CC BY
83
М1КР0Б10Л0Г1Я
© Сщашенко О. I., Воронкова О. С., Шевченко Т. М., BiHHiKOB А. I. УДК 579. 61:616-078
Сщашенко О. I., Воронкова О. С., Шевченко Т. М., BiHHiKOB А. I.
ВПЛИВ ФАКТ0Р1В СЕРЕД0ВИЩА НА Ф0РМУВАННЯ Б10ПЛ1ВКИ STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS
Дшпропетровський нацюнальний ушверситет ¡м. 0леся Гончара
(м. Дшпропетровськ)
Дана робота е фрагментом НДР «Теоретичн та практичн основи життeдiяльноcтi мiкpобiоцено-3iB, форм взaeмовiдноcин з тваринами i рослина-ми», № держ. реестраци 0112U000192, Д/б тема № 1-262-12.
Вступ. Бюг^вки умовно-патогенних бaктеpiй широко pозповcюдженнi у навколишньому серед-овищi, а саме в оpгaнiзмi людини та тварин. Вщомо, що бaктеpiI, якi входять до складу бiоплiвок бiльш стмк до впливу piзних агресивних фaктоpiв, таких як температура, показники рН тощо з одного боку, та до антибютиюв, як використовують у л^ваны н фекцiй - з Ышого боку [1, 3, 2].
На процес формування бюпгмвок та 1х властивос-тi впливають фактори навколишнього середовища i влacтивоcтi клггин мiкpооpгaнiзмiв. Нaйбiльш важ-ливими факторами середовища юнування е зна-чення рН, концентра^я солей, оcмоляpнicть, парцГ альний тиск, доcтупнicть поживних речовин, а також гщрофобнють повеpхнi розподту фаз, сила та тип руху рщини вiдноcно цieI повеpхнi. ^м того, на бак-теpiaльну адгезт впливають змiни в концентpaцiях кисню, а також деяк отрути та ультрафюлетове ви-пpомiнювaння. Вважаеться, що дiя piзних негатив-них фaктоpiв позитивно впливае на процеси бюптв-коутворення [1, 9, 10].
Одними, з найбтьш вiдомих, формуючих бюптв-ку бaктеpiй е cтaфiлококи [3, 6]. Серед них провщне мюце за здaтнicтю до бiоплiвкоутвоpення та у спри-чинювaннi iнфекцiй, що пов'язан з формуванням бiоплiвок займае S. epidermidis [2, 11].
Метою досл1дження було вивчити вплив piз-них значень киcлотноcтi (рН 4,0-8,0) та концентра-цiй (0,5-3,0 %) моно- та дицукpiв на формування бiоплiвки S. epidermidis у 6-лункових пластикових планшетах.
0б'ект i методи дослщження. Об'ектом до-cлiдження стали 20 бiоплiвкоутвоpюючих штaмiв S. epidermidis, що були видтеы з тхви жiнок, носоглотки, повеpхнi шюри та ран, якi належать до музею кафедри мiкpобiологiI, вipуcологiI та бютехнологп Днiпpопетpовcького нaцiонaльного унiвеpcитету iм. Олеся Гончара.
Формування бiоплiвок проводили за допомогою модифковано! методики [8]: у 6-лунковий планшет вносили 0,4 мл бaктеpiaльноI cуcпензiI, що мютила 1,0Ч106 КУО/мл та помiщaли у термостат (37°С) на 3 год. По™ вносили 1,6 мл поживного середовища та знову помщали у термостат (37°С).
Для визначення ктькос^ життездатних клiтин у cфоpмовaнiй бiоплiвцi з лунок планшету видаляли залишки поживного середовища за допомогою пГ петки та тpичi промивали бiоплiвку iзотонiчним роз-чином (0,5 % NaCl). За допомогою мiкpобiологiчно,i петт бiоплiвку переносили у скляний гомогеызатор з 1,0 мл iзотонiчного розчину. З отримано! бакте-piaльноI суспензп робили розведення та виciв на чашки Петpi з МПА. Через 3 доби визначали юлькють КУО/мл.
Пщ час вивчення впливу piзних значень кислот-ноcтi використовували МПБ з piзними показниками рН, яю знаходились в межах вiд 4,0 до 8,0. Приго-тування поживних середовищ з piзними рН проводили таким чином: 1) для приготування та пщтрим-ки сталос^ середовища використовували МПБ та Na2HPO4- NaH2PO4 буфер (рН 5,8-8,0); 2) фосфат-ний буфер(0,1 М) готували на оcновi одно- та двоза-мiщеного фосфату нaтpiю у piзних cпiввiдношеннях. Середовище з показником рН 4 та 5 готували без додавання буферних розчиыв з комерцмних сухих МПБ згщно до Ыструкцп з використання.
В експериментальних дослщженнях використовували тaкi моно- та дицукри, як: глюкоза, сахароза, лактоза та галактоза, концентра^ями в МПБ вщ 0,5 % до 3,0 %. В якос^ контролю виступав МПБ без додавання цукpiв.
Контролем виступали лунки, в яю вносили МПБ та бaктеpiaльну суспензп, що мicтилa 1,0 Ч 106 клiтин/ мл - контроль бюптвкоутворення. Другим контролем виступало чисте МПБ та iзотонiчний розчину (0,5 % NaCl) - контроль поживного середовища.
Результати дослщжень та Yx обговорення. З наведених на рис. 1 даних можемо зробити висно-вок, що найбтьший пpиpicт ктькос^ клiтин бiоплi-вок вiдбувaвcя при культивуваны у нейтpaльнiй зонi
о и
м
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
9,32
6 7
Значения рН
11 доба
I 2 доба ■ 3 доба
Рис. 1. Формування бюплток £ вр1с1егт1сИз при культивуванш на по живному середовищ1 з р1зними значеннями рН протягом 3 д1б.
Рис. 2. Формування бюпл1вок б ер1с1егт1сИз при культивуванш у по-живному середовищ1 з р1зними концентрацтми цукрт на 3 добу
дослщжень.
Прим1тка: контроль формувався без додавання р1зних концентраций цукрк
рН - кшькють кгмтин складала 2,1Ч109 КУО/мл пюля 3 д\6 культивування.
При цьому рют культури та утворення 6\опл\вки спостер^али як за кислого, так \ за лужного значень рН.
Через 3 доби культивування кшькють клгтин у бю-пл\вц\ штам1в Э. ер1<Сегт1<С1з за рН середовища 5,0 була нижче у 1,90Ч104 раз!в, за рН 6,0 - у 512 раз!в, за рН 8,0 - у 100 раз!в пор!вняно з кшьюстю КУО/мл 6\опл\вок, що формувалися у середовищ! за нейтрального рН. За кислотност середовища 4,0 кшькють клгтин у культур! була нижче у 5,12Ч104 раз!в пор!вняно з контролем.
Особливий ¡нтерес викликае вивчення можли-вих залежностей накопичення бюмаси 6\опл\вок вщ вмюту в поживному середовищ! р!зних моносахари-д\в, як джерела енерги, так \ пластичного матер1алу [10].
Вивчали вплив на формування 6\опл\вок штам1в Э. ер1<Сегт1<С1з р!зних моно- та дицукр!в: глюкози, сахарози, галактози та лактози у концентрац!ях у
поживному середовищ! вщ 0,5 % до 3,0 %. На рис. 2 наведено результати кшькост клггин у б1опл1вках Э. ерКег-т'ав, що формувалися у середови-щах за р!зних концентрацм моно- та дицукр!в на 3 добу доотджень.
Встановлено, що найбшьша кшькють клгтин 6\опл\вки спостер^ала-ся при культивуванн у середовищ! з 2,0 % глюкози, що перевищувало у 26 рази кшькють клмтин у контролг При цьому кшькють КУО у контрольна бю-пл\вц\ складала 9,03Ч109 ктмтин/мл. Концентрац!я глюкози, яка становила 1,5 % також призводила до збшьшен-ня кшькост КУО у б1опл1вц1 у 2,0 рази пор!вняно з контролем. При вм!ст! глюкози у поживному середовищ! 3,0 % вщм1чали пригычення формування 6\опл\вки, так як кшькють клгтин у б!опл!вц!, яка формувалася при вка-занм концентрацп була менше у 564 рази пор!вняно з контролем.
Концентраци глюкози вщ 0,5 % до 1,0 % не викликали значних змш кшь-кост клмтин у 6юпл\вц\ пор!вняно ¡з контролем. Пщ час культивування бю-пл!вок Э. ер1<Сегт1<С1з у середовищах, що мютили рiзнi концентраци iнших дослщжуваних вуглеводiв - сахарози, лактози та галактози, вщбувало-ся зниження вмюту клггин бiоплiвки з пщвищенням концентраци цукр!в.
Нейтрально на формування бю-пл\вки впливала сахароза концентра-ц\6ю в\д 0,5 % до 1,0 %: кшькють клгтин вiдповiдала контрольним показни-кам. Але пщвищення концентраци сахарози у поживному середовищ! до 1,5 % викликало зниження кшькост клитин у 6юпл\вц\ у 11 раз!в пор!вняно з контролем. Подальше пщви-щення вмюту сахарози у середовищ! культивування призводило до поступового зниження кшькост к/И-тин у 6\опл\вкц\ - до 2,0 % - у 158 раз!в, до 2,5 % - у 4,1Ч103 раз!в, до 3,0 % - у 3,25Ч105 раз!в пор!вняно з контролем.
Не спостер!галося змш п\д час культивування 6\опл\вки Э. ер1<егт1<1з у середовищ!, що мютило 0,5 % лактози, але поступове пщвищення концентраци вказаного вуглеводу призводило до зниження вмюту клгтин 6\опл\вки пор!вняно з контролем. Так, пщ час формування 6\опл\вки у середовищ!, що мю-тило 1,0 % лактози, вщбувалося зниження кшькост КУО у 12 раз!в, 1,5 % лактози - у 3,5Ч103 раз!в, 2,0 % - у 1,8Ч104 раз!в, 2,5 % - у 3,9Ч105 раз!в, 3,0 % лактози - у 5,6Ч106 раз!в пор!вняно з контролем.
Аналопчний ефект на формування 6\опл\вки ви-являла галактоза. Пщ час культивування у поживному середовищ!, що мютило 1,0 % галактози, вщбувалося зниження кшькост КУО у 164 раз!в, при вмют
1,5% - у 3,9Ч103 pa3iB, 2,0 % галактози - у 2,0Ч104 раз1в, 2,5 % - у 4,54 1 05pa3iB, 3,0 % галактози - у 7,46Ч106 paзiв поpiвняно з контролем.
Таким чином можна сказати, що найвища бю-маса бiоплiвок була зaфiксовaнa за нейтрального pH, що е близькими до значення pH пpиpоднix осе-pедкiв пеpебувaння штaмiв S. epidermidis. Разом з тим, фоpмувaння бiоплiвки вiдбувaлося пpи piзниx значеннях pH, як кислому, так i слабколужному. Це може pозглядaтися в якост важливо! фiзiологiчноi, особливостi метaболiзму стафтокоюв, що спpияe фоpмувaнню бiоплiвок пpи екстpемaльниx значеннях кислотностi сеpедовищa.
Що стосуеться вивчення впливу piзниx концен-тpaцiй моно- та дицукpiв можна пpипускaти, що поживнi компоненти МПБ повнiстю забезпечують потpеби системи бюсинтезу вуглеводних компо-нентiв бiоплiвки S. epidermidis. Kpiм того, показано [10], що можливо, у бiоплiвкax стaфiлококiв функцг онують меxaнiзми, близью до катабол^но! pепpесi,i
утвоpення бiоплiвок, що знайдено у бaктеpiй деякиx видiв pодини Enterobacteriaceae.
Висновки.
1. Встановлено, що фоpмувaння бiоплiвки S. epidermidis вщбуваеться за кислиx значень pH - 5,06,0 i слaбколужниx pH - 8,0.
2. ^йвищий пpиpiст кiлькостi клiтин у бiоплiвцi спостеpiгaли за pH 7,0 - 2,1Ч109 КУО/мл.
Haйкpaще на фоpмувaння бiоплiвки S. epidermidis впливав вмют у поживному сеpедовищi 2,0 % глюкози - ктькють клiтин пiсля 3 дiб культивування становила 2,3Ч1011 КУО/мл.
Перспективи подальших дослщжень. Остан-нiм часом, Ыфекцм, що пов'язaнi з фоpмувaнням стaфiлококовиx бiоплiвок набули не аби якого pоз-повсюдження. Бiоплiвки xapaктеpизуються висо-ким ступенем стiйкостi до piзномaнiтниx афесив-ниx фaктоpiв сеpедовищa. Тому вивчення впливу на фоpмувaння бiоплiвок piзниx фaктоpiв сеpедовищa дозволить фаще pозумiти пpоцеси, якi лежать в основi pозвитку piзномaнiтниx зaxвоpювaнь.
Л1тература
1. Афиногенова А. Г. Ми^обные биопленки paн: состояние вопpосa / А. Г. Афиногенова, Е. H. Дapовскaя // Тpaвмaтоло-гия и оpтопедия России. - 2011. - Т. 61, № 3. - С. 119-125.
2. Гостев В. В. Бaктеpиaльные биопленки и инфекции / В. В. Гостев, С. В. Сидоpенко // Жуpнaл инфектологии. - 2010. -Т. 2, № 3. - С. 4-15.
3. Kоpобов В. П. Анализ чувствительности пpоцессов фоpмиpовaния биопленок Staphylococcus epidermidis 33 к неко-тоpым фaктоpaм внешней сpеды / В. П. Kоpобов, Л. М. Лемкиа, В. И. Монaxов // Вестник пеpмского унивеpситетa. Сеpия Биология. - 2010. - Вып. 1, № 1. - 59-63 с.
4. Маянский А. H. Стафилококковые биопленки: стpуктуpa, pегуляция, оттоpжение / А. H. Маянский, И. В. Чеботapь // Жуpнaл мифобиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2011. - № 1. - С. 101-108.
5. Hиколaев Ю. А. Биопленка - «гоpод ми^обов» или аналог многоклеточного оpгaнизмa? / Ю. А. Hиколaев, В. К. Плакунов // Ми^обиология. - 2007. - Т. 76, № 2. - С. 149-163.
6. Сидоpенко С. В. Инфекции в интенсивной теpaпии / С. В. Сидоpенко, С. В. Яковлев. - М. : Изд-во Бионика, 2003. -205 с.
7. Смиpновa Т. А. Стpуктуpно-функционaльнaя xapaктеpистикa биопленок / Т. А. Смиpновa, Л. В. Диденко, Р. Р. Азизбекян [и дp.] // Ми^обиология. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 435-446.
8. Тец В. В. Влияние экзогенные пpотеолитическиx феpментов на бaктеpии / В. В. Тец, Г. Ю. Kноppинг, H. К. Аpтеменко [и дp.] // Антибиотики и xимиотеpaпия - 2004. - № 12 - С. 9-13.
9. Karlyshev A. V. Demonstration of polysaccharide capsule in Campylobacter jejuni using electron microscopy / A. V. Karlyshev, M. V. McCrossan, B. W. Wren // Infect. Immun. - 2001. - Vol. 69. - P. 1-13.
10. Zahler J. Transmission electron microscopic study of antibiotic action on Klebsiella pneumoniae biofilm / J. Zahler, S. P. Stewart // Antimicrob. Agents Chemother. - 2002. - Vol. 46. - P. 2679-2683.
11. Wang X. Toxin-antitoxin systems influence biofilm and persister cell formation and general stress response / X. Wang, T. K. Wood // Applied and environmental microbiology - 2012. - Vol. 78. - P. 22.
УДК 579. 61:616-078
ВПЛИВ ФАКТ0Р1В СЕРЕДОВИЩА НА ФОРМУВАННЯ Б10ПЛ1ВКИ STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS
Сщашенко 0. I., Воронкова 0. С., Шевченко Т. М., Вшшков А. I.
Резюме. Встановлено, що фоpмувaння бiоплiвки S. epidermidis вщбуваеться у дiaпaзонi pH 5,0-8,0, пpи pH 4,0 - спостеpiгaли piCT культуpи бiоплiвкоутвоpюючиx штaмiв. ^йвищий пpиpiст ктькост клггин у бю-плiвцi зафксовано за pH 7,0 - 2,1Ч109 КУО/мл.
Haйкpaще на фоpмувaння бiоплiвки S. epidermidis впливав вмют у поживному сеpедовищi 2,0 % глюкози - ктькють кгмтин пюля 3 дiб культивування становила 2,3Ч1011 КУО/мл, що у 25 paзiв пеpевищувaло кiлькiсть клiтин у контpольниx бiоплiвкax. Вмiст сaxapози у поживному сеpедовищi вище, нiж 1,0 %, та галактози i лак-този вище, нiж 0,5 % - викликав пpигнiчення фоpмувaння бiоплiвки.
Ключов1 слова: бiоплiвкa, S. epidermidis, pH, глюкоза, сaxapозa, лактоза, галактоза.
УДК 579. 61:616-078
ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА ФОРМИРОВАНИЕ БИОПЛЕНКИ STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS
Сидашенко О. И., Воронкова О. С., Шевченко Т. Н., Винников А. И.
Резюме. Определено, что формирование биопленки S. epidermidis происходит в диапазоне рН - 5,08,0, при рН 4,0 наблюдали рост культуры биопленкообразующих штаммов. Наибольший прирост количества клеток в биопленке наблюдали при рН питательной среды 7,0 - 2,1Ч109 КОЕ/мл.
Более эффективно на формирование биопленки S. epidermidis влияло содержание в питательной среде 2,0 % глюкозы - количество клеток после 3 суток культивирования составляло 2,3Ч 1011 КОЕ/мл, что в 25 раз превышало количество клеток в контрольных биопленках. Содержание сахарозы в питательной среде выше, чем 1,0 %, а галактозы и лактозы выше, чем 0,5 % - вызвало угнетение формирования биопленки.
Ключевые слова: биопленка, S. epidermidis, рН, глюкоза, сахароза, лактоза, галактоза.
UDC 579. 61:616-078
Effect of Environment Factors on Biofilm-Formation of Staphylococcus Epidermidis
Sidashenko O. I., Voronkova O. S., Shevchenko T. M., Vinnikov A. I.
Abstract. Environmental factors and properties of microbial cells influence the process of biofilms forming and their properties. The most important factors are habitat pH, salt concentration, osmolarity, partial pressure, availability of nutrients and surface hydrophobicity distribution phase, the strength and type of fluid motion relative to the surface.
Staphylococci are the one most known biofilm forming bacteria. Among them the top spot in their ability to biofilm-forming and infections associated with the formation of biofilms occupies S. epidermidis.
Established that biofilm formation by S. epidermidis is acidic pH - 5,0-6,0 and pH 8,0. The largest increase in the number of cells in the biofilm was observed at pH 7,0 - 2,1Ч109 CFU/ml. On the 3 day of cultivation the number of cells in the biofilm of S. epidermidis by pH 5,0 was lower in 1,90Ч104 times, for pH 6,0 - 512 times, for pH 8,0 - 100 times compared to the number CFU/ml biofilms that formed in medium with pH 7,0. Over acidity 4,0 the number of cells in culture was lower in 5,12Ч104 times compared with the control.
Best biofilm formation by S. epidermidis affected content of 2,0 % glucose in the culture medium- number of cells after 3 days of cultivation was 2,3Ч1011 CFU/ml, which is 25 times higher than the number of cells in the control biofilm. The content of sucrose in the culture medium is higher than 1,0 %, and galactose and lactose is higher than 0,5 % - caused inhibition of biofilm formation.
Thus, we can say that the highest biomass of biofilms was recorded by a pH 7,0, which is close to the natural pH of cells stays strains of S. epidermidis. However, biofilm formation occurred at different pH values as acidic and alkaline. This can be seen as an important physiological features of metabolic staphylococci, which promotes biofilms at extreme values of acidity.
As to study the effect of different concentrations of mono- and disaccharides can assume that culture medium fully address the needs of system components carbohydrate to biosynthesis of biofilm of S. epidermidis. Furthermore, it is shown, that may staphylococci in biofilm mechanisms operate close to katabolitic repression biofilms formation that bacteria found in some species of the family Enterobacteriaceae.
Keywords: biofilm, S. epidermidis, pH, glucose, sucrose, lactose, galactose.
Рецензент - проф. Лобань Г. А.
Стаття надшшла 18. 08. 2014 р.
