CC BY
82
УДК 616.311.2-002: 616.314-76: 612.017.1
ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ИММУННОГО ГОМЕОСТАЗА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ДЕСНЫ В ОБЛАСТИ ПРОТЕЗНОГО ЛОЖА
Юрий Юрьевич Первое Владивостокский государственный медицинский университет
Реферат
Цель. Патогенетическое обоснование эффективности протезирования и прогнозирование результатов окклюзионной реабилитации пациентов на основе анализа иммунного гомеостаза слизистой оболочки полости рта. Изучение качественных и количественных характеристик иммунного гомеостаза слизистой оболочки полости рта в области протезного ложа.
Методы. Перед протезированием у 97 человек в возрасте от 25 до 85 лет проводилась биопсия слизистой об-лочки десны в области протезного ложа. Выполнялось иммуногистохимическое исследование материала с использованием антител к маркерам иммуных клеток CD68, CD204 и CD163. Для оценки регенерации эпителиального пласта определялась активность гена Ki-67 (индекс пролиферации).
Результаты. На основании полученных результатов построена модель иммунного гомеостаза протезного поля у практически здоровых пациентов различного возраста. Выявлена возрастная динамика морфологического субстрата, поддерживающего иммунный гомеостаз слизистой оболочки полости рта. Установлена корреляция митотического индекса и количественного состава иммунного аппарата слизистой оболочки полости рта.
Вывод. Клинически проявляющийся воспалительный процесс слизистой оболочки полости рта характеризуется изменением соотношения иммунокомпетентных клеток данной области и значительным повышением митотической активности кератиноцитов в рамках своей возрастной группы.
Ключевые слова: иммунный гомеостаз, слизистая оболочка протезного ложа, иммунофенотипирование, протезирование зубное, дендритные клетки.
AGE CHANGES IN IMMUNE HOMEOSTASIS OF THE GINGIVA MUCOSA IN PROSTHETIC BED AREA.
Yu.Yu. Pervov. Vladivostok State Medical University. Aim. To conduct a pathogenetic substantiation of the effectiveness of prostheses and predicting the results of occlusal rehabilitation of patients based on the analysis of immune homeostasis of the oral mucosa. To study the qualitative and quantitative characteristics of the immune homeostasis of the oral mucosa in the prosthetic bed area. Methods. Before prosthesis implantation in 97 people aged from 25 to 85 years conducted was a biopsy of the gingival mucosa in the prosthetic bed area. Performed was an immunohistochemical study of the material using antibodies to markers of immune cells CD68, CD204 and CD163. In order to assess regeneration of the epithelial layer determined was the activity of the gene Ki-67 (proliferation index). Results. Based on the obtained results proposed was a model of immune homeostasis of the prosthetic field in otherwise healthy patients of different ages. Revealed was the age dynamics of the morphological substrate that supports the immune homeostasis of the oral mucosa. Established was the correlation between the mitotic index and the quantitative composition of the immune apparatus of the oral mucosa. Conclusion. The clinically manifesting inflammation of the oral mucosa is characterized by the change in the ratio of immunocompetent cells of this area and by a significant increase in mitotic activity of keratinocytes within their age group. Key words: immune homeostasis, the mucous layer of the prosthetic bed, immunophenotyping, dental prosthesis, dendritic cells.
Известно, что слизистая оболочка является местом реализации пограничной иммунной защиты организма. Актуально изучение межклеточных взаимодействий иммунокомпетентных клеток, особенностей местного (локального) иммунитета, ассоциированного со слизистыми оболочками, а также их влияние на процессы пролиферации и апоптоза эпителиальных клеток.
В доступной литературе мы не встретили систематизированных данных о влиянии клеточных элементов собственной иммунной системы слизистой оболочки десны на пролиферацию кератиноцитов в условиях протезирования стоматологических больных различных возрастных групп.
Мнение авторов по поводу механического и контактного влияния на протезное ложе в зависимости от химического состава
*Автор для переписки: [email protected]
протезов неоднозначно. Одни считают, что это влияние отсутствует, другие связывают развитие воспалительных изменений слизистой оболочки протезного ложа с патологией других органов или механической травмой элементами протезов [1]. Ряд работ содержит убедительные доказательства, что любые протезы вызывают патологические изменения слизистой оболочки протезного ложа [4, 8].
Существуют способы определения биосовместимости организма с инородными материалами до и после протезирования пациента — клинические, визуальные, им-муногистохимические, рентгенофлюоресцентный анализ костной ткани, определение биоэлектромагнитной реактивности (БЭМР) [2, 3, 8]. При анализе иммунного гомеостаза слизистой оболочки полости рта (СОПР) исследуют специфические и неспецифические «факторы иммунитета» по следующим параметрам: реакция бластной
трансформации, уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови, аутоаллергическая повреждаемость нейтрофилов, реакция агломерации лейкоцитов, реакция торможения миграции лейкоцитов, фагоцитарный индекс, активность сывороточного лизоцима, сывороточный титр компонентов комплемента, миграционная активность лейкоцитов, общий и фракционный уровень белков сыворотки и т.д. [1, 6, 8]. Тем не менее существующие методы недостаточно специфичны и лишь косвенно указывают на изменения в иммунном аппарате слизистой оболочки полости рта в области протезного ложа.
Целью нашего исследования стало патогенетическое обоснование эффективности протезирования с прогнозированием результатов окклюзионной реабилитации пациентов на основе анализа иммунного гомеостаза слизистой оболочки полости рта, определение иммунного гомеостаза слизистых оболочек полости рта и его значение для выбора зубных протезов при протезировании.
В рамках этих исследований нами изучались качественные и количественные характеристики иммунного гомеостаза слизистой оболочки полости рта в области протезного ложа.
Было обследовано 97 человек в возрасте от 25 до 85 лет, которым планировалось изготовление пластиночных съемных протезов. Перед протезированием у них проводилась биопсия слизистой оболочки десны приблизительно в одно время, в 10 часов утра, со взятием образца размером 1х1 мм — во время удаления зубов либо их корней под проводниковой анестезией по строгим медицинским показаниям с целью санации полости рта. Поскольку показания к взятию биоптатов ограничены, делали ее только после предварительной беседы с пациентами и с их письменного согласия.
Идентификация иммунокомпетентных клеток производилась при помощи имму-ногистохимического (ИГХ) анализа, с учетом локализации антигена в клеточных структурах: мембранах, лизосомах, ядре, комплексе Гольджи. Биоптаты предварительно фиксировали в 10% формалине на фосфатном буфере рН 6,8 — 7,2 в течение 24 часов, затем промывали в проточной воде 2 часа и обезвоживали в спирте возрастающей концентрации в течение одного часа в каждой его порции. В спирте 96° выдерживали в течение 1, 2, 1 и 4 часов, а затем помеща-
554
ли в абсолютный спирт 5 раз по 30 минут и оставляли в последней порции на ночь. После этого материал погружали в смесь абсолютного спирта и ксилола в соотношении 1:1 на 0,5 часа и проводили в 3 сменах ксилола в термостате при 37° по 0,5 часа в каждой. Далее помещали образец в смесь ксилол/ парафин (1:1) при 56° по 20 минут в 2 порциях, а затем в 2 порциях парафина при 56° в течение одного часа в обеих порциях. После заливки парафиновые блоки выдерживали в течение суток в термостате при температуре 37°, а затем готовили срезы. Изготовление срезов и дальнейшая обработка материала (депарафинирование и обезвоживание) осу-ществлись на автоматизированной аппаратуре лаборатории патоморфологии медицинского университета Ниигаты (Япония) с использованием высокочувствительной системы для ИГХ реакций En Vision. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм монтировали на стекла, предварительно обработанные в течение 5 минут 0,01% раствором поли-л-лизина (0,01% Poly-l-Lizine solution, Sigma USA) и высушенные в термостате при 56°С в течение часа. После стандартной процедуры депарафинирования в толуолах и спирте срезы для восстановления антигенной структуры (демаскировки) подвергали термической обработке в специальном растворе (Target Retrieval Solution, DAKO, Denmark) на «водяной бане» при температуре 95 — 97°С в течение 30 минут. Затем стекла охлаждали до комнатной температуры, промывали 5 минут 3% раствором перекиси водорода для подавления эндогенной пероксидазы, промывали в 3 сменах 0,02 М фосфатного буфера рН 7,5 по 5 минут в каждой.
Часть препаратов была обработана с помощью микроволнового излучения, которое даёт лучший демаскировочный эффект, в течение получаса. Для демаскировки антигенов использовали 10 ммоль/л цитратного буфера, рН 6,0 или DАКО TRS (Target retrieval solution, œde № S 1700). Остывшие препараты промывали в дистиллированной воде. Использовали антитела в разведении 1:50 и 1:100. С помощью моноклональных антител — МКА (клон КР1, код № М 0814, лот 119) выявляли макрофаги по маркёру CD68 (высокогликозилированный трансмембранный гликопротеин, который локализуется в лизосомах). Белок CD68 относится к семейству лизосомальных гликопротеинов LGP, которые совместно с плазматическими мембранными белками (LAMP-1 и LAMP-2) играют роль в лизосомальном трафике и эн-
Таблица 1
Количественная характеристика клеток слизистой оболочки полости рта в области протезного ложа у практически здоровых лиц разных возрастных групп
Параметры иммунного фено-типирования До протезирования
CD163 активированные макрофаги предшественники ДК CD68 клетки Лангерганса CD204 предшествен- ники/ТК интраэпи- телиальные лимфоциты Ki-67 (митотический индекс)
До 30 лет 1,6±0,5** 1,0±0,06* 1,2±0,43 1,6±0,2 1,0±0,15 5.51±0,17
От 31 до 45 лет 1,8±0,07 1,2±0,16** 1,4±0,04 1,7±0,09 1,3±0,04* 5.79±0,2***
Старше 45 лет 1,5±0,3* 0,9±0,01 0,7±0,15** 1,4±0,03 0,8±0,02* 5,18±0,18
*p<0,05, **p<0,001, ***p<0,01. То же в табл. 2.
доцитозе. Для маркировки CD163 использовали клон 10 D6, класс иммуноглобулинов IgG1. Для выявления пролиферирующих клеток применяли первичные антитела к белку Ki-67 (DAKO, Denmark), инкубировали в течение 30 минут во влажной камере в термостате при 37оС, промывали в 3 сменах 0,02 М фосфатного буфера рН 7,5 по 5 минут в каждой. Наносили стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (Streptavidin Peroxidase Conjugated, DAKO, Denmark). Интенсивность окрашивания контролировали под микроскопом. После появления коричневого окрашивания срезы промывали в дистиллированной воде 5 минут, докрашивали гематоксилином, заключали в бальзам. Анализ окрашиваемых срезов производили на микроскопе Olympus ВХ51 c цифровой камерой CD25 и фирменным программным обеспечением.
Фон и неспецифическое окрашивание исключали строго соблюдая условия окрашивания — температуру, рН, время. Для
блокирования неспецифического окрашивания срезы в течение 20 минут инкубировали с неиммунной сывороткой, а уже затем — с первичными антителами. Для контроля и исключения артефактов при выполнении исследований часть препаратов обрабатывали дважды только неиммунной сывороткой. Подсчёт клеток иммунофагоцитарного звена производили в 100 полях зрения в 60
срезах. Подсчитывали общее количество иммуноцитов в поле зрения и анализировали степень их окрашивания.
Состояние СОПР, ее тканевой гомеостаз определяется балансом между вновь образующимися, существующими и погибающими клетками. Известно, что наиболее чувствительным индикатором пролиферативной активности клеток является активность гена Ю-67, свидетельствующего о необратимом вступлении клетки в митоз. Иммуногистохимическое определение белка Ю-67 позволяет вычислить митотический индекс — отношение клеток, находящихся в состоянии митоза (с окрашенными ядрами), к общему числу клеток. Этот показатель зависит от возраста и в норме для эпителия СОПР составляет 5 — 7%. На основании полученных результатов нами была составлена модель, характеризующая нормальное состояние иммунного гомеостаза протезного поля у практически здоровых пациентов различного возраста (табл. 1).
Объектом нашего исследования стал также материал, полученный у пациентов опытных групп с клиническими симптомами хронического катарального гингивита средней тяжести (табл. 2).
При анализе полученных результатов было выявлено значительное увеличение количества активированных макрофагов, тучных клеток, клеток Лангерганса, умень-
555
Таблица 2
Количественная характеристика клеток слизистой оболочки полости рта в области протезного ложа у лиц разных возрастных групп с клиническими симптомами катарального гингивита средней степени
Параметры иммунного фено-типирования До протезирования
CD163 активированные макрофаги предшественники ДК CD68 клетки Лангерганса CD204 предшествен- ники/ТК интраэпи- телиальные лимфоциты Ki-67 (мито-тичес-кий индекс)
До 30 лет 1,6±0,5** 1,0±0,06* 1,2±0,43 1,6±0,2 1,0±0,15 5.51±0,17
От 31 до 45 лет 1,8±0,07 1,2±0,16** 1,4±0,04 1,7±0,09 1,3±0,04* 5.79±0,2***
Старше 45 лет 1,5±0,3* 0,9±0,01 0,7±0,15** 1,4±0,03 0,8±0,02* 5,18±0,18
шение или такое же количество предшественников дендритных клеток, увеличение числа интраэпителиальных лимфоцитов. Данные изменения сопровождались значительным ростом митотического индекса, определяемому по отношению клеток, находящихся в состоянии митоза, к общему количеству клеток.
У пациентов контрольной группы (в норме) отмечалась связь между количественным составом клеток, обеспечивающих иммунный гомеостаз слизистой оболочки полости рта, регенераторным потенциалом эпителиоцитов слизистой оболочки десны и возрастом лиц, проходивших обследование. Прослеживалась четкая корреляция между морфологическим субстратом, поддерживающим иммунный гомеостаз СОПР, и регенераторной активностью кератино-цитов слизистой оболочки десны. Выявленные нами макрофаги, тучные клетки, дендритные клетки, клетки Лангерганса, интраэпителиальные лимфоциты, каждая из которых выполняет ряд функций и при этом поддерживает постоянство внутренней среды организма в целом, относятся к клеткам, обеспечивающим иммунный гомеостаз СОПР.
Известно, что дендритные клетки — это гетерогенная популяция антигенпрезен-тирующих клеток костномозгового происхождения. Основной функцией дендритных клеток является презентация антигенов Т-клеткам. Дендритные клетки также выполняют важные иммунорегуля-торные функции — контроль за дифферен-цировкой Т-лимфоцитов, регуляцию активации и супрессии иммунного ответа. Важной особенностью дендритных клеток выступает способность захватывать из окружающей среды различные антигены при помощи фагоцитоза, пиноцитоза и рецептор-опосре-дованного эндоцитоза. По данным литературы, больше всего дендритных клеток находится в тканях, которые соприкасаются с внешней средой, например в толще эпителиального слоя слизистой оболочки кишечника, в подслизистой респираторного, желудочно-кишечного и урогенитального трактов [10]. Наши исследования показали значительное увеличение числа клеток иммунофагоцитарного звена в слизистой оболочке десны в зоне протезного ложа в зависимости не только от возраста пациентов, но и от тяжести локального патологического процесса (р<0,01). Дендритные клетки поглощают антигены, процессируют и пред-
556
ставляют на своей поверхности в комплексе с МНС I или МНС II классов. Только в таком виде Т-клетки способны распознавать антиген и после этого активироваться и развивать иммунный ответ. В зависимости от типа патогена дендритные клетки способны направлять дифференцировку наивных Т-хелперов (1ЬО) в сторону Т-хелперов 1 и 2-го типов, регуляторных Т-клеток или же Т-хелперов [7, 9].
Несмотря на то что тучные клетки не являются иммунокомпетентными клетками, известно, что им принадлежит существенная роль в осуществлении аллергических реакций. Возникают тучные клетки гомопластически, предполагают их гетеро-пластическое происхождение из лейкоцитов, макрофагов и др. Этих клеток много в матке, тимусе, языке, желудочно-кишечном тракте, по ходу мелких кровеносных и лимфатических сосудов. Важнейшее свойство тучных клеток — высвобождение активных веществ, в том числе гистамина, при соединении антигена с фиксированными на их мембране молекулами ^Е [5]. Выделение гистамина приводит к констрикции гладких мышц, местному расширению сосудов, отеку, зуду, а в тяжелых случаях (анафилаксия) — к гипотонии и коллапсу. Наличие CD204+ клеток в слизистой оболочки десны и выявленная динамика клеток данного пула свидетельствуют о необходимости их медикаментозного ингибирования для улучшения как прогноза при использовании различных видов ортопедических конструкций, так и клинических симптомов, возникающих на фоне стоматологических вмешательств. С помощью ИГХ окрашивания на маркер CD163 выявлена и проанализирована динамика количественного состава макрофагов в слизистой оболочке десны в возрастном аспекте в контрольной и основной группах. Макрофаги являются одним из «орудий» врожденного иммунитета, а также наряду с В- и Т-лимфоцитами участвуют в приобретенном иммунном ответе, основная функция которых заключается в фагоцитозе и процессировании иммуногенов для представления Т-лимфоцитам. Все это дает основание для предположений, что прогнозируемая регуляция их количественного присутствия в слизистой оболочке десны может существенно влиять на процессы адаптации к зубным протезам. И это далеко не полный перечень «обязанностей» клеток, поддерживающих иммунный гомеостаз на местном уровне. Безусловно, все клиниче-
ские проявления в полости рта являются результатом их функционального и своевременного взаимодействия, что несомненно оказывает влияние и реализуется через регуляцию пролиферативных процессов в кера-тиноцитах слизистой оболочки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Амираев У.А. Состояние иммунитета у пациентов с непереносимостью к зубным протезам из разнородных сплавов металла // Совр. ортопед. стоматол. — 2009. — №11. — С. 43 — 45.
2. Амхадова М.А. Современные подходы к обследованию и оперативному лечению пациентов со значительной атрофией челюсти // Стоматология — 2005. — №1. — С. 41 — 42.
3. Вавилова Т., Сажина Е., Митронин А. Лабораторная оценка уровня цитокинов при воспалении периодонта у пациентов старших возрастных групп// Кафедра. — 2006. — Т. 5, №4. — С. 26 — 28.
4. Власова Л.Ф., Резникова Е.О. Зависимость реакции слизистой оболочки полости рта от физико-химической характеристики поверхности пластиночных протезов из акриловых пластмасс // Бюлл. экспер. биол. мед. — 2000. — №1. — С. 109 — 112.
5. Климин В.Г. Тучные клетки и гипоксия // Вестн. Уральской мед. акад. наук. — 2006. — №1. — С. 45 — 48.
6. Максимовский Ю.М., Чиркова Т.Д., Ульянова М.А. Особенности клеточного иммунитета при катаральном гингивите // Стоматология. — 2003. — №4. — С. 29 — 31.
7. Пейпл А.Д. Пластическая и реконструктивная хирургия лица. — М.: Бином, 2007. — 935с.
8. Радивоз М.И., Оскольский Г.И., Щеглов А.В, Стю-хин М.С. Характеристика местного и общего иммунитета при протезировании несъемными протезами// Дальневосточный мед. ж. — 2007. — №1. — С. 124 — 127.
9. Ueno H, Klechevsky E, Morita R. et al. Dendritic cell subsets in health and disease // Immunol. Rev. — 2007. — Vol. 219. — P. 118.
10. Huang MHS, Lee ST, Rajendran K. The structure of the musculus uvulae: functional and surgical implications of an anatomic study // Cleft Palate Craniofacial J. — 1997. — Vol. 34. — P. 466 — 474.
616.34-008.87-053.37: 615.37: 615.451.2
КОРРЕКЦИЯ ДИСБАКТЕРИОЗА У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА С ПОМОЩЬЮ ЖИДКИХ СИНБИОТИКОВ, СОДЕРЖАЩИХ БИФИДО-И ЛАКТОБАКТЕРИИ
Ольга Александровна Точилина1*, Ирина Александровна Частоедова2,
Юрий Александрович Поярков1
‘Кировская государственная медицинская академия,
2Московский университет государственного управления
Реферат
Цель. Оценка эффективности использования бифидо- и лактосодержащих жидких синбиотиков (бифидо-флорин и лактофлорин) по сравнению с пробиотиками бифидумбактерином и ациполом) для коррекции дисбактериоза у детей раннего возраста.
Методы. Биологическую чувствительность условно-патогенных бактерий к микроорганизмам-пробиотикам в составе исследуемых препаратов определяли диско-диффузным методом. У 44 детей из первично обследованных методом случайной выборки параллельно с анализом кала на дисбактериоз находили амилолитическую и щелоч-но-фосфатазную активность слюны и кишечника.
Результаты. Установлено, что антагонистическая активность штаммов микроорганизмов жидких синбио-тиков in vitro более высокая, чем у пробиотических препаратов. Жидкие синбиотики, как и пробиотические препараты, способствуют элиминации условно-патогенной микрофлоры и восстановлению уровня нормальных симбионтов, обеспечивая многофакторное регулирующее и стимулирующее воздействие.
Выводы. При использовании пробиотических препаратов и жидких синбиотиков для коррекции дисбактериоза необходимо не только учитывать результаты анализа кала на дисбактериоз, но и проводить оценку ферментовыделительной функции пищеварительного тракта, которая отражает динамику восстановления функциональной активности кишечной нормофлоры.
Ключевые слова: дисбактериоз (дисбиоз) кишечника, синбиотики, коррекция нарушенной микрофлоры.
DYSBACTERIOSIS CORRECTION IN YOUNG CHILDREN WITH LIQUID SYNBIOTICS, CONTAINING BIFIDUS AND LACTOBACILLUS. O.A. Tochilina‘, I.A. Chastoedova2, YuA. Poyarkov‘. ‘Kirovsk State Medical Academy, 2Moskovsky University of Government Administration. Aim. To evaluate the effectiveness of the use of bifidobacteria and lakto-containing liquid synbiotics (bifidoflorin and laktoflorin) in comparison with the probiotics (bifidumbakterin and atsipol) for the correction of dysbacteriosis in young children. Methods. The biological sensitivity of opportunistic bacteria to microorganisms-probiotics contained in the studied drugs was determined by disc-diffusion method. In 44 out of the initially examined children randomly a sample of amylolytic and alkaline phosphatase activity of the saliva and intestine was determined in parallel with the fecal analysis for dysbacteriosis. Results. Established was the fact that the antagonistic activity of liquid synbiotic microbial strains in vitro is higher than such of probiotic preparations. Liquid synbiotics, as well as the probiotic agents, contribute to the elimination of pathogenic microorganisms and the restoration of normal levels of symbionts, providing a multifactorial regulatory and stimulatory effect. Conclusions. During the use of probiotic
*Автор для переписки: [email protected]
