CC BY
63
УДК 577.15.03.04
ВПЛИВ НЕЗБАЛАНСОВАНОГО ХАРЧУВАННЯ ТА ПЕРЕКИСУ ВОДНЮ НА ПРООКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНИЙ БАЛАНС У ГЕПАТОЦИТАХ МОЛОДИХ ТА
СТАРИХ ЩУРІВ
Дана робота виконана в межах планової науково-дослідної роботи, № держреєстрації 010би001581.
Певною кількістю дослідників встановлено, що тривале застосування незбалансованих за вмістом тваринних білків і вітамінів антиоксидантного ряду дієт призводить до збільшення швидкості генерації активних форм кисню (АФК) та збільшення інтенсивності перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), яке може бути пов’язаним зі зниженням інтенсивності синтезу білків-ферментів, зокрема ферментів антиоксидантної системи [4, 6, 13]. Зміни прооксидантно-антиоксидантного статусу тварин за використання такої дієти протилежні змінам, які спостерігаються при застосуванні калорійно обмеженого раціону, та в деякій мірі відповідають особливостям змін інтенсивності вільнорадикального окислення та стану ферментативної антиоксидантної системи у дуже старих тварин [11]. Подальші дослідження у цьому напрямку мають велике значення, оскільки результати багатьох науковців свідчать, що, з одного боку, сучасний фактичний раціон населення України характеризується дефіцитом тваринного білку, вітамінів та мікроелементів [7], а, з іншого -харчування є одним із найважливіших факторів, які визначають резерви здоров’я, працездатності та стійкості організму до екологічно шкідливих виробництв та умов середовища проживання [1, 2, 8].
Раніше отримані нами дані щодо більш вираженої стресорної дії одноразового у-опромінювання на щурів, які утримувались на незбалансованій за вмістом тваринних білків і вітамінів-антиоксидантів дієті, пояснювались головним чином зниженням надійності ферментативної антиоксидантної системи та, особливо, Se-залежної глутатіонпероксидази (ГП) [6, 13]. В зв’язку з цим уявлялося доцільним вивчити зміни прооксидантно-антиоксидантного балансу за умов дії перекису водню, який, з одного боку, є загально визнаним фактором розвитку окислювального стресу, а, з іншого боку, стресорний вплив якого обмежується в першу чергу функціонуванням Se-залежної ГП. Можна було б очікувати, що Н2О2 призведе до більш вираженої активації ПОЛ у тканинах щурів, які утримуються на незбалансованій дієті.
Метою роботи було визначення впливу незбалансованого харчування та перекису водню на прооксидантно-антиоксидантний баланс у гепатоцитах молодих та старих щурів.
Матеріал та методи дослідження. В ро6оті використовували щурiв-самцiв лінії Вістар 5- і 20-місячного віку, яких вирощували та утримували у віварії. Маніпуляції з тваринами проводили відповідно до Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних і наукових цілей (Страсбург, 1986 р.). Експериментальні тварини 3- і 18-місячного віку були поділені на 2 групи по 7 тварин в кожній. Перша група молодих та старих тварин одержувала протягом 60 днів стандартний раціон харчування віварію. Інша група протягом такого ж терміну отримувала недостатній за вмістом тваринних білків і вітамінів антиоксидантного ряду раціон, який моделювали шляхом виключення з дієти м’ясної добавки, проварюванням олії (+1800 С, 3 години) і зернової суміші з овочами (+1000 С, 1 година) [6, 9]. Гепатоцити одержували неферментативним методом як описано [10]. Життєздатність клітин після виділення складала не менше 80 - 85% (тест із забарвленням трипановим синім).
Окислювальний стрес в ізольованих гепатоцитах молодих та старих щурів, які утримувались на стандартній та незбалансованій дієтах, моделювали шляхом додавання в реакційне середовище, яке містило 250 мМ сахарози, 5 мМ К□, 0,4 мМ KH2PO4, 0,5 мМ Na2HPO4, 1 мМ MgSO4, 1,5 мМ CaCl2 і 2,5106/мл клітин, H2O2 в концентрації 0,5 мМ. Тривалість інкубації - 30 хвилин. Температура - 370С.
Швидкість генерації О2--радикалів ізольованими гепатоцитами визначали спектрофотометрично в описаному вище середовищі з 50 мкМ нітротетразолієвого синього. Швидкість генерації О2- виражали в пмоль формазану за 1 хв на 106 клітин з урахуванням коефіцієнту молярної екстинкції 7,2103 М-1см-1 при 560 нм. Вимірювання вмісту гідроперекисів ліпідів (ГПЛ) у гепатоцитах проводили за методом Ohkawa et аі. [12]. Вміст ГПЛ розраховували в еквівалентній кількості малонового діальдегіда (МДА), приймаючи коефіцієнт молярної екстинкції рівним 1,56105 М-1см-1, на 106 клітин. Глутатіонпероксидазну активність (КФ 1.11.1.9) визначали у гепатоцитах спектрофотометрично при 340 нм як описано [5]. Активність виражали в нмоль NADPH/хв на 106 клітин з урахуванням коефіцієнту молярної екстинкції 6,22103 М-1см-1.
Статистичну обробку результатів було проведено за допомогою комп’ютерного пакета програм “Statistika V.6” з використанням ^ритерія Ст'юдента. Достовірно різними вважались результати при Р < 0,05.
Результати дослідження та їх обговорення. При вивченні вмісту ГПЛ в ізольованих гепатоцитах встановлено, що у відповідь на незбалансовану дієту рівень цих продуктів ПОЛ у молодих щурів вірогідно зростав на 30,7% (табл. 1). Аналогічні дані одержано і для гепатоцитів старих щурів. Однаковий ступінь зростання вмісту ГПЛ у гепатоцитах 5- та 20-місячних щурів у відповідь на незбалансовану за вмістом тваринних білків і вітамінів-антиоксидантів дієту в певній мірі узгоджується з раніше отриманими нами даними, які були одержані на ізольованих мітохондріях печінки [6].
Таблиця 1
Вплив Н2О2 на вміст гідроперекисів ліпідів в ізольованих гепатоцитах молодих та старих щурів за умов стандартної та незбалансованої дієт (нмоль МДА/106 клітин; п = 6 - 7)
Вік, міс. Варіанти дієти та досліду
Стандартна дієта Незбалансована дієта
нативні гепатоцити гепатоцити + Н202 нативні гепатоцити гепатоцити + Н2О2
5 0,296 ± 0,027 0,387 ±0,031 ** 0,387 ±0,017 * ** 0,611 ±0,034
20 0,323 ±0,017 0,411 ±0,029 0,383 ±0,011 0,558 ± 0,025
Примітки: * - Р < 0,05 у порівнянні зі значеннями для нативних гепатоцитів; ** - Р < 0,05 у порівнянні зі значеннями за умов стандартної дієти.
За умов стандартного раціону моделювання окислювального стресу шляхом інкубації ізольованих гепатоцитів з Н2О2 призводило до значного зростання вмісту ГПЛ у порівнянні з нативними гепатоцитами - на 31,7% у 5-місячних та на 27,2% у 20-місячних щурів (табл. 1). Моделювання окислювального стресу в гепатоцитах щурів, які отримували незбалансований раціон харчування, призводило до ще більш вираженого зростання вмісту ГПЛ. Так рівень цих продуктів ПОЛ в гепатоцитах 5-місячних щурів збільшувався на 57,9%, а в гепатоцитах 20-місячних щурів - на 45,7% у порівнянні з відповідними значеннями для нативних гепатоцитів.
Отримані раніше дані щодо значного зростання вмісту продуктів ПОЛ у відповідь на незбалансовану дієту та, особливо, у відповідь на окислювальний стрес, що був викликаний одноразовим у-опромінюванням, пояснювались збільшенням інтенсивності генерації АФК у редокс-ланцюгах мітохондрій і мікросом печінки [6, 13]. В зв’язку з цим у даній роботі було вивчено інтенсивність генерації О2--радикалів в ізольованих гепатоцитах молодих і старих щурів за умов стандартної та незбалансованої дієт. При використанні незбалансованого раціону вихід супероксидного радикалу з гепатоцитів при їх інкубацій з Н2О2 виявляв лише тенденцію до зростання у молодих щурів, а у старих щурів був вірогідно вище, ніж за умов використання стандартної дієти (табл. 2). Виявлене зростання концентрації продуктів вільнорадикального окислення біомолекул за умов використання незбалансованого раціону та стресорного навантаження може пояснюватися не тільки підсиленням генерації АФК, а і зниженням активності антиоксидантних ферментів. Наведені в табл. 3 дані свідчать, що в гепатоцитах старих щурів незалежно від виду використаної дієти Se-залежна ГП активність була вірогідно вище, ніж у молодих тварин. Це добре узгоджується з даними, отриманими нами раніше при вивченні рівню цієї активності в мітохондріях та цитозолі печінки [3]. У відповідь на незбалансовану дієту в нативних гепатоцитах щурів обох вікових груп спостерігається вірогідне зниження активності Se-залежної ГП (на 48,1% та 39,6% у молодих і старих щурів відповідно).
Таблиця 2
Вплив Н2О2 на інтенсивність генерації О2--радикалу гепатоцитами молодих і старих щурів за умов стандартної та незбалансованої дієт (пмоль формазану/хв-106 клітин; п = 6 - 7)
Вік, міс. Варіанти дієти
стандартна дієта незбалансована дієта
5 68,1 ±6,8 94,1 ±11,3
20 56,5 ±5,7 108,2 ±22,4
Примітка. * - Р < 0,05 у порівнянні зі значеннями за умов стандартної дієти.
В проведених дослідженнях не виявлено вікових змін Se-незалежної ГП активності в гепатоцитах щурів за умов використання будь-якої дієти (табл. 3). Не встановлено також впливу виду обраної дієти на дану активність в нативних гепатоцитах щурів обох вивчених вікових груп.
Таблиця 3
Бв-залежна та Se-незалежна глутатіонпероксидазна активності в ізольованих _________гепатоцитах молодих та старих щурів (нмоль МДА/106 клітин; п = 6 - 7)______________
Вік, міс. Варіанти дієти
станда ртна дієта незбалансована дієта
Se-залежна ГП Se-незалежна ГП Se-залежна ГП Se-незалежна ГП
5 64,4 ± 12,2 60,4 ±4,5 33,4 ±6,6 56,8 ±4,9
20 115,8 ± 15,2 64,5 ±8,4 70,0 ± 14,4 71,8 ±5,8
Примітки: * - Р < 0,05 у порівнянні зі значеннями за умов стандартної дієти; ** - Р < 0,05 у порівнянні зі значеннями у молодих тварин.
Одержані в роботи результати свідчать, що у відповідь на окислювальний стрес, спричинений Н2О2, активація вільнорадикального окислення біомолекул у гепатоцитах щурів, раціон харчування яких був незбалансованим, була істотно вище, ніж у щурів, які утримувались на стандартній дієті. Більш виражена активація ПОЛ у гепатоцитах піддослідних щурів пояснювалась головним чином зниженням активності Se-залежної ГП. Таке порушення прооксидантно-антиоксидантного балансу в гепатоцитах піддослідних тварин може бути основною причиною передчасного старіння, в зв’язку з чим і потребує антиоксидантної корекції.
1. Радиопротекторное питание: современное состояние проблемы. Сообщение 2 / Ванханен В.В., Козярин И.П., Циприян В.И. и др. // Укр. мед. часопис. - 2003. - № 1 (33). - I/II. - С. 53 - 59.
2. Корзун В.М., Сагло В.І., Парац А.М. Харчування в умовах широкомасштабної аварії та її наслідків // Укр. мед. часопис. - 2002. - № 6 (32). - I/II. - С. 99 - 104.
3. Природные антиоксиданты (биотехнологические, биологические и медицинские аспекты) / Кричковская Л.В., Донченко Г.В., Чернышов С.И., Никитченко Ю.В., Жуков В.И. - Харьков: ОАО "Модель Вселенной", 2001. - 376 с.
4. Кулкыбаев Г.А. Влияние факторов питания на перекисное окисление липидов в микросомах крыс разного возраста // Вопросы питания. - 1992. - № 4. - С. 53 - 55.
5. Ланкин В.З., Гуревич С.М. Ингибирование переокисления липидов и детоксикация липоперекисей защитными ферментными системами при экспериментальном злокачественном росте // Докл.АН СССР,- 1976,- Т.226, N 3,- С.705 - 708.
6. Влияние у-излучения и алиментарных факторов на прооксидантно-антиоксидантную систему печени и крови крыс / Ю.В. Никитченко, В.И. Падалко, В.Н. Ткаченко В.Н. и др. // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2008. - Т. 48, № 2. - С. 171 - 176.
7. Передерий В.Г. Витамины и минералы в жизни человека вообще и среднестатистического жителя Украины в частности // Здоровье и питание. - 1998. - № 1. - С. 3 - 5.
8. Тутельян В.А. Стратегия разработки, применения, оценки эффективности биологически активных добавок к пище // Вопросы питания. - 1996. - № 6. - С. 3 - 11.
9. Воздействие различных пищевых факторов на процессы перекисного окисления липидов в микросомах печени крыс / А.И. Феоктистова, А.Н. Мартинчик, Г.И. Бондарев, В.С. Зилова // Вопросы питания. - 1988. - № 5. - С. 46 - 51.
10. Kravchenko L., Petrenko A., Fuller B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes // Cell Biol. Int. - 2002. - V. 26. - P. 1003 - 1006.
11. Age-related changes of membrane oxidative processes and mitochondria swelling as criteria for search of geroprotectors / Yu.V. Nikitchenko, L.S. Bilostotska, V.I. Padalko et al. // Abstracts of the 2nd European Congress on Biogerontology "From molecules to humans", 25 - 28 августа 2000, г. Санкт-Петербург. -Успехи геронтол. - 2000. - Т. 5. - С. 70.
12. Ohkawa H., Ohahi N., Jadi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction // Anal. Biochem. - 1979. - V. 95, N 2. - P. 351 - 358.
13. Tkachenko V., Nikitchenko Y., Tovstiak V. Prooxidant-antioxidant balance in rats liver microsomes under radiation and alimentar factor influence // Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska, Lublin-Polonia. - 2004. - V. XVII. - N 2. - P. 289 - 291.
ВЛИЯНИЕ НЕСБАЛАНСИРОВАННОГО ПИТАНИЯ И ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА НА ПРООКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНЫЙ БАЛАНС В ГЕПАТОЦИТАХ МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС Попович А.С., Шеремет А.А., Дзюба В.Н., Никитченко Ю.В.
На крысах линии Вистар 5- и 20-месячного возраста исследовано влияние несбалансированного питания и Н2О2 на прооксидантно-антиокси-дантный баланс в изолированных гепатоцитах. Обнаружено, что в ответ на окислительный стресс, вызванный Н2О2, активация свободнорадикального окисления липидов в гепатоцитах крыс при несбалансированной диете была существенно выше. Более выраженная активация перекисного окисления липидов в гепатоцитах подопытных животных объяснялась главным образом снижением активности Se-зависимой глутатионпероксидазы.
Ключевые слова: прооксидантно-
антиоксидантный баланс, перекись водорода, несбалансированное питание, гепатоциты, крысы.
INFLUENCE OF UNBALANCED NUTRITION AND HYDROGEN PEROXIDE ON THE PROOXIDANT-ANTIOXIDANT BALANCE IN HEPATOCYTES OF YOUNG AND OLD RATS Popovich A.S., Sheremet A.A., Dzyuba V.N., Nikitchenko Yu.V.
The influence of unbalanced diet and H202 on the prooxidant-antioxidant balance in hepatocytes of 5- and 20-months old Wistar rats has been studied. It was found that the activation of free radical lipid peroxidation in rats’s hepatocytes in response to the oxidative stress induced by H202 under unbalanced nutrition was essentially higher. More expressed activation of lipid peroxidation in hepatocytes of experimental rats was interpreted as the decrease of Se-dependent glutathione peroxidase activity.
Key words: prooxidant-antioxidant
balance, hydrogen peroxide, unbalanced nutrition, hepatocytes, rats
УДК [543.06:546.9:547.551.2](043.3)
ВПЛИВ КАРБОРЕНУ НА КИСЛОТНО-ЛУЖНУ РІВНОВАГУ КРОВІ ЩУРІВ НА ФОНІ
МЕТАБОЛІЧНОГО АЦИДОЗУ
Робота виконана у рамках науково-дослідної програми Національного фармацевтичного університету „ Фармакологічні дослідження біологічно -активних речовин і лікарських засобів синтетичного та природного походження, їх застосування у медичній практиці" (№ держ. реєстр. 0103и000478).
Діуретики та протизапальні препарати найбільш широко застосовуються в лікувальній практиці [12]. Однак, дані експериментальних досліджень та клінічних спостережень свідчать про те, що діуретики не слід розглядати як абсолютно безпечні лікарські препарати. Вони можуть бути факторами серцево-судинного ризику [5, 8, 15, 16, 17], викликати алергійні реакції, ендокринні зміни в організмі, порушення водно-електролітного гомеостазу [6], кислотно-лужної рівноваги, обмінів вуглеводів та ліпідів, фосфатів, сечової кислоти [7] та інші.
Одним з важливіших умов життєдіяльності організму є постійність концентрації водневих іонів у позаклітинному просторі і клітинах - кислотно-лужний стан або кислотно-лужна рівновага (КЛР). Іншими словами, КЛР - відносна постійність реакції внутрішнього середовища організму, що кількісно характеризується концентрацією водневих іонів (протонів).
