CC BY
232
8. Момот А.П. Патология гемостаза. — СПб.: Форма, 2006. — 221 с.
9. El-Sayed M.S. et al. Blood hemostasis in exercise and training // Med. Sci. Sports Exerc. — 2000. — Vol. 32, №5. — Р. 918— 925.
10. Commission of the European Communities, 86/609/ЕЕС, ISSN 03780 6978 (1986).
11. Mann K.G., Brummel-Ziedins K, Orfeo T. Models of blood coagulation // Blood Cells Mol. Dis. — 2006. — Vol. 36, № 2. — P. 108— 117.
Поступила 04.05.10.
THE EFFECT OF SHORT-TERM STRESS ON HEMOSTASIS IN RATS
I.I. Shakhmatov, V.I. Kiselev
Summary
In the studies on 128 rats it has been shown that activation of platelet aggregation and blood coagulation, anticoagulation and increased fibrinolytic activity are being recorded in most cases in response to a single short-term stressor effect. The most sensitive to stress was the contact phase of activation of plasma hemostasis.
Key words: short-term stress, adaptation, blood clotting, anticoagulant activity,
УДК 612.172:[612.08.085.2+612.66]
ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИНОТРОПНОГО ВЛИЯНИЯ СЕРОТОНИНА
НА МИОКАРД КРЫСЫ
Вадим Фаритович Ахметзянов2, Альфия Фаритовна Якупова3,
Разина Рамазановна Нигматуллина1
1 Кафедра нормальной физиологии (зав. — проф. А.Л. Зефиров) Казанского государственного медицинского университета, e-mail: razinar@mail.ru, 2 МУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи №1» (главврач — В. Г. Беляков), 3 МУЗ «Центральная городская клиническая больница № 18» (главврач — канд. мед. наук. Р.С. Бакиров), г. Казань
Реферат
Исследованы положительные и отрицательные инотропные эффекты серотонина в дозах 0,1, 1,0, 10,0 цМ на силу сокращения изолированных полосок миокарда правого предсердия и правого желудочка крыс в возрасте 3, 7, 14, 21, 49 и 100 дней.
Ключевые слова: серотонин, крыса, постнатальный онтогенез, инотропная реакция.
В последние годы значительное внимание уделяется влиянию серотонина (5-НТ, 5-hydroxytryptamini hydrochloride) на функционирование сердечно-сосудистой системы. Изучены молекулярные и клеточные механизмы синтеза [9], метаболизма [2] и взаимодействия с рецепторами [6, 17] 5-НТ. Доказано участие 5-НТ в эмбриогенезе сердца. На нокаутных мышах продемонстрировано, что дефицит 5-НТ в периоде внутриутробного развития приводит к гипоплазии трабекул миокарда, уменьшению размера кардиомиоцитов с последующей дилатацией камер сердца и прогрессирующей сердечной недостаточностью [15, 16]. Установлена роль 5-НТ в патогенезе многих заболеваний сердечно-сосудистой системы [3, 5]. Показана эффективность блокаторов 5-НТ2 рецепторов при артериальной гипертензии и
остром коронарном синдроме [10]. Таким образом, накоплено множество фактов о регуляторном влиянии 5-НТ на формирование сердечно-сосудистой системы. Однако малоизученным остается влияние 5-НТ на функцию сердца в различные периоды постнатального развития.
Цель настоящего исследования — оценить влияние серотонина на сократимость миокарда крыс в разные периоды постнатального онтогенеза.
В эксперименте на 130 крысах линии Вистар с помощью установки PowerLab и датчика силы MLT 050/D (ADInstruments, Австралия) определяли реакцию силы сокращения миокарда правого предсердия и желудочка в ответ на возрастающие концентрации серотонина (Sigma) — 0,1, 1,0 и 10,0 мкмоль/л. Крысы были подразделены на группы 3, 7, 14, 21, 49, 100-дневного возраста, в каждой по 10—18 особей. У предварительно наркотизированных уретаном (800 мг/кг) крыс извлекали сердце и помещали в чашку Петри с оксигенированным рабочим раствором при подключенном стимуляторе ЭЛС-2 (Россия) с частотой стимулов 6 в минуту, продолжительностью 5 мс и амплитудой
467
Таблица 1
Инотропная реакция (%) миокарда правого предсердия на серотонин в ностнатальном онтогенезе крыс
Возраст, дни n Группа Концентрация серотонина, мкмоль/л
0,1 1,0 10,0
3 18 О 37,6±6,02 60,77+9,15* 78,70+13,01**
5 К 0,19+0,09+ 5,29+2,40+ -4,89+1,78+
7 16 О 24,45±5,85 77,70+20,44* 108,58+18,50*** (n=12)
-11,79±1,14§ (n=4)
5 К 0,20+0,09+ 4,23+3,21+ -4,89+2,76+
14 14 О 70,39+12,3*** (n=10) 136,14+11,70***** (n=8) 155,39+14,80**** (n=6)
-6,64±0,94§ (n=4) -17,38±0,96§ (n=6) -28,13±8,36§ (n=8)
5 К 9,21+4,20+ 3,71+1,96+ 2,17+1,10+
21 18 О 27,02+6,02** (n=14) 128,63+12,32*** (n=12) 178,39+21,43*** (n=12)
-11,62±0,06§ (n=4) -43,95±6,04§ (n=6) -31,93±5,26§ (n=6)
5 К 2,24+1,02+ -4,20+1,25+ -10,40+4,20+
49 16 О 74,60+13,70** 268,09+27,30****** 432,50+32,60******
5 К 7,79+3,90+ -8,61+3,05+ -11,06+3,87+
100 18 О 98,34+28,00 183,13+57,43 334,37+35,8****
5 К 3,24+0,08+ 5,02+1,26+ 3,21+0,96+
О — основная группа; К — контрольная; п — количество крыс в группе; * р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001 — в сравнении с предыдущей возрастной группой; ф р<0,05; фф р<0,01; ффф р<0,001 — изменение реакции в сравнении с таковой на концентрацию 0,1 мкмоль/л; ф р<0,001 — в сравнении в контрольной и основной групп; § р<0,05 — в сравнении с контрольной группой. То же в табл. 2.
Таблица 2
Инотропная реакция (%) миокарда правого желудочка на серотонин в ностнатальном онтогенезе крыс
Возраст, дни n Группа Концентрация серотонина, мкмоль/л
0,1 1,0 10,0
3 12 О 20,47+2,47 47,28+5,40* 58,93+4,99*
5 К 2,54±0,55+++ -19,63+4,97+++ -25,20+8,25+++
7 12 О 49,65+6,64*** 93,17+10,51****** 131,95+14,16******
5 К 2,35±0,66+++ -1,24±0,12+++ -1,89±0,53+++
14 10 О 8,74+1,54*** 28,57+5,15****** (n=6) 44,29+4,91****** (n=6)
-26,81±4,15§ (n=4) -23,48±3,63§ (n=4)
5 К 3,29+1,86+ -1,04±0,22+++ -1,64±0,47+++
21 18 О 26,90+5,99** (n=14) 139,02±12,78******(n =12) 173,11±39,01*****(n=10)
-11,62±0,05§ (n=4) -44,00±5,42§ (n=6) -47,59±7,50§ (n=8)
5 К 0,08±0,02+++ -12,25+1,55+++ -18,50+2,97+++
49 14 О 47,88+7,17* 86,37+10,56***** 104,12+22,27*
5 К 6,95±2,77+++ 1,50±0,08+++ -10,05+4,21+++
100 18 О 69,93+14,73 131,58+21,90** (n=14) 206,96+48,86*** (n=12)
-6,46±0,39§ (n=4) -15,61±0,18§ (n=6)
5 К 6,43±2,78+++ 7,21±3,74+++ 5,21±3,23+++
сигнала 10 шУ. Из миокарда правого предсердия и желудочка препарировали полоски длиной 2—3 мм и диаметром 0,8—1 мм. Препараты фиксировали вертикально одним концом к датчику силы, другим — к опоре, после этого помещали их в отдельные резервуары объемом 25 мл, в которые подавали рабочий раствор температуры 280С и карбоген (95%
468
О2 и 5% СО2). Состав рабочего раствора (мкмоль/л): NaCl - 119,8, KCl - 5,4, CaCl2 -1,8, MgCl2 - 1,05, NaHPO4 - 0,42, аскорбиновая кислота - 0,28, глюкоза - 0,5. Для поддержания рН в пределах 7,3-7,4 в раствор добавляли основной и кислотный буферы Trizma (Sigma, США). Препараты миокарда стимулировали через платиновые электроды. Показатели фиксировали
500
400
300
200
100
о
3 дня
7 дней
% 200
tit.
(+!
№
10 0.) 1 ю
0,1 Í 10 0.1 1
49 дней 100 дней
Рис. 1. Инотропная реакция миокарда крыс при введении серотонина (%) в различные периоды постнатального онтогенеза (А — 3, 7 дней; Б — 14 дней; В — 21 дня; Г — 49 и 1GG дней).
Светлые столбцы обозначают реакцию предсердий, темные — желудочков; * р^^5 —между реакцией желудочков и предсердий.
при помощи программного обеспечения Chart 4.0. После погружения препаратов в резервуары выдерживался период приработки в течение 60 минут, в ходе которого добивались оптимального натяжения мышечных полосок. За оптимум принимали натяжение, после превышения которого начиналось снижение силы сокращения препарата. После этого регистрировали исходные параметры сокращения (5 минут), затем в течение 20 минут — реакцию на добавление в рабочий раствор 5-НТ в одной из концентраций 0,1, 1,0 или 10,0 мкмоль/л. В контрольной группе вместо 5-НТ применяли соответствующий объем 0,9% раствора NaCl. Контрольная группа использовалась для оценки жизнеспособности препаратов миокарда на протяжении эксперимента, а также для сравнения инотропных эффектов. Перед каждым увеличением концентрации серотонина препараты трехкратно промывали рабочим раствором в течение 5 минут. Реакцию силы сокращения в ответ на 5-НТ рассчитывали в процентах от исходного показателя (до введения 0,1 мкмоль/л 5-НТ). Учитывали максимальное изменение амплитуды сокращения за 20 минут. Статистическую обработ-
ку производили с определением М, ш и 8; достоверность различий рассчитывали по 1-критерию Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0,05.
Серотонин оказывал положительное инотропное действие на миокард правых предсердия и желудочка крыс 3, 7, 14, 21, 49 и 100-дневного возраста в большинстве наблюдений. В некоторых возрастных группах при действии различных концентраций серотонина у части крыс было выявлено снижение силы сокращения правых отделов миокарда (табл. 1, 2, рис. а, б, в, г). Реакции миокарда (положительный или отрицательный инотропный эффект) при действии каждой концентрации серотонина были однонаправленными.
Проведенные нами исследования впервые показали, что 5-НТ влияет на силу сокращения миокарда правых предсердия и желудочка крыс начиная с новорож-денности до половозрелого состояния.
Ранний молочный период у крыс (1—7-е сутки) характеризуется высокой скоростью линейного и объемного роста, первым удвоением массы тела [4]. 5-НТ оказывает положительный инотропный эффект на миокард предсердий и желудочков крыс 3- и 7-го дневного возраста. Примечатель-
469
а
в
б
г
но, что при введении G,1 мкмоль/л 5-НТ крысам в 3-дневном возрасте преобладала реакция предсердий, в 7-дневном — реакция желудочков. Различия реактивности предсердий и желудочков могут быть обусловлены особенностями функциональной нагрузки на миокард предсердий и желудочков во внутриутробном периоде и её перераспределением после рождения.
Показано, что в раннем постнаталь-ном периоде крыс адренергическая иннервация сердца незрелая и, несмотря на наличие в миокарде желудочков АР, при симпатической стимуляции положительный инотропный эффект не развивается до 14—21-го дня жизни [7, 14], хотя внутриклеточная концентрация цАМФ у новорожденных и взрослых крыс одинакова [11]. Мы предполагаем, что в данный период важным становится поддержание инотропной функции за счет иных, неадренергических, механизмов, в частности серотониновых. Кроме того, внутриклеточные механизмы при активации 5-НТ4 и ß-АР сходны и реализуются через аденилатциклазный механизм [1].
К 14-му дню жизни крыс наступает второе удвоение массы тела, открываются глаза и заметно повышается двигательная активность. Начинает «созревать» симпатическая иннервация; ее вклад в регуляцию сердечной деятельности возрастает, а активность серотониновой системы, наоборот, снижается. В данном исследовании мы продемонстрировали, что у 14-дневных крыс значительно снижается положительная инотропная реакция желудочков в ответ на добавление 5-НТ. При воздействии максимальной концентрации серотонина у 25% крыс еще в 7-дневном возрасте у миокарда правого предсердия и в 14-дневном возрасте (при меньшей концентрации серотонина) у миокарда правых предсердия и желудочка наблюдается отрицательный инотропный эффект. Установлено, что в регуляции сократимости миокарда млекопитающих принимаютучастиеметаботропные5-НТ2и 5-НТ4 рецепторы, эффект которых связан с активацией определенных субъединиц G-белков. Известно, что взаимодействие 5-НТ с рецепторами приводит к активации Gs, а также (в меньшей степени) — Gi белков [12]. Последнее снижает активность аденилатциклазы, уменьшает поступ-47G
ление Са2+ через L-тип ионных каналов. Снижение силы сокращения миокарда в ответ на введение серотонина может быть обусловлено активацией Gi белка. Отрицательный инотропный эффект 5-НТ у крыс достигает максимума в 21-дневном возрасте, к моменту полного становления симпатической иннервации.
Возраст 49 дней соответствует началу пубертатного периода у крыс и четвертому удвоению массы тела, что повышает требования к системе кровообращения. Происходят процессы физиологической гипертрофии миокарда, в развитии которой принимают участие АР и серотонино-вые рецепторы [14]. Возможно, именно в связи с этим наблюдается существенное увеличение чувствительности миокарда правого предсердия к 5-НТ. Для У миокарда желудочков также выявлен прирост реакции силы сокращения в ответ на введение 5-НТ, но значительно меньший, чем у предсердий. Согласно ещё неопубликованным результатам наших исследований, в 49-дневном возрасте у крыс наиболее выражена инотропная реакция желудочков в ответ на стимуляцию ß-АР добутамином.
Крысы 100-дневного возраста являются половозрелыми, и регуляция работы их внутренних органов становится сбалансированной. Достигают максимума масса миокарда и показатели насосной функции сердца [6]. У этих крыс обнаружено положительное инотропное действие 5-НТ на миокард. Реакция желудочков была максимальной по сравнению с таковой в предыдущих возрастных группах. Однако у части крыс сразу проявлялось отрицательное инотропное влияние серотонина на миокард правого желудочка: у 22% крыс в ответ на 5-НТ в концентрации 1,0 и у 33% — на 10,0 мкмоль/л, хотя при концентрации G,1 мкмоль/л эффект серотонина был положительным. Концентрация 5-НТ в сыворотке крови взрослых крыс составляла 14,7±1,97, в плазме — G,29±G,G7 мкмоль/л [15]. При действии 5-НТ в концентрации выше физиологической, вероятно, создаются условия для активации Gi-белка, экспрессия которого в миокарде повышается с возрастом [9].
Таким образом, серотонин оказывает положительное инотропное действие на миокард предсердий и желудочков крыс
в возрасте 3, 7, 14, 21, 49 и 100 дней, выраженность которого зависит от возраста животных. Отрицательный инотропный эффект серотонина, зависящий от его концентрации, выявлен в миокарде предсердий у крыс в возрасте 7, 14, 21 дня, а в миокарде желудочков — 14, 21, 100 дней жизни.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ахметзянов В.Ф., Нигматуллина Р.Р., Ахметзянова А.Ф., Латфуллин И.А. Положительное инотропное действие серотонина на сердце в постнатальном онтогенезе// Арх. клин. и экспер. мед. — 2004. — № 1—2. — С. 22—25.
2. Билич И.Л., Хамитов Х.С. Ацетилхолин и серотонин в норме и патологии желудочно-кишечного тракта. — Казань: Тат. кн. изд-во, 1977. — 142 с.
3. Кириллова В.В., Джорджикия Р.К., Нигматуллина Р.Р. Адренергическая и серотониновая регуляция сократимости миокарда пациентов с различными морфофункциональными изменениями сердца при хронической сердечной недостаточности//Бюлл. экспер. биол. и мед. — 2007. — Т. 144. — № 10. — С. 380—383.
4. Махинько В.И., Никитин В.Н. Константы роста и функциональные периоды развития в постнаталь-ной жизни белых крыс / Эволюция темпов индивидуального развития животных. — М.: Наука, 1977. — С. 249—266.
5. Мустафин А.А., Нигматуллина Р.Р., Миролю-бов Л.М. и др. Роль серотонинергической системы в формировании легочной артериальной гипертензии у детей с врожденными пороками сердца // Клин. физиол. кровообращения. — 2007. — № 2. — С.42—46.
6. Нигматуллина Р.Р., Земскова С.Н., Зефиров А.Л., Смирнов А.В. Клеточно-молекулярные механизмы функционирования и регуляции сердца. — Казань, 2004. — С.67—85.
7. Нигматуллина Р.Р. Регуляция сердечного выброса крыс, развивающихся в условиях различных двигательных режимов: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. — Казань, 1991. — 24 с.
8. Brodde O.E., Zerkowski H.R., Schranz D. et al. Age-dependent changes in the beta-adrenoceptor-G-protein(s)-adenylyl cyclase system in human right atrium// J. Cardiovasc. Pharmacol. — 1995. — № 26. — Р. 20—26.
9. Cote F., Fligny C., Fromes Y. Recent advances in understanding serotonin regulation of cardiovascular function // Trends in mol. Med. - 2004. - Vol. 10. - P.232-238.
10. Frishman W.H., Huberfeld S., Okin.S. et al. Serotonin and serotonin antagonism in cardiovascular and non-cardiovascular disease // J. Clin. Pharmacol. — 1995. — Vol. 35. - P. 541-572.
11. Hew K.W., Keller K.A. Postnatal anatomical and functional development of the heart: a species comparison // Birth. Defects Res. - 2003. - Vol. 68, № 4. - Р 309-320.
12. Kilts J.D., Gerhardt M.A., Richardson M.D. et al. p2-adrenergic and several other G-protein-coupled receptors in human atrial membranes activate both Gs and Gi // Circulation Research. - 2000. - № 87. - Р. 705-709.
13. Laer S., Remmers F., Scholz H. et al. Receptor mechanisms involved in the 5-HT-induced inotropic action in the rat isolated atrium // Br. J. Pharmacol. - 1998. -Vol. 123. - Р. 1182—1188.
14. Mackenzie E., Standen N. B. The postnatal development of adrenoreceptor responses in isolated papillary muscles from rat // Pflugers. Arch. - 1980. -Vol. 383. - P. 185-187.
15. Nebigil C.G., Hickel P., Messaddeq N. Ablation of serotonin 5-HT(2B) receptors in mice leads to abnormal cardiac structure and function // Circulation. -- 2001. -Vol. 103. - № 24. -P. 2973--2979.
16. Nebigil C.G., Choi D.S., Dierich A. Serotonin 2B receptor is required for heart development // Proc. natl. acad. sci. USA. - 2000. - Vol. 97. - № 17. - P.9508-9513.
17. Steinberg S.F. The molecular basis for distinct beta-adrenergic receptor subtype actions in cardiomyocyties // Circ. Res. - 2000. - Vol. 87. - P. 705-709.
Поступила 27.10.09.
AGE-RELATED FEATURES OF INOTROPIC EFFECT OF SEROTONIN ON RAT MYOCARDIUM
V.F. Akhmetzyanov, A.F. Yakupova, R.R. Nigmatullina
Summary
Studied were the positive and negative inotropic effects of serotonin at doses of 0.1, 1.0, 10.0 цМ on the force of contraction of isolated strips of myocardium of the right atrium and right ventricle of rats at the age of 3, 7, 14, 21, 49 and 100 days.
Key words: serotonin, rat, postnatal ontogenesis, inotropic response.
