CC BY
16
© Нагорна О. О., Белешчев I. Ф., Горчакова Н. О., Мазур I. А., Чекман I. С. УДК 616.12-008.331.1:616-092.41-085:615.225.2:615:036.6 1Нагорна О. О., 2Белемчев I. Ф., 1Горчакова Н. О., 2Мазур I. А., 1Чекман I. С.
ВПЛИВ АНГ1ОЛ1НУ НА ПОКАЗНИКИ СИСТЕМИ ОКСИДУ АЗОТУ В М1ОКАРД1 ЩУР1В З ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЮ ХРОН1ЧНОЮ СЕРЦЕВОЮ НЕДОСТАТН1СТЮ
1Нацiональний медичний унiверситет iMeHi О. О. Богомольця (м. Кив) 2Запорiзький державний медичний унiверситет (м. Запорiжжя)
Представлена робота е фрагментом НДР «Екс-периментальне обфунтування комбiнованого за-стосування кардiотропних препара^в», № державно! реестрацiI 0111и009417.
Вступ. Вiдомо, що серцева недостатнють супроводжуеться не тiльки змiнами метаболiзму i функцiй мiокарду, але також ендотелiальною дисфункцiею [11,12].
До ендотелiальноI дисфункцiI веде дисбаланс мiж вазодилятаторами i вазоконстрикторами. Вазо-дилятуючим фактором е оксид азоту, що утворюеть-ся з 1_-арпыну пiд впливом ЫО-синтаз [4,10].
Важливе значення у формуванн ендотелiаль-но! дисфункцiI е пониження початкового рiвня арп-ншу та бiологiчно активного оксиду азоту або його бюдоступностг Ендотелiальна ЫО-синтаза (еЫОБ) присутня в ендотелiальних клггинах i головним чином забезпечуе вазодилятацю В той же час Ыду-цибельна ЫО-синтаза (ИЧОБ) екскретуеться i функц^ онуе при патологiчних станах, пов'язаних з ендоток-синами i прозапальними цитокiнами [2]. Порушення утворення оксиду азоту вщбуваеться паралельно з пониженням рiвня його стабiльних метаболтв та пiдвищення маркеру о кислю вал ьно го стресу - ы-тротирозину [9]. Попередыми дослiдженнями ви-значена пряма ендотелюпротекторна дiя ангiолiну [3].
Непряма кардюпротек^я встановлена у мельдо-нiю завдяки впливу на накопичення гама-бутиробе-ташу i зменшенню iнтенсивностi його втьноради-кально! iнактивацiI [1]. Разом з тим, не проводили порiвняльнi доогмдження впливу прямого та непрямого ендотелюпротектору на показники системи оксиду азоту при експериментальнм хроычнм не-достатностi у щурiв в дозах, яю застосовували в по-переднiх експериментах.
Мета дослiдження - довести вплив анполЫу на показники системи оксиду азоту в мiокардi щурiв з хронiчною серцевою недостатнютю (ХСН).
Об'ект i методи дослщження. Експерименти проведенi на бiлих безпородних щурах-самцях масою 180-200 г, як включали 10 iнтактних тварин, 20 щурiв-самцiв з ХСН, 20 щурiв з ХСН, яким внутрiшньошлунково вводили анполш в дозi 100 мг/кг, 20 щурiв з ХСН, яким внутршньошлунково вводили мiлдронат в дозi 250 мг/кг. Спочатку щурiв утримували в умовах вiварiю протягом
20 дн1в в1дпов1дно до правил, яю були прийнят1 бвропейською конвенц1ею з захисту хребетних тварин, а також Методичних рекомендацм ДЕЦ МОЗ Украши. Хрон1чну серцеву недостатн1сть моделювали за допомогою доксоруб1цину (внутр1шньоочеревинно в кумулятивна доз1 15 мг/кг, подшено'| на 6 ш'екцм протягом 14 дн1в), застосовуючи препарат фiрми «Ебеве», Австрiя. Ангiолiн вводили в дозi 100 мг/кг, а мтдронат в дозi 250 мг/кг внутрiшньошлунково, як було зазначено в попередых дослiдженнях [5].
Тварин виводили з експерименту на 35 добу пщ тюпенталовим наркозом (40 мг/кг). Ендотелюпро-тективну дю оцiнювали за змiнами бiохiмiчних мар-керiв, якi характеризують систему оксиду азоту. По-передньо тканини серця гомогеызували на холодi в сольовому iзотонiчному середовищi (0,15MKCl) при температурi 4°С за допомогою скляного гомогеы-затора у спiввiдношеннi тканина-сольовий розчин 1:40. Безбтковий екстракт одержували додаванням гомогенату тканин серця у хлорну кислоту (0,6 М). Стабтьы метаболiти NO визначали за реакцieю з реактивом Грису при утворенн стмкого забарвленого комплексу, що мае спектрофотометричний максимум поглинання при довжин хвилi 540 нм. Загальну активнють NOS визначали за рiзницею мiж швидюс-тю окиснення NADPH, що рееструеться флюороме-трично в двох паралельних зразках, яю як мютять, так i не мютять, Ыпбггор NOS - N-нiтро-L-аргiнiн [7].
Нггротирозин визначали в цитозольнiй фракци гомогенату серця твердо фазним iмуносорбентним сендвiдж-методом ELISA, ELISAKit (CatNHK501-02) фiрми Hycult Biotech та виражали в нм/г [6]. Вмют L-аргiнiну визначали хроматографiчно, нанося-чи у виглядi смужки на хроматографiчну пластину сумш безбiлкового екстракту серця з пропанолом i концентрованим розчином амiаку. Вийнят з камери пластини висушують на повiтрi i обробляють 1% розчином амоксану в дисетилформалд Забарв-лення плями L-арпншу з'являеться пiсля нагрiвання в термостатi (100°С) протягом 1-2 хв. Пляму вирiзають, елюювали у 3 мл диметилформалщу при нагрiваннi на водянiй банi. Пiсля центрифугування при 3000 г виражають спектрофотометрично при 530 нм [7].
Iнтенсивнiсть експреси шдуцибельно'| NO-синтази (iNOS) та ендотелiальноï NO-синтази
(eNOS) проводили ricToxÎMÎ4Hi дослiдження. Зрiзи серця на 24 години фксували в рщиы Карнуа та за стандартною схемою заливали в блоки парапластом х100, з яких готували зрiзи. iNOS та eNOS надалi видiляли з парапласту, регщрували та за методиками вщмивали фосфорним буфером та шкубували протягом 24 години в волопй камерi з первинними полiклональними антиттами кровi, а пiсля -вщмивання фосфатним буфером з вторинними антиттами кози. Надалi пiсля чотирьохразового вщмивання фосфатним буфером (рН: 7,4) зрiзи вм^ щували в сумiш глщерин-фосфатний буфер (9:1). На флюоресцентному мiкроскопi AxiosKop (Ziess, Germany) визначали штенсивнють лiзоформ NOS за щiльнiстю (iNOS, eNOS-позитивних клiтин) в системi цифрового аналiзу зображення VIDAS-386 (Kontron Electronic Germany) [7].
Достовiрнiсть вiдмiнностей мiж експерименталь-ними групами оцiнювали за допомогою t-критерiю Стьюдента та 1_1-критерт Уiтнi-Манна. Для аналiзу статистично значимими вважали вщмшност при р<0,05.
Результати дослщження та ïx обговорення.
При моделюваннi доксорубщиново'| ХСН при 14-до-бовому введеннi доксорубiцину встановлено, що на 35 добу експерименту пригычуеться процес синтезу оксиду азоту, що при патолопчних станах в мюкар-ду грае ендотелiопротекторну та кардюпротекторну роль. Так, в цитозолi щурiв з ХСН зменшуеться ак-тивнють загально'| NO-синтази на 60% на фон по-ниження продукцп стабтьних метаболiтiв оксиду азоту (нiтратiв) на 58%, дефщиту субстрату синтезу L-аргшшу (на 52,3%). При цьому спостер^аеться зростання вмiсту нiтротирозину на 19%. Паралель-но в зрiзах верхiвки серця у щурiв спостерiгаеться зменшення щiльностi eNOS-позитивних клiтин на 53,2% та пщвищення щiльностi iNOS-позитивних клггин (табл.). Отриманi данi свiдчать про те, що моделювання ХСН пригычуе експресiю eNOS, що бере участь в ендогенних мехаызмах кардюпро-текцп та посилюе експресiю iNOS, яка грае голо-вну роль в реалiзацiï програми нiтрозуючого стресу. В розви-тку феномену iмунозапальноï реакци при ХСН, що е одним з ланцюпв формування ендоте-лiальноï дисфункцiï, виступа-ють в рiзному напрямку змiни експресiï двох лiзоформ NOS-ендотелiальноï (зменшення) та шдуцибельно'| (зростання) [1]. iNOS, на вщмшу вiд eNOS, не потребуе Са2+ та кальмодулiну для свого синтезу та продукуе NO в концентра^ях, як значно перевищують тi концентраций в яких утворюеться пiд впливом eNOS. ^м того, на вщмшу вщ ендотелiальноï, шдуцибель-на NO-синтаза експресуеться лише в патологiчних умовах як вщповщь на активацiю проза-пальними цитокiнами, такими
як фактору некрозу пухлин альфа (TNF-a). Однак молекули NO, що утворюються при сприянн iNOS, пiд впливом активних форм кисню перетворюються в пероксиытрит [9].
NO е нестабiльним радикалом з коротким жит-тям i можливо для його стаб^зацп потрiбнi тiоловi сполуки. Порушення транспорту NO пов'язано з ак-тивацiею лтщно'| пероксидацп, вiльнорадикальних процесiв. При накопиченн активних форм кисню, утвореннi супероксидрадикалу та гщроксирадикалу вони можуть перетворюватися в пероксинiтрит, про що свщчить пiдвищення маркеру пероксинiтриту ы-тротирозину на 193% [8]. При курсовому введены анполшу спостертаеться незначна дiя засобу на ак-тивнiсть загально'| NOS, що зростае на 20% та вмют L-аргiнiну (пiдвищення на 14,7%), що можливо свщчить про непрямий, а опосередкований впливи анполшу, а саме про його антиоксидантну активнють. Адже, як було нами встановлено ранше, анполш по-нижуе окислювальну модифiкацiю бткових молекул, в тому числi ферменпв, зберiгаючи ¡х активнiсть. Це пщтверджуеться результатами гiстохiмiчного анал^ зу, який дозволяе встановити пщвищення щтьнос-т eNOS-позитивних клiтин на 17% та зменшення iNOS-позитивних клiтин на 30%. ^м того, ангiолiн викликае пщвищення рiвня стабiльних метаболiтiв NO на 54,5%, в цитозолi мiокарду тварин з ХСН.
Отриман данi свщчать про те, що ангiолiн попереджае перетворення NO пiд дiею активних форм кисня в пероксинггриту, про що свщчить по-ниження рiвня нiтротирозину на 42%, зберiгаючи його ендотелюпротективы властивостi. Це вiдрiзняе анполш вщ мiлдронату, який в запропонованм дозi не мае достовiрного впливу на показники системи оксиду азоту. Висновки
1. При хроычнм серцевм недостатност в мiокардi щурiв понижуеться активнiсть загально'| NO-синтази на 60%, продук^я стабiльних метаболiтiв оксиду азоту на 58% на фон дефщиту L-арпншу (-52,3%), а пщвищення рiвня нiротирозину на
Таблиця.
Вплив анполшу та мшдронату на показники синтезу, метаболiзму системи оксиду азоту в мiокардi щурiв при хрошчнш серцевiй недостатностi на 35 добу експерименту
Дослщжуваш показники lнтактнi тварини ХСН (контроль) ХСН+ангiолiн, 100 мг/кг ХСН+мтдронат, 250 мг/кг
Загальна NOS, нмоль/мг бтку/хв 36,7+2,31 14,8+1,23* 17,8+1,35** 14,2+1,67*
Щ1льн1сть eNOS-позитивних кл1тин 477,3+21,7 223,1+18,5* 231,2+22,0* 217,2+24,2
Щ1льн1сть iNOS-позитивних ^тин 125,2+16,2 247,8+20,3* 173,7+14,3** 251,3+27,3
Метаболiти NO (нiтрати), мкмоль/г тканини 28,7+2,25 12,1+1,12* 18,7+1,21** 11,8+1,12
Ытротирозин, нмоль/г тканини 21,2+2,11 62,1+4,51 27,1+2,18** 53,1+6,34
L-арпнш, мкмоль/г тканини 12,8+1,4 6,1+0,48* 7,0+0,52** 5,1+0,43
Примггка: *Р<0,05 щодо контролю; **Р<0,05 щодо ХСН.
193%. Спостер^алося зменшення щiльностi eNOS-позитивних клггин на 53,2% та пiдвищення щтьност iNOS-позитивних клiтин на 98%.
2. Курсове введення анполшу збiльшуе щтьнють eNOS-позитивних клiтин на 17% та зменшення iNOS-позитивних клггин на 30%. Достовiрно пщви-щуеться рiвень стабтьних метаболiтiв NO на 54,8%, вмют аргшшу на 14,7%, активнiсть загально'| NOS на
20%, а також понижуеться вмiст нiтротирозину в 2,2 рази.
Перспективи подальших досл1джень.
Подалыш дослiдження повиннi бути спрямованi на визначення впливу анполшу на показники тюл-дисульфщно'| системи в мiокардi щурiв при хронiчнiй серцевiй недостатност^ що взаемопов'язано з системою оксиду азоту.
Л^ература
1. Верткин А.Л. Мельдоний: эффективная точка применения / А.Л. Верткин, Н.О. Ховасова, В.В. Пшеничникова [и др.] // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2013. - № 2. - С. 94-97.
2. Возка Х.1. Ендотелм: функцюнальш властивост та його дисфункщя (огляд лп"ератури з матерiалами власних дослщжень) / Х.1. Возка, В.Д. Москаль, В.Д. Сорохан // КлЫчна та експериментальна патолопя. - 2015. - Т. 14, № 1. - С. 209-214.
3. Горбачева С.В. Механизмы эндогенной нейропротекции при использовании модуляторов тиол-дисульфидной системы в условиях экспериментального нарушения мозгового кровообращения / С.В. Горбачева, И.Ф. Беленичев, Л.И. Кучеренко // Фармаколопя та лкарська токсиколопя. - 2016. - № 1. - С. 23-28.
4. Дзучкоев С.Г Механизмы развития эндотелиальной дисфункции и перспективы коррекции / С.Г. Дзучкоев, И.В. Можаева, Е.А. Такоева [и др.] // Фундаментальные исследования. - 2014. - № 3. - С. 198-203.
5. Нагорна О.О. Вплив анполшу на показники енергетичного обмшу в мiокардi щурiв з експериментальною хрошчною серце-вою недостатнютю / О.О. Нагорна, 1.Ф. Белешчев, Н.О. Горчакова [та ш.] // Актуальш проблеми сучасноУ медицини. Вюник ВДНЗУ «УкраУнська медична стоматолопчна академiя». - 2016. - Т. 26, Вип. 4, № 1. - С. 273-275.
6. Чекман И.С. Тиол-дисульфидное равновесие - определяющий фактор резистентности нейронов к нитрозирующему стрессу в условиях ишемии мозга / И.С. Чекман, Ю.М. Колесник, И.Ф. Беленичев [и др.] // Журнал НАМН УкраУни. - 2013.
- Т. 19, № 1. - С. 3-11.
7. Чекман 1.С. ДоклЫчне вивчення специфiчноУ активной потенцмних лкарських засобiв первинноУ та вторинноУ нейропротекцп. Методичш рекомендацп / 1.С. Чекман, 1.Ф. Белешчев, О.О. Нагорна [та ш.]. - КиУв, 2016. - 92 с.
8. Aviram M. Review of human studies on oxidative damage and antioxidant protection related to cardiovascular disease / M. Aviram // Free Radic. Res. - 2012. - Vol. 33. - P. 85-95.
9. Belenichev I.F. The thiol-disulfide balance and the nitric oxide system in the brain tissue of rats' subjected to experimental acute impraiment of cerebral bloodflow: the therapeutic effects of nootropic drugs / I.F. Belenichev, S.V. Gorbacheva, N.V. Bukhtiyarova // Neurochemical journal. - 2014. - Vol. 8, № 1. - P. 24-27.
10. Ghisi G.L. Physical exrrcise and endothelial dysfunction / G.L. Ghisi, A. Durieux, R. Pinho, H. Benetti // Arg. Bras. Cardiol. - 2010.
- Vol. 95, № 5. - P. 130-137.
11. Gogiraju R. Endothelial p53 deletion improves angiogenesis and prevent cardiac fibrosis and heart failure induced by pressure and overload in mice / R. Gogiraju, X. Xu, M. Bolchenek [et al.] // J. Amheart Assoc. - 2015. - Vol. 4. — doi:10.1161/jaha. 115.01770.
12. Maupoint J. Selective Vascular Endothelial Protection Reduces Cardiac Dysfunction in Chronic Heart Failure / J. Maupoint, M. Besnier, E. Gomez [et al.] // Circ Heart Fail. - 2016. - Vol. 9, e002895. — doi:10.1161/circheartfailure. 115.002895.
УДК 616.12-008.331.1:616-092.41-085:615.225.2:615:036.6
ВПЛИВ АНГ1ОЛ1НУ НА ПОКАЗНИКИ СИСТЕМИ ОКСИДУ АЗОТУ В М1ОКАРД1 ЩУР1В З ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЮ ХРОН1ЧНОЮ СЕРЦЕВОЮ НЕДОСТАТНЮТЮ
Нагорна О. О., Белешчев I. Ф., Горчакова Н. О., Мазур I. А., Чекман I. С.
Резюме. У щур1в при моделюванн1 хронпчноУ доксорубщиновоУ серцевоУ недостатност1 за загальноприйнятим методом протягом 14 днлв визначали вплив прямого ендотелюпротектора анполшу та непрямого - мельдоню на показники системи оксиду азоту в мюкардг Ангюлш вводили в доз1 100 мг/кг, мтдронат в доз1 250 мг/кг внутршньошлунково, паралельно з введенням доксорубщину. Щур1в виводили з експерименту на 35 добу пщ тюпенталовим наркозом. В мюкард1 щур1в при хрон1чн1й серцевм недостатност1 визначили пониження активност1 загальноУ NO-синтази, продукцИ стабтьних метаболтв оксиду азоту, вмю-ту L-аргiнiну та пщвищення р1вня ытротирозину. Спостер1галося зменшення щтьност1 позитивних кл1тин ендотел1альноУ NOS та пщвищення щтьнос^ ¡ндуцибельноУ NOS. Курсове введення анполшу пщвищуе активнють загальноУ NOS на 20%, вмют L-аргшшу на 14,7%, рiвень стабтьних метаболтв на 54,5%, щтьнють eNOS позитивних 1^тин на 17%. При цьому зменшуеться щтьнють iNOS-позитивних 1^тин на 17% та падае вмют ытротирозину в 2,2 рази. Мтдронат в дозi 250 мг/кг не мав достовiрного впливу на вищезазначеы бiохiмiчнi показники в мюкардг
^^40Bi слова: хроычна серцева недостатнють, ангюлш, мтдронат, показники системи оксиду азоту.
УДК 616.12-008.331.1:616-092.41-085:615.225.2:615:036.6
ВЛИЯНИЕ АНГИОЛИНА НА ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ ОКСИДА АЗОТА В МИОКАРДЕ КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ Нагорная Е. А., Беленичев И. Ф., Горчакова Н. А., Мазур И. А., Чекман И. С.
Резюме. У крыс при моделировании хронической доксорубициновой сердечной недостаточности общепринятым методом в течение 14 дней определяли влияние прямого эндотелиопротектора ангиолина и непрямого - мельдония на показатели системы оксида азота в миокарде. Ангиолин вводили в дозе
100 мг/кг милдронат в дозе 250 мг/кг внутрижелудочно параллельно с введением доксорубицина. Крыс выводили из эксперимента на 35 день под тиопенталовым наркозом. В миокарде крыс при хронической сердечной недостаточности установлено понижение активности общей NO-синтазы, продукции стабильных метаболитов оксида азота, содержания L-аргинина и повышение уровня нитротирозина. Наблюдалось уменьшение плотности позитивных клеток эндотелиальной NOS и повышение плотности позитивных клеток индуцибельной NOS. Курсовое введение ангиолина повышает активность общей NOS на 20%, содержание L-аргинина на 14,7%, уровень стабильных метаболитов на 54,5%, плотность еNOS-позитивных клеток на 17%. При этом уменьшается плотность iNOS-положительных клеток на 17% и падает содержание нитротирозина в 2,2 раза. Милдронат в дозе 250 мг/кг не имеет достоверного влияния на вышеуказанные биохимические показатели в миокарде.
Ключевые слова: хроническая сердечная недостаточность, ангиолин, милдронат, показатели системы оксида азота.
UDC 616.12-008.331.1:616-092.41-085:615.225.2:615:036.6
ANGIOLIN INFLUENCE ON THE NITRIC OXIDE SYSTEM MARKERS IN THE RATS' MYOCARDIUM WITH THE EXPERIMENTAL CHRONIC CARDIAC INSUFFICIENCY
Nagornaya E. A., Belenichev I. F., Gorchakova N. A., Mazur I. A., Chekman I. S.
Abstract. Cardiac insufficiency is accompanied by metabolite function changes and endothelial dysfunction. The endothelial dysfunction causes the disbalance between the vasodilators and vasoconstrictors. The nitric oxide is a vasodilator factor that is formed from the aminoacid L-arginin under the NO-synthase influence. Earlier it was shown the influence of the direct endothelioprotector angiolin and indirect endothelioprotector meldonium on the energetic, metabolism, prooxidant-antioxidant homeostasis in the rats' myocardium in the conditions of chronic cardiac insufficiency.
The aim of the study was to investigate angiolin influence on the nitric oxide system markers in the rats' myocardium with the experimental chronic cardiac insufficiency.
The material and methods of the research. The experiments were conducted on the 10 intact rats, 20 rats with doxorubicin cardiac insufficiency, 20 rats with doxorubicine cardiac insufficiency treated by angiolin, 20 rats with doxorubicine cardiac insufficiency treated by mildronat. The doxorubicin cardiac insufficiency has been created by intrapertonially doxorubicin injection (in the cumulative dose 15 mg/kg divided into 6 injections during 14 days). Angiolin was injected intragastrically together with doxorubicine in the dose 100 mg/kg. Mildronat also was injected intragastrically in the dose 250 mg/kg by the same scheme. The animals were decapitated under thiopentalum injection. In the rats hearts it was determined the markers of the nitric oxide system - the activity of the total NO-synthase, L-arginine, nitrothyrosine and stable metabolite levels, the density of eNOS positive cells, the density of iNOS positive cells.
The results of the research. In the conditions of cardiac insufficiency in the rats myocardium it was stated the decrease of L-arginine content on 52,3%, oxide nitric oxide metabolites on 58%, the density of eNOS positive cells on 53,2%. It was shown the increase of nitrothyrosine level on 193% and the density of iNOS positive cells on 98%. Angiolin injected during the course raised the density of eNOS positives cells on 17% stable no metabolites level on 54,5%, L-arginine content on 14,7%. Angiolin also diminished the nitrothyrosine level in 2,2 times, the density of iNOS positive cells on 30%. Mildronat hasn't the reliable influence on the markers of nitric oxide system in the rats' myocardium during cardiac insufficiency.
Conclusion. It was stated the angiolin normalize influence on the markers of the nitric oxide system in the rats' myocardium during the chronic cardiac insufficiency.
Keywords: chronic cardiac insufficiency, angiolin, mildronat, nitric oxide system markers.
Рецензент — проф. Костенко В. О.
Стаття надшшла 27.11.2016 року
