CC BY
62Фізика живого, Т. 18, No 2, 2010. С.80-84.
© Чайка В. О., Харченко О.І., Богун Л.І., Остапченко Л.І.
РІі.уяіоч oHlic Alhc
П » n.|M.M>U‘ll(4>44‘lltrr.net
УДК 277.3
ВПЛИВ ОЦТОВОКИСЛОГО ЦИНКУ НА АКТИВНІСТЬ АЛКОГОЛЬ- ТА АЛЬДЕГІДДЕГІДРОГЕНАЗИ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ З ХРОНІЧНОЮ АЛКОГОЛЬНОЮ ЗАЛЕЖНІСТЮ Чайка В.О., Харченко О.І., Богун Л.І., Остапченко Л.І.
ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка
е-mail 77olgaz@gmail.com
Надійшла до редакції 25.02.2010
Алкогольна залежність супроводжується зниженням активності основних ферментів метаболізму етанолу - алкоголь- та альдегіддегідрогеназ клітин печінки щурів. Введення оцтовокислого цинку приводило до нормалізації дефіциту цинку у печінці та сироватці, що розвивався на фоні алкогольної залежності, та до зростання активності досліджуваних ферментів.
Ключові слова: етанол, оцтовокислий цинк, сироватка, гепатоцити, АДГ, АлДГ, алкогольна залежність.
ВСТУП
Алкогольна залежність є хронічним розладом, що викликається рядом генетичних, соціально-психологічних та екзогенних факторів. Проблема боротьби з алкоголізмом є однією з найбільш драматичних проблем у більшості країн світу. Медико-соціальне значення проблеми визначається перш за все значною розповсюдженістю вживання алкоголю, наркотиків та токсичних речовин, що призводить до шкідливих наслідків для здоров'я населення в цілому. За останні три десятиліття вживання алкоголю у промислово-розвинених країнах збільшилось у середньому в 15 разів, що призвело, за останніми даними ВОЗ, до ураження алкоголізмом від 1 до 10% дорослого населення. Алкоголізм характеризується високим показником смертності, що пов'язано не тільки з великим травматизмом, який супроводжує сп'яніння, але й з такими ускладненнями його, як цироз печінки, гепатити, гепатохолецистити, гастрити та виразкова хвороба, туберкульоз, кардіоміопатії, гіпертонічна хвороба та ін. [1].
Усе більше значення в клінічних та
експериментальних дослідженнях надається вивченню системи метаболізму етанолу в організмі людини і тварин з метою створення нових препаратів, які використовуються для профілактики і лікування алкогольної залежності. Перспективним напрямком є використання засобів корекції первинних механізмів метаболічної залежності за рахунок підвищення ефективності природних біохімічних процесів, відновлення активності та субстратного забезпечення ферментів, що регулюють обмін алкоголю в організмі. Тому, вивчаючи потенційне застосування препарату у антиалкогольній терапії важливо дослідити його вплив на активність основних ферментів метаболізму етанолу - алкоголь- та альдегіддегідрогенази.
Основну позицію в метаболізмі етанолу займає алкогольдегідрогеназа (АДГ), яка є задіяною в первинному механізмі детоксикації екзогенних спиртів. Алкогольдегідрогеназна система є головним метаболічним шляхом обміну етанолу, а також інших біологічно важливих алкоголів і альдегідів (ретинол, 3Ь-гідроксистероїди, ■-гідрокси жирні кислоти і 4-гідроксиноненал). Показано існування інших ферментів, що забезпечують окислення алкоголю, проте, їх внесок у утилізацію етанолу є відносно невеликим. Оскільки біля 10% алкогольдегідрогенази міститься в печінці, перша стадія окислення алкоголю протікає, головним чином, у цьому органі [2].
Алкогольдегідрогеназа (алкоголь: НАД
оксидоредуктаза, К.Ф.1.1.1.1) каталізує окислення спиртів і ацеталей до альдегідів і кетонів. Сьогодні виявлено 6 класів АДГ [3]. У випадку етанолу, продуктом першої стадії його окислювання, що каталізується цим ферментом, є оцтовий альдегід СН3СОН. Крім того, відомо, що принаймні один із ізозимів АДГ I (уу) здатний каталізувати реакцію дисмутації, у результаті якої можливо окислювання ацетальдегіду до ацетату. Важливість цього останнього процесу при фізіологічних концентраціях етанолу й ацетальдегіду значна. Проте при надходженні великих кількостей етанолу ззовні більша частина ацетальдегіду окислюється альдегіддегідрогеназою (АлДГ).
АлДГ відіграє головну роль при перетворенні ацетальдегіду - першого метаболіту етанолу як при нормальних умовах, так і при хронічній алкогольній інтоксикації. Крім того цей фермент володіє широкою субстратною специфічністю, існує в множинних молекулярних формах, що різняться своїми властивостями та клітинною локалізацією.
Альдегіддегідрогеназа задіяна у численних біохімічних перетвореннях, і участь в утилізації
оцтового альдегіду в результаті введення в організм алкоголю відриває значну частину цього ферменту від здійснення біологічно необхідних реакцій, що призводить до порушення нормального функціонування багатьох органів.
Функціонування ферментної системи АДГ/АлДГ визначає не лише швидкість метаболізму етанолу, а і формування алкогольної залежності в цілому.
Сьогодні відомо, що розвиток алкогольної інтоксикації супроводжується дефіцитом цинку у ряді органів. Для корекції цинкових дефіцитів використовують солі цинку, серед яких низькою токсичністю характеризується оцтовокислий цинк [4,5]. Актуальним і перспективним є дослідження можливості застосування зазначеної сполуки для корекції метаболічних уражень, які виникають під час розвитку алкоголізму, що може бути основою розробки нових лікувальних протиалкогольних засобів.
Сьогодні при дослідженні можливих механізмів впливу алкоголю на організм в основному використовують моделі хронічної алкоголізації з примусовим споюванням тварин. Однак більш наближеними до реальної ситуації є моделі формування алкогольної залежності з можливістю вільного вибору тваринами етанолу.
Тому метою даної роботи було дослідження активності алкоголь- та альдегіддегідрогеназ печінки щурів з алкогольною залежністю за дії оцтовокислого цинку.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
У роботі дотримувались міжнародних рекомендацій про проведення медично-біологічних досліджень з використання тварин згідно Європейської конвенції.
Дослідження проводили на щурах (самцях) лінії Вістар масою 180-200 г, що утримувались на стандартному раціоні віварію з вільним доступом до води. Алкогольна залежність у тварин в хронічному експерименті формувалась в умовах вільного вибору між 15 % розчином етанолу та водою протягом 2 місяців [6]. Алкогольну залежність формували за наступною схемою: кожну тварину поміщували в окрему клітку з 2 пляшечками: з водою та 15 % розчином етанолу. Кожної доби протягом місяця проводили вимірювання кількості випитого етанолу. Через місяць після початку експерименту тварин розподіляли на 3 групи. До групи щурів з сформованою алкогольною залежністю відносили тварин, у яких споживання етанолу протягом доби становило 2 мл та більше. Групу щурів з
сформованою алкогольною залежністю ділили на 2 підгрупи: одна продовжувала споживати алкоголь, іншій додатково протягом останнього місяця вводили оцтовокислий цинк в дозі 20 мг на 1 кг маси тварини перорально [7]. Через 2 місяці після початку експерименту тварин декапітували. Про активність
АДГ і АлДГ судили за кількістю утвореного НАДН+Н+, що визначається спектрофотометрично по збільшенню екстинції при довжині хвилі 340 нм [8]. Статистичну обробку результатів проводили з використанням 1-критерію Стьюдента при Р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Результати експериментальних та клінічних досліджень дозволяють говорити про те, що в механізмі розвитку алкогольної інтоксикації важливу роль відіграють порушення вмісту мікроелементів у органах та тканинах хворих. Відомо, що печінка є основним органом біотрансформації етанолу і також відіграє ключову роль у метаболізмі цинку, що є одним з найважливіших ессенціальних мікроелементів, який потрібний для нормального функціонування клітини [9]. Цинк входить до складу білків, що беруть участь у генній експресії та метаболізмі нуклеїнових кислот, а відповідно і усіх процесів клітинного росту та диференціації. Цинк є структурним компонентом біологічних мембран, клітинних рецепторів, протеїнів, входить до складу більш чим 200 ензиматичних систем [10].
Нами було визначено вміст цього мікроелементу у сироватці крові щурів з алкогольною залежністю та за умов введення оцтовокислого цинку. Було показано, що алкогольна залежність призводить до зниження вмісту цинку на 40 % у сироватці крові щурів у порівнянні з контрольними показниками. Введення оцтовокислого цинку протягом місяця за умов сформованої алкогольної залежності приводить до зникнення дефіциту та підвищення вмісту цього мікроелементу на 20 % у порівнянні з контрольними значеннями (рис.1).
4.5 4
3.5
І з
І 2,5 £ 2 І 1,5 1
0,5 0
К Етанол
Рис. 1. Вміст цинку в сироватці крові щурів з алкогольною залежністю за умов введення оцтовокислого цинку (п=10). Примітка: * - р<0,05.
Таким чином, нами встановлено, що формування алкогольної залежності супроводжується зниженням вмісту цинку у сироватці крові щурів. Введення оцтовокислого цинку приводить не лише до ліквідації утвореного дефіциту, а і до накопичення цього елементу.
Щоб оцінити можливий протекторний ефект оцтовокислого цинку за досліджуваної патології нами
Чайка В.О., Харченко О.І., Богун Л.І., Остапченко Л.І.
було вивчено активність основних ферментів метаболізму етанолу - алкогольдегідрогенази та альдегіддегідрогенази в клітинах печінки щурів з алкогольною залежністю за дії оцтовокислого цинку.
У результаті досліджень нами було встановлено, що за умов сформованої алкогольної залежності активність АДГ у клітинах печінки знижується майже удвічі у порівнянні з контрольними показниками. Введення оцтовокислого цинку нативним тваринам суттєво не змінює досліджуваний показник, тоді як 30-денне введення препарату щурам з алкогольною залежністю приводить до триразового підвищення активністі АДГ у порівнянні з контрольними показниками (рис.2).
Рис. 2. Активність АДГ печінки щурів з алкогольною залежністю за умов введення оцтовокислого цинку (п=10). Примітка: * - р<0,05.
При дослідженні активності АлДГ в клітинах печінки нами було встановлене різке майже триразове зниження активності ензиму у клітинах печінки щурів з алкогольною залежністю. Введення оцтовокислого цинку на фоні сформованої алкогольної залежності приводить до підвищення активності ферменту, що наближалась до контрольних значень (рис.3).
Рис. 3. Активність АлДГ печінки щурів з алкогольною залежністю за умов введення оцтовокислого цинку (М±т, п=10).
Примітка: * - р<0,05.
Відомо, що реакція, яка каталізується
алкогольдегідрогеназою: етанол + НАД+ о
ацетальдегід + НАДН + Н+ характеризується
положенням рівноваги, що при концентраціях етанолу, близьких до фізіологічних, зміщена вліво. Це відображає детоксикуючу дію АДГ по відношенню до ацетальдегіду, що постійно утворюється при багатьох метаболічних процесах.
При хронічній алкогольній інтоксикації при дозах, що не викликають значного сп’яніння, рівновага реакції зміщується вправо. АДГ I і IV стають генераторами ацетальдегіду, який поступово накопичується у організмі, що у свою чергу призводить до зростання активності наступного ферменту метаболізму етанолу - АлДГ. Однак тривала алкоголізація не викликає індукції синтезу досліджуваних ферментів. Показане нами зниження їх активності у щурів з алкогольною залежністю можна пояснити з наступних позицій.
Відомо, що за умов хронічної алкоголізації відбувається більш виражене зниження активності АлДГ у порівнянні з АДГ, що було підтверджено нами (рис. 2,3). У результаті відбувається
накопичення ацетальдегіду - проміжної сполуки у катаболізмі етанолу. Цей високореактивний метаболіт здатний модифікувати аміно-, БИ-, імідазольні групи амінокислот різних білків з утворенням ацетальдегідних аддуктів. Таким чином, ацетальдегід виступає в ролі потужного модифікатора білків, змінюючи їх просторові характеристики, у результаті чого пошкоджуються ряд ензимів, надмолекулярних утворень, мембран і т. п., індукує різноманітні патологічні процеси [11].
В літературі показано, що інгібіторами АДГ є сполуки, що зв'язують цинк або взаємодіють з БИ-групами. Подібну дію показано для 8-оксихіноліну, фенатроліну, етилендиамінтетраоцтової кислоти, біпіридину, 4-метилпіразолу, меркаптоетанолу
[12,13]. Тому виявлене нами зниження активності досліджуваного ферменту можливо відбувається внаслідок зазначеної деградації клітинних структур через накопичення вмісту проміжного продукту метаболізму етанолу - ацетальдегіду, що здатен модифікувати БИ-групи АДГ.
Додатковим фактором зниження активності АДГ може бути накопичення ацетальдегідних аддуктів, що лежить в основі утворення аутоантитіл до АДГ I при тривалому споживанні етанолу. Було показано, що в дослідах на щурах невисокі, але достовірні титри аутоантитіл до АДГ виявляються після 4-6-го тижня алкоголізації. Можливо, модифікована ацетальдегідом АДГ сприймається імунною системою як гетерогенний антиген.
В нормі активність АлДГ прямо пропорційна кількості субстрату, що окислюється, тому при з більшенні концентрації ацетальдегіду автоматично збільшується активність АлДГ, внаслідок чого утворений ацетальдегід не встигає спричинити який-небудь патологічний ефект. Однак ацетальдегід є не менш активною у хімічному відношенні сполукою, ніж етанол. Особливий інтерес представляє його здатність дуже легко реагувати з аміногрупами амінів
взагалі і біогенних амінів зокрема. В останньому випадку можливе утворення тетрагідроізохінолінових похідних (ТГІХ), що відносяться до групи ендогенних морфіноподібних речовин (ендорфінів). Це може відбуватися двома шляхами: ацетальдегід може вступати прямо у реакцію з дофаміном (реакція Пікте-Спенглера) з утворенням сальсолінолу; під впливом ацетальдегіду може утворюватися тетрогідропапаверолін (ТГП). У нормі з дофаміну спочатку утворюється 3,4-диоксифенілацетальдегід і потім 3,4-диоксифенілоцтова кислота. Останнє перетворення відбувається при активній участі АлДГ, оскільки цей фермент не є високоспецифічним, він окислює усі альдегіди, включаючи і ацетальдегід. При зростанні концентрації ацетальдегіду після прийому екзогенного етанолу частина АлДГ іде на окислення його збільшених кількостей, наслідком чого є автоматичне збільшення концентрації недо-окисленого 3,4-диоксифенілацетальдегіду, молекули якого здатні вступати в реакцію з дофаміном і утворювати ТГП.
Сальсолінол і ТГП володіють морфіноподібною активністю і є крім того субстратами для утворення інших, ще активніших морфіноподібних сполук. Саме ці речовини діють на опіатні рецептори гіпоталамічного "центру задоволення", індукуючи ейфорію при прийомі алкоголю і формують патологічну схильність до нього [14]. Виявлене нами більш виражене зниження активності АлДГ у порівнянні з АДГ у печінці щурів з алкогольною залежністю, може призводити до накопичення ацетальдегіду. Цей факт, згідно з вищезазначеним, може бути ще одним підтвердженням сформованої алкогольної залежності.
Встановлене нами зростання активності зазначених ензимів за дії оцтовокислого цинку у щурів з алкогольною залежністю може бути поясненим необхідністю цього металу для
нормального функціонування ферментів.
Алкогольдегідрогенази ссавців (алкоголь-
НАД+оксидоредуктази) є димерами, що складаються з субодиниць із молекулярною масою близько 40000 й містять іон 2п2+. У кожної субодиниці є області, що беруть участь в утворенні центрів зв’язування субстрату й коферменту - НАД. Кожна з них побудована з двох доменів, на межі яких міститься глибока «кишеня», обмежена гідрофобними
амінокислотними залишками. На її «дні» локалізований атом цинку, зв’язаний із двома залишками цистеїну й одним залишком гістидину, що знаходяться відповідно у положеннях 46, 174 й 57 субодиниці, а також з Н2О. Окрім того, цинк є необхідним для олігомеризації ферменту, що є необхідною умовою його високої ферментативної активності.
Показана необхідність цього мікроелементу для нормального функціонування наступного ферменту цієї системи метаболізації етанолу - АлДГ, в складі активного центра якої виявлено два атоми цинку.
Окрім безпосереднього впливу на структуру ензимів, цинк може проявляти і опосередкований вплив на їх функціонування. Так, у попередніх роботах нами було показано зниження прооксидантного статусу клітин за його введення за умов хронічної алкогольної інтоксикації [15]. Це може призводити до зниження рівня окисних модифікацій білків та слугувати однією з причин встановлених нами змін активності досліджуваних ферментів.
Нами показано, що формування алкогольної залежності супроводжується дефіцитом цинку, що узгоджується з зниженням активності АДГ та АлДГ, тоді як встановлене нами накопичення цього мікроелементу за умов введення досліджуваної сполуки супроводжується зростанням активності ензиму, що може слугувати доказом на користь можливої протекторної дії досліджуваного засобу.
ВИСНОВКИ
У щурів з сформованою алкогольною залежністю спостерігається дефіцит цинку у сироватці крові, що супроводжується зниженням активності АДГ та АлДГ у клітинах печінки. Введення оцтовокислого цинку за умов цієї патології приводить не лише до ліквідації дефіциту цього мікроелементу, а і до подальшого накопичення цинку у сироватці крові. Водночас спостерігається підвищення активності
алкогольдегідрогеназної системи катаболізму етанолу у печінці, що дає підстави для подальших досліджень оцтовокислого цинку як потенційного лікувального засобу за умов хронічного алкоголізму.
Література
1. Kushnir E.A. Polyoxidonium in the immunological correction of alcoholic motivation // Immunology. - 2004. -Vol. 2. - Р. S7.
2. Litten R.Z. Pharmacotherapies for alcohol problems: a review of research with focus on developments since // Alcohol Clin Exp Res. - 199б. - Vol. 20. - Р. б59-бУб.
3. Xie P., Parsons S.H., Speckhard D.C. et. al X-ray structure of human class IV sigmasigma alcohol dehydrogenase. Structural basis for substrate specificity // J. Biol. Chem. -199У. - Vol. 2У2. - P. 1S55S-1S563.
4. Котеров А.Н., Шилина Н.М. Влияние цинк-металлотионеина на перекисное окисление липидов в плазме крови и в печени мышей при острой алкогольной интоксикации // Укр. биохим. журн. - 1995. - Т. бУ, №4.
- С. S0-S7.
5. Павлович Л.В. Біологічна дія оцтовокислих кальцію, кобальту і цинку та їх гігієнічне нормування в атмосферному повітрі населених місць: автореф. дис. на здобуття наук. ступеня канд. біол. наук: спец. 14.02.01 «Гігієна» - Київ, 2000. - 1S с.
6. Харченко Н.К. Роль изменений функциональной активности катехоламиновой и опиатной систем в механизме формирования и развития алкогольной зависимости // Архив психиатрии. - 199S. - №1(1б). -С.12З-Ш.
У. Ещенко Ю.А. Вміст цинку в клітинах при різних функціональних станах інсулярного апарата
Чайка В.О., Харченко О.І., Богун Л.І., Остапченко Л.І.
підшлункової залози: автореф. дис. на здобуття наук. ступеня канд. біол. наук: спец. 03.00.13 «Фізіологія людини і тварин». - Київ, 2004. - 19 с.
S. Skursky L., Kowaz I., Stachova M. A Sensitive photometric assay for alcohol dehydrogenase activity in blood // Serum analyt. biochem. - 19У9. - Vol. 99. - P. б5-У1.
9. Кудрин А.В., Жаворонков А.А. Роль микроэлементов и кальция в регуляции апоптоза // Успехи современной биологии. - 199S. - Т. Ш, № 5. - С. б23-б29.
10.Гуртовенко В.М., Проскурякова Т.В., Шумалов И.Н., Кудрявцев Р.В. Влияние цинка на показатели окисления и характер потребления этанола при алкогольной интоксикации в эксперименте // Патол. физиол. и экспер. терапия. - 19SS. - №2. - С. 5S-61.
11.Зимин Ю.В., Сяткин С.П., Березов Т.Т. Надмолекулярная регуляция активности некоторых оксидоредуктаз клетки
в норме и патологии // Вопросы медицинской химии. -2001. - №3. - С.
12.Schindler J.F., Berst K.B., Plapp B.V. Inhibition of human alcohol dehydrogenases by formamides // J. Med. Chem. -199S. - Vol.41. - Р.1696-1701.
13Xie P., Parsons S.H., Speckhard D.C., Bosron W.F., Hurley T.D. X-ray structure of human class IV sigmasigma alcohol dehydrogenase. Structural basis for substrate specificity // J. Biol. Chem. - 199У. - Vol.272.
- Р. 1S55S-1S563.
14.Анохина И.П. Лекции по наркологии // М. - 2001. - С. 13-32.
15Харченко О.І., Чайка В.О., Гайда Л.М., Богун Л.І., Остапченко Л.І. Активність глутатіон-трансферази в різних органах щурів за умов хронічної алкогольної інтоксикації при впливі оцтовокислого цинку // Медична хімія. - 2009. - Т.11, №4. - С.44-51.
ВЛИЯНИЕ УКСУСНОКИСЛОГО ЦИНКА НА АКТИВНОСТЬ АЛКОГОЛЬ- И АЛЬДЕГИДДЕГИДРОГЕНАЗЫ ПЕЧЕНИ КРЫС С ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ЗАВИСИМОСТЬЮ
Чайка В.А., Харченко О.И., Богун Л.И., Остапченко Л.И.
Резюме: алкогольная зависимость сопровождается снижением активности основных ферментов метаболизма этанола -алкоголь- и альдегиддегидрогеназы клеток печени. Введение уксуснокислого цинка приводило к нормализации дефицита цинка, который развивался на фоне алкогольной зависимости, с его дальнейшим накоплением в сыворотке крови и росту активности исследуемых ферментов.
Ключевые слова: этанол, уксуснокислый цинк, сыворотка, гепатоциты, АДГ, АлДГ, алкогольная зависимость.
ACETIC ZINC INFLUENCE ON ALCOHOL- AND ALDEHYDE DEHYDROGENASE ACTIVITY IN LIVER OF RAT WITH ALCOHOLIC DEPENDENCE
Chayka V.O., Kharchenko O.I, Bogun L.I., Ostapchenko L.I.
Alcoholic dependence is accompanied by decrease in activity of the basic ethanol metabolism enzymes - alcohol/aldehyde dehydrogenase. Acetic zink influence led to normalisation of zinc deficiency, which developed against alcoholic dependence, with its further accumulation in whey of blood and to increase of investigated enzymes activity.
Key words: ethanol, acetic zinc, whey, liver, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, alcoholic dependence.
