларгина / Кличханов Н.К., Исмаилова Ж.Г., Эмирбеков Э.З. // Бюлл. экспер. биологии и медицины. - 2001. - Т. 31, № 3. - С. 281-283.
8. Кожем’якін Ю.М., Хромов О.С., Філоненко М.А., Сайфетдінова Г.А. Науково-практичні рекомендації з утримання лабораторних тварин та роботи з ними.- К.: Авіценна, 2002. - 156 с.
9. Лакин Г.Ф. Биометрия / Лакин Г.Ф. - М.: Высшая школа, 1990. - 154 с.
10. Ланг С.М. Лабораторная крыса / Ланг С.М., Уилсон Д. // Лабораторные животные. - 1993. - Т. 3, № 2. - С. 100-110.
11. Никула Е.Т. Основные этапы комплексной медико-экологической оценки влияния отрицательных факторов окружающей среды на здоровье населения / Никула Е.Т., Антомонов М.Ю. // Гигиена населенных мест. - Киев. - 2004. - С. 356-360.
12. Федорова Т.Н. Реакции с тиобарбитуровой кислотой для определения малонового диальдегида крови методом флюориметрии / Федорова Т.Н., Коршунова Т.С., Ларский Э.Г. // Лаб. дело. - 1983. - № 3. - С. 25-28.
13. Munch G. Enhanced glycation of hemoglobin and plasma proteins is associated with increased lipid peroxide levels in nondiabetic hypertensive subjects / Munch G., Keis R., Wessels А. // Arch. Med. Res. - 2007. - Vol. 38, № 8. - P. 822-826.
14. Rice-Evans C.A. Techniques in Free Radical Research / Rice-Evans C.A., Diplock A.T., Symons M.C. - Elsevier, 1991. - 309 p.
15. Winterbourn C.C. Protein carbonyl measurements show evidence of early oxidative stress in critically ill patients / Winterbourn C.C., Buss I.H., Chan T.P. [et all.] // Crit. Care. Med. - 2000. - Vol. 28, № (1). - Р. 275-279.
ВЛИЯНИЕ ПОЛИОЛОВ НА ОСНОВЕ ГЛИЦЕРОЛА, ЭТИЛЕН- И ПРОПИЛЕНГЛИКОЛЯ НА ПРОЦЕССЫ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В ОРГАНИЗМЕ КРЫС Резуненко Ю.К., Прокопов В.А., Жуков В.И.
В работе исследована активность процессов окислительной модификации белков и перекисного окисления липидов в условиях длительного воздействия промышленных химических загрязнителей окружающей среды - полиолов в дозах 1/10 и 1/100 ЬБ5о, что является необходимым для раскрытия механизмов их биологического действия. Полиолы на основе глицерола (П-1103К, П-3003), этилен- и
INFLUENCE OF POLYOLS STRUCTURALLY BASED ON GLYCEROL, ETHYLENE- AND PROPYLENGLYCOLS ON FREE RADICAL OXIDATION IN RAT ORGANISM Resunenko Y.K., Prokopov V.A., Zhukov V.I.
The present work investigated activities of protein oxidative modification and lipid peroxidation at conditions of prolonged action of industrial chemical polluters e.g. polyols in 1/10 and 1/100 LD50. The research is a part for establishing biological action mechanism of the compounds. Polyols structurally based on glycerol (P-1103K, P-3003), ethylene- and propylenglycol (P-1601B, P-3502) increase in
пропиленгликоля (П-1601Б, П-3502) на 30-е сутки перорального воздействия в сыворотке крови крыс повышают содержание алифатических кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального и основного характера, диеновых конъюгатов, ТБК-активных продуктов и шиффовых оснований. Наиболее выраженные изменения наблюдаются при действии 1/10 ЬБ50. Выявленные нарушения необходимо учитывать при составлении прогноза неблагоприятного влияния на здоровье населения.
Ключевые слова: полиолы, теплокровные животные, окислительная модификация белков, перекисное окисление липидов.
Стаття надійшла 12.04.2012 р.
rat blood serum levels of aliphatic ketodinitrophenylhydrozones of neutral and alkaline characters, dienic conjugates, TBA-active products and Schiff’s bases on the 30th day of the compound peroral action. The most pronounced alteration were observed in 1/10 LD50. The displayed impairments must be considered when elaborating the prognosis of unfavorable influence of the substances on the population health.
Key words: polyols, warm-blooded animals,
oxidative modification of proteins, lipid peroxidation.
УДК 617.7-007.681:577.19-07
СОСТОЯНИЕ МЕМБРАН ЛИЗОСОМ СЕТЧАТКИ И ЗРИТЕЛЬНОГО НЕРВА ПРИ РАЗВИТИИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГЛАУКОМЫ
Работа выполнена на кроликах с моделированной глаукомой. Определяли активность различных форм маркерного лизосомального фермента - кислой фосфатазы в тканях глаза в динамике развития глаукомного процесса. Полученные результаты свидетельствуют об снижении их активности по сравнению с нормой во все сроки контроля.
Ключевые слова: глаукома, кислая фосфатаза, лизосомы.
Актуальность и сложность проблемы глаукомы состоит в том, что, с одной стороны, современная офтальмология имеет в своем арсенале большой выбор лекарственных препаратов, методик консервативного и хирургического лечения, а с другой - не всегда эти лечебные мероприятия оказываются эффективными. Это объясняется сложностью патогенетических механизмов развития заболевания и симптоматическим, а не патогенетическим подходом к его лечению и профилактике [2,6,9].
Существует более 60 различных форм глаукомы, среди которых есть формы с четко установленными причинами развития (врожденная глаукома, факотопическая, факоморфическая и т.д.). в то же время первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) - это полиэтиологическое заболевание с пороговым эффектом, в патогенезе которого играют роль множество факторов риска (наследственность, возраст, сахарный диабет, уровень внутриглазного давления) и патогенные факторы. Развитие ПОУГ обуславливается микроструктурными изменениями на клеточном уровне вследствие нарушения многих процессов: инволютивных, биомеханических, механизмов кровообращения и сосудистой ауторегуляции, ускорением апоптоза нервных клеток и снижением уровня естественной нейропротекции. В патогенезе заболевания играют роль изменения иммунных факторов, эластотонических свойств склеры, возраст, расовая принадлежность, сосудистая дисрегуляция, артериосклероз и т.д [5,7,11,22]. Ограниченные возможности медикаментозной терапии и недостаточная эффективность хирургического лечения ПОУГ обусловили необходимость поиска новых патогенетических подходов к лечению и профилактике больных с глаукомой, что и определило цель и задачи исследования [14,15,19,21].
Развитие ПОУГ обусловливается микроструктурными изменениями на клеточном уровне вследствие нарушения многих процессов: инволютивных, биомеханических, механизмов кровообращения и сосудистой ауторегуляции, ускорением апоптоза нервных клеток и снижением уровня естественной нейропротекции [12,14,18]. По всей вероятности патофизиологические и метаболические изменения приводят к серьезным повреждениям в сетчатке и зрительном нерве в первую очередь в результате образования свободных радикалов и активации нейротансмиттера глутамата [10,13,16,17].
Участие процессов свободно-радикального окисления в патогенезе глаукомы принято рассматривать в двух направлениях. Во-первых, это патологические изменения, происходящие с участием активных форм кислорода и их метаболитов. Во-вторых, это - цитотоксическое действие свободных радикалов на сетчатку и зрительный нерв [7,14]. Доказано, что при ишемии, вызванной повышенным ВГД, в сетчатке увеличивается количество радикалов. Снижение поступления в нейроны молекулярного кислорода и повышение уровня восстановленности компонентов дыхательной цепи стимулирует восстановление кислорода по одноэлектронному пути с образованием свободных радикалов. Высокореакционные радикалы кислорода вызывают окисление биомолекул, а также инициируют цепные процессы перекисного окисления в мембранных липидах, прямое повреждение нуклеиновых кислот и белков [20,21,]. В этой связи основная стратегия лечения этого заболевания должна быть направлена на предотвращение гибели нейронов и обозначается как нейропротекция.
Целью работы была разработка эффективных способов нейропротекторного лечения с учетом воздействия на указанные патогенетические механизмы глаукоматозной оптической нейропатии (ГОН).
